细胞壁和细胞膜蛋白质的分离与分级 结核分枝杆菌 用于下游蛋白质分析

摘要

本方案利用基于等电点的制备型等电聚焦电泳（IEF），将不溶性细胞壁和膜蛋白分离为简单的组分（每份含1-5个蛋白质），再按分子量进行分离。所得组分可直接用于免疫学和蛋白质组学分析，无需进一步纯化。

摘要

结核分枝杆菌的细胞壁和膜蛋白在结核病致病过程中起着核心作用。本研究通过制备型等电聚焦（IEF）和制备型十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）成功分离了这些蛋白，并结合凝胶洗脱技术，克服了传统方法在疏水性蛋白分离方面的局限性。在该实验流程中，将结核分枝杆菌（M. tuberculosis）菌落从罗氏斜面转移至2 mL 7H9液体培养基中，加入玻璃珠进行分散，于37 °C培养2周。随后将培养体系扩大至200 mL，在摇床中继续培养4周。进一步将培养体积扩大至1 L，加入500 mL 7H9培养基，再继续培养4周。培养后的分枝杆菌通过离心（1741 × g，30分钟）收集菌体沉淀。每2 g菌体沉淀加入1 mL裂解缓冲液，进行超声破碎。裂解液以3436 × g离心15分钟，去除未破碎的细胞，上清液被浓缩。此上清液（全细胞裂解物）以13751 × g离心30分钟，沉淀获得细胞壁蛋白。剩余上清液进一步在100,000 × g条件下超速离心4小时，以分离细胞膜与胞质组分。分离得到的细胞壁和膜蛋白在4 °C条件下加载至液相制备型IEF系统，以12 W恒功率电泳，直至电压稳定在1400 V，共分离出20个组分。这些IEF组分进一步通过制备型SDS-PAGE进行二次分离，并使用全胶洗脱装置在250 mA条件下洗脱蛋白，最终获得30个组分。通过本方案，我们成功鉴定了新的结核分枝杆菌细胞壁和膜特异性生物标志物，该方法亦有望用于其他病原体中类似蛋白的表征研究。

引言

免疫学研究表明，除了易于纯化的可溶性蛋白质外，人体对结核分枝杆菌（M. tuberculosis）等病原体的免疫反应还针对存在于结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）细胞壁¹和细胞膜中的疏水性蛋白质²。这些细胞壁和膜蛋白在抵御包括结核病在内的多种病原体的免疫调控中发挥着关键作用。其中一些蛋白质被报道为能够引发T细胞和B细胞免疫应答的优势抗原。相比之下，另一些蛋白质则被识别为病原体的分子特征，可被免疫细胞识别并启动固有免疫应答，例如病原体相关分子模式（PAMPs），从而触发免疫反应。例如，分枝杆菌脂蛋白LprG、LpqH、LprA和PhoS1可被Toll样受体2识别³。

细胞壁和膜蛋白的疏水性质在溶解和分离方面带来了重大的技术挑战。研究表明，膜蛋白约占所有生物体（包括分枝杆菌）编码区的20%至30%^4,5。由于其固有特性及技术上的困难，细胞壁和膜蛋白相较于可溶性蛋白更难溶解和分离。因此，目前仅报道了约2%的膜蛋白结构⁶。多个因素导致了这些蛋白分离的困难。主要挑战在于它们在细胞内的含量较低，这使得单个蛋白的分离及其后续表征变得复杂⁷。此外，这些蛋白容易发生聚集，进一步影响其溶解性。这一问题可通过添加去垢剂来促进溶解而得到改善。然而，某些蛋白即使在去垢剂存在的情况下仍可能形成聚集体，此时可使用变性剂和还原剂以提高其溶解性。

使用去垢剂进行增溶可能会干扰后续的分离方法。例如，带电荷的去垢剂不能用于离子交换色谱，而且所有去垢剂都可能破坏疏水相互作用色谱⁸。因此，选择与所用分离方法相容的去垢剂至关重要。在细胞壁和膜蛋白分离过程中的另一个重要步骤是去除用于增溶的去垢剂，因为这些去垢剂可能干扰后续对蛋白质的功能分析。

我们已开发出一种稳健的方法，可克服与膜蛋白分析相关的诸多挑战，特别是来自细胞壁和细胞膜的疏水性蛋白。研究这些蛋白的一个关键挑战在于其溶解性，由于其疏水特性，难以提取和分析。本文所述方法采用一种特别配制的等电聚焦（IEF）缓冲液，能够有效溶解细胞壁和细胞膜蛋白。该溶解步骤至关重要，因为它使得后续对这些疏水性蛋白的分析成为可能。

该方法的另一个优势在于能够降低蛋白质混合物的复杂性。通过采用两种互补的分离技术——基于蛋白质的等电点（pI）和分子量——该方法可高效地将细胞壁和细胞膜蛋白质分离为简化的组分。每个组分通常仅包含一至三种蛋白质，显著提高了分辨率，并有利于后续的表征分析。

