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原位 分离与培养难培养土壤细菌的分离芯片（iChip）方法

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DOI：

10.3791/67692

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2025年8月6日

 ,  , ADSB-2024 Participant Cohort,  , 
1Department of Bioscience and Bioengineering, Indian Institute of Technology-Jodhpur, 2Department of Microbiology, Molecular Genetics, and Immunology, University of Kansas Medical Center

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案描述了一种分离芯片（iChip）的设计与使用方法，用于 原位 在其自然环境中培养顽固性土壤微生物。同时还描述了 原位 抗微生物物质产生菌的土壤细菌培养。该方案可经调整用于从不同生态位中分离具有其他理想特性的细菌。

摘要

生态系统蕴藏着数以百万计的环境微生物，其中一些能够产生具有生物技术应用价值的产物，如酶、维生素、氨基酸、有机酸、抗寄生虫剂和抗菌剂。大多数这类环境细菌被认为是“不可培养的”，因为实验室培养方法无法满足其营养或环境需求。此外，由于它们在自然界中与其他微生物共存，可能依赖于微生物群落中其他成员所产生的营养物质或代谢物。将这些“未培养”微生物的多样性引入培养体系，将为我们探索其可能编码的大量生物活性产物提供机会。本文介绍了iChip技术的应用，这是一种为高通量筛选设计的多通道扩散室， 原位 培养“不可培养”细菌。鉴于抗菌药物耐药性已成为全球性威胁，本文提供了一种详细的实验方案 原位 从可产生抗菌物质的微生物“暗物质”中培养和分离菌株的示例。本方案详细描述了从土壤样品采集到菌株分离的各个步骤，并强调了可能影响分离成功率的潜在因素。该技术的应用不仅有助于分离传统上“不可培养”的细菌以用于抗生素发现，还使研究人员能够深入探究复杂的土壤生态，进而为多种其他应用提供资源。

引言

在土壤、水体和极端环境等自然环境中，存在着大量尚未被探索的微生物资源库。然而，要利用这些丰富的微生物生物多样性十分困难，因为大多数微生物无法通过传统的实验室培养基和方法轻松培养。这种现象被称为“巨大平板计数异常”，它揭示了显微镜下可直接观察到的微生物数量与在培养基上能够生长的微生物数量之间存在显著差异1。克服这一障碍并获取不可培养微生物及其产物的多样性，可能有助于满足多种生物技术需求。

例如，抗菌药物耐药性的发展已成为全球公共卫生的重大威胁。主要制药公司对抗微生物新药研发的兴趣不高，导致新型抗微生物药物的发现速度远低于现有抗生素耐药性的出现速度2,3。因此，迫切需要发现新型抗微生物药物4。由于微生物群落在共同进化或竞争过程中已长期共存5，它们具备产生新型化合物的潜力，以提高自身的生存机会。环境微生物及其代谢产物具有极高的多样性，但尚未被充分挖掘，因为传统的基于实验室培养的方法往往只能分离出相似且已知的微生物。这是因为常规培养基和培养方法倾向于培养与人类相关的微生物，无法模拟自然生态环境。设计用于培养环境微生物的培养基具有挑战性，因为某些微生物的生长可能依赖多种营养物质——这些物质通常由周围其他微生物产生——并需要特定的环境条件。

为解决这一问题并培养环境微生物 原位，扩散室最初被开发6扩散室是一个不锈钢O形环。将含有适当稀释样品的琼脂填充至环内空间，然后用聚碳酸酯膜密封环的顶部和底部，该膜允许土壤来源的营养物质和代谢物扩散，同时防止其他微生物进入室内6接种后，将培养板置于样品采集环境中以进行培养 原位扩散室具有很高的效率，成功培养出大量此前难以培养的微生物。然而，使用O形圈与琼脂的设计操作繁琐且通量较低，仍为后续技术创新留下了待解决的问题空间。6不久之后，一种能够 原位 培养并同时高通量回收纯培养物的设计7该设计在概念上与扩散室相同，但由多个通道组成，每个通道作为一个独立的扩散室，可实现从每个腔室中回收单个微菌落8扩散室设计的重新构想极大地提高了该技术的通量，并实现了从土壤和海水样本中分离和培养更丰富的生物分类群多样性。9，温泉10等。Teixobactin 是一种最近报道的抗生素，其发现基于上述技术11它展现出一种新颖的抗菌作用机制，被发现对引起侵入性感染的病原体具有致死作用，表明利用该技术可高效简化从微生物“暗物质”中高通量分离微生物的过程，从而促进与生物技术相关的天然产物的发现。12.

