用于空间转录组学分析的斑马鱼幼鱼切片空间紧凑排列

摘要

在这里，我们提出了一种对齐和冷冻切片多个斑马鱼 （Danio rerio） 幼虫样本并将它们收集在单个载玻片上以进行空间转录组学分析的方法。

摘要

空间转录组学技术是生物医学研究中的一种复杂工具，用于可视化空间注册的基因表达模式。使用空间成像平台对多个样品进行成像和分析可能成本高昂。如开发研究中所见，在多个实验条件下执行这些测试会进一步增加成本。为了降低成本，本研究试图优化用于发育研究的空间转录组标本排列的技术和策略。在这里，该研究利用了斑马鱼，斑马鱼是一种成熟的发育脊椎动物模型，在发育过程中是透明的，与人类具有 ~70% 的遗传同源性，并且具有高度注释的基因组，非常适合转录组学分析。由于斑马鱼体积小，发育中的斑马鱼还允许在多个生物重复中紧凑地放置连续切片。在此，我们报告了多重 原 位杂交空间成像平台成像区域内多个鱼样本的优化固定、冷冻切片和可靠对齐。使用这种方法，可以从至少 4 个不同的模具和多达 174 个切片中冷冻切片来自受精后 15 天 （dpf） 的斑马鱼，在 22 毫米 10.5 毫米的成像区域内收集（对于 原位 空间转录组载玻片），并同时处理。根据切片质量、样本对齐和每张载玻片的样本量，斑马鱼中的这种方法优化了空间转录组学技术的输出和每个样本的成本。

引言

评估组织中空间不同的表达模式对于我们理解基因组对发育、癌症和疾病的影响仍然至关重要 ^1,2,3。空间转录组学将多重表达技术与组织中表达的空间配准相结合。"空间转录组学"最早是由 Ståhl 及其同事⁴ 创造的，其中使用原位下一代测序探测安装的癌症标本。从那时起，"空间转录组学"就被用作高通量表达研究与空间配准相结合的统称。虽然这些工具很强大，但它们也是昂贵的工作，通常需要大量的机构投资和实验室成本才能生成数据⁵。在保留高质量数据的同时最大限度地降低成本的策略需求量很大。

斑马鱼 Danio rerio 已成为研究发育生物学的重要模型系统，并提供了一种在有限空间内增加脊椎动物整个器官（和生物体）分析的方法。斑马鱼很小（幼鱼 4-6 毫米，成虫 2-3 厘米），一次可以产下数百个透明卵⁶.斑马鱼胚胎在外部受精并迅速发育，使研究人员能够在发育的早期阶段引入转基因，以容易产生功能获得性和丧失性的等位基因⁷。在单个玻片上安装多个试样是一种降低成本的有吸引力的策略。它们的高繁殖力和小尺寸使斑马鱼成为多重空间转录组学测定的理想选择，这些分析对标本空间有限⁸。

斑马鱼幼虫冷冻切片是一项具有挑战性的技术。许多空间转录组学平台尚未针对斑马鱼石蜡切片进行优化，并且在将斑马鱼作为模式生物使用时需要冷冻切片，以保存组织结构和保留 RNA 转录本。此外，斑马鱼的小尺寸使得难以获得高质量的冷冻切片和有效分析多个样品。当处理斑马鱼幼虫时，这项任务变得更加困难，因为斑马鱼幼虫比成年斑马鱼幼虫更小、更脆弱。为了克服这些挑战，我们描述了一种方法，该方法可靠地对齐多个样品并有效地利用空间成像平台的成像区域，在单个载玻片上获得许多高质量的切片，然后可以通过空间成像平台进行成像和分析（图 1）。在这种情况下，该方法应用于空间转录组成像平台。