本方法以结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）的细胞壁和细胞膜蛋白为模型系统开发，可有效应对疏水性蛋白在分离与分析过程中所面临的挑战。该方法为这些复杂蛋白组分的分离、纯化与表征提供了可靠的技术路径，显著提升了对其开展深入研究的能力。

方案

本研究遵循相关政府指南，并已获得机构科学咨询委员会和伦理委员会的批准。在采集样本前，已从研究对象处获得知情同意。

1. 培养 M. tuberculosis

1. 从罗氏斜面转移约10个结核分枝杆菌（M. tuberculosis）菌落至2 mL 7H9液体培养基中（将2.35 g Middlebrook 7H9肉汤基础溶解于400 mL蒸馏水中，加入50 mL油酸白蛋白葡萄糖催化酶（OADC）添加剂、0.5 g Tween 80，并定容至500 mL）
   注意：M. tuberculosis 属于3级风险病原体，必须在生物安全三级（BSL3）设施中的生物安全柜（BSC）内操作。必须使用适当个人防护装备（PPE）。
2. 在无菌条件下，使用玻璃珠在瓶式摇床中以15 rpm振荡1分钟，使细胞充分分散。
3. 将细菌悬液转移至麦氏瓶中含10 mL 7H9液体培养基的容器中，在37 °C、30 rpm条件下于摇床培养箱中培养2周。
4. 将对数生长期的培养物扩大至200 mL 7H9液体培养基中，在30 rpm条件下振荡培养4周。
5. 进一步将培养物转移至含500 mL 7H9液体培养基的1 L三角烧瓶中，在37 °C、30 rpm条件下振荡培养4周。
6. 以1741 g 离心30分钟，收集分枝杆菌。

2. 全细胞裂解液蛋白的制备

1. 按照标准方案对分离的细菌沉淀进行超声处理。
2. 配制裂解缓冲液，其成分为：20 mM Tris 加 8.5%（每 100 mL 含 8.5 g）NaCl。
3. 用浓盐酸调节最终 pH 至 7.4。
4. 向裂解缓冲液中加入新鲜配制的蛋白酶抑制剂，其终浓度如下（所添加蛋白酶抑制剂的具体信息见补充表 1）。
5. 每 2 g 细菌细胞沉淀使用 100 mL 紧密堆积体积并称重的M. tuberculosis杆菌，加入含溶菌酶的裂解缓冲液（1 mg/5 mL 细胞悬液）1 mL，并在 37 °C 轻柔搅拌孵育 15 分钟。
6. 将杆菌悬浮于两倍其体积的裂解缓冲液中。
7. 向缓冲液中加入 0.04%（wt/vol）叠氮化钠和 0.05% Tween 80。
8. 使用超声破碎仪在冰上对裂解缓冲液中的细菌细胞进行破碎，设置为工作周期 9 秒开启、9 秒关闭，持续 30 分钟，振幅 40%，以防止蛋白质变性。
9. 将制备的裂解液在 4 °C 条件下以 3438 g 离心 15 分钟，以去除未破碎的细胞。
10. 使用离心浓缩器（截留分子量 3 kDa，体积 5 mL）浓缩上清液。
11. 采用双辛可宁酸（BCA）蛋白定量法测定上清液中的蛋白浓度，以 BSA 蛋白作为标准品。
    注意：在 SDS-PAGE 分析中，每泳道上样 50 µg 蛋白进行分析。

3. 通过超速离心法分离细胞壁和细胞膜蛋白

1. 按照 Raja 等人⁹ 的方案，从全细胞裂解液中分离细胞壁、细胞膜和胞质蛋白，具体步骤如下。
2. 将全细胞裂解液在 4 °C 条件下以 13751 × g 离心 30 分钟，使细胞壁蛋白形成沉淀。
3. 将上清液在 4 °C 条件下用超速离心机以 100,000 × g 超速离心 4 小时，使细胞膜蛋白形成沉淀，胞质蛋白则保留在上清液中。
4. 使用 BCA 蛋白定量法测定细胞壁和细胞膜组分中的蛋白浓度。
   注意：在 SDS-PAGE 分析中，每泳道上样 50 µg 蛋白。分离得到的细胞壁和细胞膜蛋白样品储存于 -80 °C 冰箱中，待后续分析使用。

4. 制备型液相等电聚焦（Rotofor [等电聚焦装置]）

1. 在含有8 M尿素、1 mM DTT、5%甘油和2%皂苷的等电聚焦（IEF）缓冲液中溶解通过超速离心分离得到的细胞壁和细胞膜蛋白。
2. 加入2%两性电解质（pH 3.0至10.0与pH 4.0至6.0按1:4比例混合）。
3. 使用在4 °C条件下通过冷水浴维持温度的液相等电聚焦系统对溶解的蛋白质进行分级分离。
4. 按照制造商说明书进行等电聚焦分离，施加12 W恒定功率，直至电压稳定（介于1300 V至1600 V之间）。
5. 电压稳定后继续运行等电聚焦30分钟，总运行时间约为5至6小时。
6. 使用真空泵收集各个等电聚焦组分，并测定其pH值。
7. 将分离的组分（50 µg）进行SDS-PAGE电泳，并用考马斯亮蓝（CBB）或银染法显色蛋白质。将分离的等电聚焦组分储存于-80 °C冰箱中，待后续分析使用。