方案

该协议遵循达特茅斯学院机构动物护理和使用委员会的指导方针。

1. 准备低温恒温器

1. 将低温恒温器冷却至 -22 °C，并将碎屑刷入容器中，清洁低温恒温器的内表面。将所有必要的刷子和工具放入腔室内。

2. 准备一次性底模

1. 通过在基模内部画一条直线，准备一个用于样品对齐的基模（37 mm 24 mm 5 mm 一次性塑料模具），用永久记号笔作为样品对齐的参考点。在画线之前，在基模内侧的直线位置上放一块实验室胶带以获得最佳效果（图 2A）。
2. 在靠近左壁或右壁的基模内侧画一个点，以确保在冷冻切片过程中样品方向正确（图 2B）。
3. 用量角器测量所需的切割角度，并在每个样品的基模内侧标记（图 2C）。
4. 将一层浅层冷冻（光学相干断层扫描 [OCT]）培养基涂在准备好的基模上。确保有足够的冷冻培养基覆盖样品。
   1. 在涂抹冷冻介质时，通过灌注培养基瓶的喷嘴并在基模的一个角上添加必要量的介质，然后移动基模的水平面，使介质均匀分布在整个表面上，从而避免出现气泡。
   2. 分配冷冻培养基时，请缓慢挤压瓶子。
5. 将冰块加入 1 L 烧杯中，将装有冷冻培养基的基模放入冰浴中，孵育至少 10 分钟以冷却培养基。

3. 制备干冰:100% 乙醇浴

1. 在通风橱中将一份 100% 乙醇加入冰桶中的一份干冰中，在通风橱中制备干冰和 100% 乙醇浴。
2. 使用一次性铝盘或将铝箔折叠到足够大的船中，以容纳一次性底座模具。确保盘子或船足够大，以便底模完全平放。
3. 将盘子或船放入浴缸中，盖上桶盖。冷冻样品前，让桶冷却 5-10 分钟。

4. 对样本实施安乐死

1. 随机选择斑马鱼进行切片。如果样品大小不同，请按相对大小将它们分成几组，以便于准确对齐（有关详细信息，请参阅讨论）。将较大的鱼和较小的鱼放在不同的盘子中。
2. 在烧杯中装满鱼系水，然后将烧杯放入冰桶中。用冰块包围烧杯。
3. 用温度计监测水温。让温度稳定在 2-4 °C 之间。
4. 使用网或过滤器将一组鱼放入 4 °C 的水中。鱼应完全浸入水中，不要与冰接触。一旦鳃盖运动停止，向水中加入冰块以确保其保持在 4 °C 以下。 将鱼在 4 °C 水中放置 10 分钟。
   注:在对下一组安乐死样品实施安乐死之前，继续对每组安乐死样品进行包埋、对齐和快速冷冻。每次都要换水。

5. 嵌入和对齐

1. 将安乐死的鱼浸入 4 °C 水中 10 分钟后收集。用细尖镊子抓住尾鳍将鱼从水中捞出，然后用吸水、不起毛的湿巾轻轻按压擦干。
   注:对于高质量的切片，限制从 4 °C 水中去除鱼和快速冷冻之间的时间至关重要
2. 在立体显微镜（10 倍放大倍率）下，在冰浴中使用准备好的基模，沿参考点以正确的方向将每个样品放入基模中，然后用另一层薄薄的冷冻介质轻轻覆盖样品。
   注意:不要用冷冻介质填充整个模具。相反，只使用薄层，刚好足以覆盖所有样品。
3. 使用解剖参考点将鱼与基模内侧标记的线条精确对齐。使用细尖镊子调整每条鱼的方向，使它们对齐并处于相同的方向。缓慢移动，避免在冷冻介质中产生气泡。
4. 在样品下方的基模底部涂上一块干冰，直到它们局部冻结到位。保持基模的水平面，以避免样品在用干冰冻结到位之前从参考点移开。
5. 将装有样品的基模放在干冰:100% 乙醇浴中的铝舟或盘子上。确保船漂浮在浴槽表面，并且基模保持干燥。盖上浴槽，让样品漂浮 10 分钟。
6. 用箔纸包裹冷冻的底模并储存在 -80 °C 冰箱中，直到准备好切片。对任何剩余组重复步骤 4.2-5.6。

6. 冷冻切片

1. 将冷冻的基模带到预冷的低温恒温器中进行冷冻切片，然后将它们放入低温恒温器室中。将冷冻块放在装有干冰的盒子中运输，以防止解冻。
2. 从储存中取出 原位 空间成像载玻片，并将其放入预冷的载玻片架中。将带有空间成像载玻片的载玻片架存放在 -22 °C 低温恒温器室中，直到准备好从感兴趣区域收集切片。
3. 从基模中取出冷冻样品，然后在装有新鲜冷冻介质的卡盘中冷冻。将它们冷冻到卡盘上，使切割表面面向刀片。
4. 将新鲜、精细的切片机刀片放入低温恒温器中。
5. 将模具与刀片对齐并修剪感兴趣的区域（建议的修剪厚度 20-50 μm）。确保在模具内所做的标记转移到冷冻的样品块上，以帮助识别样品内的位置。
6. 在修整阶段调整模具，使切割表面与冷冻介质中的参考标记平行。
7. 将切片收集到带正电的标准显微镜载玻片上，并通过明场检查，以确认何时不再需要修剪。
8. 从低温恒温器室中取出空间成像载玻片，并将其置于 4 °C 冰浴中。将载玻片放在载玻片支架中。确保载玻片不会弄湿。
9. 开始冷冻切片（推荐 10-14 μm; 图 3）并将切片收集到带正电的载玻片上，直到达到样品中的感兴趣区域。按明场检查截面，以确认感兴趣区域将是模具的下一个截面。
10. 将单细胞空间成像载玻片带回低温恒温器室。从载玻片架上取下载玻片，并使用细尖画笔逐行将确切感兴趣区域的切片收集到空间成像载玻片上，以防止切片卷起。
    1. 用画笔的背面将空的冷冻介质的一角压入切刀台，以便在抓取载玻片进行收集时，该部分保持平坦。
    2. 以载玻片顶部为枢轴点，慢慢将载玻片降低到切片上，让切片粘附在载玻片上 3 秒，然后将载玻片从载刀台上提起。
    3. 在载玻片的成像区域收集切片时，从左到右工作，并尽可能重叠空的冷冻介质层。
    4. 如果组织难以看清，请使用彩色纸张边框作为参考，将切片放置在载玻片的成像区域内。
11. 从感兴趣区域收集切片后，将玻片放回玻片支架中。如果没有更多样品需要收集到空间成像载玻片上，请将载玻片在 -80 °C 下储存长达 2 周，直到它准备好使用 原位 空间成像平台进行仪器分析。如果需要从多个模具中收集切片，请将空间成像载玻片放回 4 °C 冰浴中，然后对下一个模具重复步骤 6.3-6.11。
12. 在标准带正电荷的显微镜载玻片上从每个模具收集感兴趣区域的切片之前和之后，进行苏木精和伊红 （HE） 染色，以检查样品对齐和切片质量是否足够，然后再进行分析。

7. 固定样品

1. 从低温恒温器中取出参比载玻片，并在室温下风干 30 分钟，以将切片粘附在载玻片上。
2. 通过将切片放入含有 4% 多聚甲醛（表 1）的载玻片容器中 20 分钟来固定切片。
3. 将切片放入装有蒸馏水的载玻片容器中 3 分钟，洗涤切片。
4. 继续进行 HE 染色或干燥，并将载玻片储存在 -80 °C 以备将来染色。

8. 切片的 HE 染色

1. 通过将载玻片在 100% 乙醇中孵育 2 分钟，在 95%（表 2）乙醇中孵育 2 分钟，然后用自来水孵育 1 分钟来脱水和清洁切片。使用显微镜载玻片染色架将载玻片从一个浴转移到另一个浴。
2. 通过将载玻片在苏木精中孵育 2 分钟 45 秒、自来水 1 分钟、0.3% 酸化酒精（表 3）1 分钟，然后用自来水运行 1 分钟来染色和区分。使用显微镜载玻片染色架将载玻片从一个浴转移到另一个浴。
3. 将载玻片在 1% 曙红 Y 中孵育 45 秒，50% 乙醇（表 4）孵育 1 分钟，95% 乙醇 1 分钟，100% 乙醇 1 分钟，将载玻片细胞质成分染色并脱水。使用显微镜载玻片染色架将载玻片从一个浴转移到另一个浴。
4. 通过将载玻片在二甲苯中孵育 1 分钟来清除切片。用移液管将一滴封固剂滴在载玻片的顶部三分之一处，然后用镊子慢慢降低封固剂顶部的盖玻片，以安装并覆盖载玻片。