5. 制备型 SDS-PAGE 及整胶洗脱

1. 将等电聚焦分离的细胞壁和细胞膜组分与6倍SDS-PAGE上样缓冲液混合，于95 °C加热5分钟，随后进行SDS-PAGE分析。
2. 使用16 cm × 20 cm的聚丙烯酰胺凝胶（含12.5%分离胶和4%浓缩胶）在第二维中分离蛋白质组分。
3. 使用一个13 cm长的单一样品孔上样。
4. 以每块凝胶50 mA的恒定电流进行电泳，直至染料前沿迁移至凝胶底部。
5. 电泳结束后，将凝胶置于洗脱缓冲液（60 mM Tris，pH 9.4；40 mM 3-环己氨基-1-丙磺酸 [CAPS]）中平衡10分钟。
6. 按照仪器制造商的说明，将凝胶转移至整块凝胶洗脱装置中。
7. 以250 mA恒定电流运行洗脱装置1小时，从凝胶中洗脱蛋白质。
8. 使用真空泵从每块凝胶收集约30个蛋白质组分，每个组分体积为3 mL。
9. 采用BCA蛋白定量法测定洗脱组分中的蛋白浓度。
10. 取10 µg洗脱组分进行SDS-PAGE分析，并通过考马斯亮蓝（CBB）染色显影。
    注意：分离后整块凝胶洗脱的组分储存于-80 °C冰箱中，待进一步分析。

结果

通过高速超速离心法分离细胞壁和细胞膜蛋白
根据本方案所述方法，通过超速离心从完整细胞裂解液中分离细胞壁和细胞膜蛋白。图1展示了分离得到的亚细胞组分——细胞壁、细胞膜和胞质蛋白在M. tuberculosis中的SDS-PAGE分析结果。

通过制备型液相等电聚焦分离细胞壁蛋白
按照本方案所述方法，使用等电聚焦缓冲液溶解Mycobacterium tuberculosis的细胞壁蛋白。溶解后的蛋白根据其等电点被分离为20个组分。图2显示了经等电聚焦分离的细胞壁组分的pH分布。这些组分的SDS-PAGE分析结果，展示了各组分的蛋白质谱型，如图3所示。

通过制备型液相等电聚焦分离细胞膜蛋白
根据实验...

讨论

细胞壁和膜蛋白的疏水性质在其溶解和分离过程中带来了显著的实验挑战。在上述方案中，我们描述了一种基于双向电泳的新型分离方法，可有效分离这些疏水性蛋白。在本方案中，我们首先利用液相等电聚焦系统，根据膜蛋白和细胞壁蛋白的等电点进行初步分离。为解决溶解性问题，我们采用了高浓度的变性剂（尿素）和去垢剂（皂苷），这有助于这些蛋白的溶解，并可在初始分离过程中加载更高浓度的蛋白样品，而不会出现溶解问题。另一个优势在于，这些溶解助剂是等电聚焦分步分离所用缓冲液的组成部分，从而避免了蛋白样品的进一步稀释。

通过SDS-PAGE方法再次按分子量对IEF分离的组分进行分离。随后使用Tris-CAPS缓冲液，通过全胶洗脱装置将SDS-PAGE分离的蛋白质洗脱出来。该方法的一个关键优势在于，洗脱所得的组分无需额外纯化步骤，可直接用于免疫学和蛋白质组学分析。先前的一项研究¹⁰及我们早期的工作¹¹已证明，这些洗脱组分无毒，适用于直接进行免疫学检测。此外，我们此前已证实，这些组分可通过溶液内消化法进行基于质谱的蛋白质组学...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
7H9肉汤	Himedia	M198
40% Bio-Lyte 3/10 两性电解质	BIO-RAD	1631113
BCA蛋白定量试剂盒	MERCK	BCA1
Bio-Lyte 5/7 两性电解质	BIO-RAD	1631152
3 kDa 离心浓缩管	MERCK	Z629456
皂苷	MERCK	D141
脱氧核糖核酸酶（DNase）	MERCK	11284932001
二硫苏糖醇（DTT）	MERCK	D9779
乙二胺四乙酸（EDTA）	MERCK	E9884
乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸（EGTA）	MERCK	E3889
甘油	MERCK	G5516
亮抑蛋白酶肽（Leupeptin）	MERCK	E18
胃蛋白酶抑制剂A（Pepstatin A）	MERCK	P5318
苯甲基磺酰氟（PMSF）	MERCK	78830
核糖核酸酶（RNase）	MERCK	10109134001
Rotofor	BIO-RAD	170-2986	等电聚焦（IEF）装置
超声破碎仪	Vibra-Cell, Sonics	VC 750
N-α-对甲苯磺酰-L-赖氨酸氯甲基酮（TLCK）	MERCK	T7254
N-α-对甲苯磺酰-L-苯丙氨酸氯甲基酮（TPCK）	MERCK	4376
尿素	MERCK	U5378
Whole Gel Eluter 装置	BIO-RAD	1651250