9. 切片的空间转录组成像和分析

1. 从 -80 °C 储存中取出成像载玻片，并使用 原位 空间成像平台进行空间转录组学分析。
   注意:成像中涉及的确切步骤将由空间成像平台决定。
2. 查看空间转录组学平台的质量控制指标。需要检查的重要指标是检测到的细胞数量、每个细胞的中位转录本、每 100 μm² 的核转录本以及探针集中每个基因的高质量解码转录本总数。
   注意:这些质量控制指标没有通用阈值，对这些阈值的期望会因所使用的样本和基因面板而异。
3. 读取可检测 RNA 转录本的数据输出，根据实验的质量控制指标确定哪些转录本质量低，并过滤掉低质量转录本。分析与本节中的空间排列相关的其余高质量转录本。
4. 根据实验兴趣查看切片和聚类细胞的细胞分割。在同一张载玻片上比较不同年龄斑马鱼组感兴趣区域细胞簇内的 RNA 转录物。

结果

在这种方法中（图 1），斑马鱼被用作动物模型来探测空间分辨的基因表达模式。有效地冷冻切片斑马鱼幼虫以进行空间成像具有挑战性。切片必须具有高质量，以保留组织结构和可检测基因（图 4）。包含多个样品的切片必须精确对齐以实现空间高效成像，以分析所有样品中的感兴趣区域（图 2 和图 5）。最后，必须有效地收集切片并间隔，以最大限度地提高空间转录组学载玻片成像区域内潜在数据点的数量（图 3 和图 6）。使用这三个参数对实验进行测量，以确定它们是成功的还是次优的。

许多协议修改有助于我们收集高质量的切片，这些切片是空间转录组成像的良好候选者。调整安乐死、固定和嵌入的方案以提高切片质量（

讨论

本报告为开发过程中与斑马鱼作为模式生物在空间转录组学分析中相关的许多技术挑战提供了详细的解决方案。为了应对这些挑战，我们紧凑的标本布置优化了新兴空间转录组学平台的成本¹。对斑马鱼幼虫进行冷冻切片以进行空间成像具有挑战性。切片应保留足够的组织结构和转录质量，以便进行令人满意的实验执行和下游空间分析⁸。对于空间高效成像，包含多个样品的切片必须精确对齐，以分析所有样品中的常见感兴趣区域。最后，必须有效地收集切片并间隔，以最大限度地提高成像载玻片指定区域内潜在数据点的数量。

该协议允许收集高质量的切片，这些切片是单细胞空间成像平台的绝佳候选者。第一种修改是将斑马鱼快速冷冻，然后在将切片收集到载玻片上后，将它们固定在 4% 多聚甲醛中。最初，斑马鱼在 4 °C 下用 4% 多聚甲醛固定过夜，然后包埋和切片¹¹。选择在切片后固定样品有助于保留固定整个样品时未有效保存的内部组织（

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 L 烧杯	Pyrex	1003
200 度纯乙醇	Koptec	V1001
醋酸、冰川	VWR	0714	酸化酒精
铝箔
盖玻片	Epredia	24X50-1.5-001G
一次性底座模具	Fisher HealthCare	22-363-556
蒸馏水
DPX 封片剂	Sigma-Aldrich	06522	组织学封片剂
干冰丸
Dumont #5SF 镊子	精细科学工具	11252-00
曙红-Y 酒精	Epredia	71204	曙红 Y 1%
鳃 1 苏木精	Epredia	72411	苏木精
Kimwipe	Kimberly-Clark Professional	34120	吸水、不起毛擦拭
实验室标签胶带	VWR	89097-934
切片机刀片 MX35 Ultra	Epredia	3053835
切片机 低温恒温器	Thermo Scientific	Microme HM 525
OCT 化合物	Fisher HealthCare	23-730-571	冷冻培养基
多聚甲醛	Sigma-Aldrich	158127	PFA
永久记号笔	VWR	52877-886
量角器
SafeClear 二甲苯替代品	Fisherbrand	68551-16-6	二甲苯替代品
单边刀片	American Line	66-0407
立体显微镜	蔡司	4350639000	Stemi 305 带双点 LED （4355259020） 和支架 K 实验室 （4354259010）
Superfrost Plus 微型载玻片	VWR	48311-703
移液管
Xenium V1 载玻片	10X/Xenium	3000941	空间转录组成像载玻片