本文作为程序指南，旨在有效实施这项高通量技术 原位 从土壤微生物“暗物质”中培养和回收产抗菌物质的难培养细菌。该方案概述了分离芯片的设计、样品采集、样品制备、接种、培养和回收过程。尽管本方案所展示的方法 原位 从土壤中培养微生物，该方法可轻松适用于 原位 从任何环境中培养微生物。该技术的高通量能力有望提高发现新微生物的几率，并利用其生物合成潜力用于多种生物技术应用。

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方案

1. 设计与3D打印

  1. 根据样本类型、每个扩散室的体积、所用膜的尺寸以及所需的通量（扩散室数量）来选择设计和尺寸。
    注意：中间板的厚度和每个通道的直径决定了每个圆柱形扩散室的体积。尺寸取决于需容纳的独立扩散室数量，而膜的尺寸则直接取决于所覆盖的扩散室数量（图1）。
  2. 在任意演示文稿软件中使用插入图形功能，插入具有所需尺寸的圆形以作为iChip。在大圆内插入较小的圆形以表示通道。将这些小圆按所需排列方式布置，以初步设计顶板/底板和中间板的结构。选中设计后，通过右键菜单将其另存为图片。
  3. 以初步设计为模板，开始使用计算机辅助设计（CAD）软件创建二维（2D）设计。
    1. 从草图菜单中插入预定义形状，主要为圆形，以构建板和通道阵列的基本设计。
    2. 使用尺寸标注功能设定板和通道的实际尺寸。点击确定完成设计，然后使用拉伸功能将2D设计转换为具有指定厚度的三维（3D）模型。
    3. 最后，通过文件菜单中的保存功能，将3D模型保存为适用于3D打印的立体光刻（STL）文件格式。
  4. 根据预期应用选择打印材料，考虑因素包括首选的灭菌方法和埋植地点。例如，若需高压灭菌或将在高温环境中埋植，则应选择耐高温材料。
    注意：本实验采用类陶瓷材料进行3D打印，该材料可耐受高达268 °C的温度，因此可进行高压灭菌。
  5. 根据尺寸（细节和分辨率）及所用材料选择合适的3D打印方法。
    注意：采用立体光刻技术（一种增材制造方法）进行3D打印，可通过紫外（UV）激光固化热固性树脂来构建复杂结构。立体光刻适用于多种材料，并可实现优异的表面光洁度和高精度分辨率。

2. 土壤样品采集

  1. 从任意移动应用商店下载并安装一款地理编码移动应用程序，该应用程序可通过为全球范围内的3米×3米区域提供唯一的三词地址来确定位置。确定用于土壤采样的采样点，然后打开地理编码移动应用程序，识别目标区域及其唯一的三词地址。
  2. 记录该唯一的三词地址、日期、时间、计划采样的深度、天气状况、附近的动植物情况、采样点的暴露状况以及采样点的温度（地表及目标深度的地下温度）。
    注意：土壤可能含有致病性细菌。因此，应使用适当的个人防护装备（如手套、实验服等），并遵循生物安全二级（BSL-2）相应的操作规范。尽量减少接触以防止样品污染和人员暴露。在处理土壤样品前后，应对工作台面进行消毒。
  3. 使用70%乙醇喷洒铁锹表面并擦拭干净，以对其进行去污处理。同样，使用70%乙醇喷洒用于收集土壤的聚苯乙烯盒，并擦拭干净以进行去污。待残留乙醇完全挥发干燥后，再进行后续操作。
    注意：尽管本实验方案使用聚苯乙烯盒来采集样品并进行培养，但也可根据需要选用玻璃或金属容器等替代方案。
  4. 清除地表的植物材料、落叶和/或石块，以暴露表层土壤。再次按照前述方法对铁锹进行去污处理，清除表层土后，评估地下3–6英寸深度的土壤状况。使用尺子从地表起测量深度。利用表面已灭菌的铁锹，从目标深度采集4–5 kg土壤至聚苯乙烯盒中。
  5. 用盒盖将容器密封。若需采集多个样品，应在两个采样点之间对铁锹进行去污处理，以避免交叉污染。所有样品采集完成后，应立即将样品运送回实验室。

3. 接种样品的制备

  1. 从采集的土壤样品中，称取1 g无碎屑、石块和枯枝落叶的土壤，放入含有10 mL无菌生理盐水的无菌50 mL离心管中。
    注意：将部分土壤样品以甘油冻存液的形式保存于-80 °C ，以保留原始微生物群落，供将来使用13,14。
  2. 通过涡旋振荡约10秒，使土壤与生理盐水充分混合，形成土壤悬浊液。将离心管静置5分钟，使管中较大的土壤颗粒沉降。随后，小心地将上清液转移至一支新标记为 "S" 的试管中。
  3. 以上述土壤悬液作为未稀释样品，取1 mL样品加入含有9 mL无菌生理盐水的新试管中，进行系列稀释。制备10-1至10-5的稀释梯度。
    注意：将稀释后的土壤悬液涂布于非选择性培养基上进行菌落计数，可初步估算样品中细菌的密度，从而帮助选择合适的接种稀释度。但需注意，该数值仅反映样品中可培养细菌的大致数量。

4. 接种与组装

  1. 在生物安全柜内，将顶板、底板和中板浸入70%乙醇中10分钟进行表面去污染。用无菌去离子水冲洗掉多余的乙醇，并将板材置于无菌培养皿中晾干。
  2. 将中间平板置于无菌培养皿中，备用接种。随后，将SMS琼脂培养基用微波炉融化，冷却至45 °C，取22.5 mL SMS琼脂转移至50 mL离心管中。
  3. 加入2.5 mL适当稀释的土壤样品，轻轻倒置充分混匀，避免引入气泡。
    注意：选择合适的稀释比例进行接种。以达到与10中的最终接种密度相同的效果-4 稀释，选择10-3 因为接种所用培养基会将样品再稀释10倍，所以此时为悬液状态。
    1. 选择适当的接种稀释度，使每个腔室固定1个细胞，从而使其发育成单个克隆 原位.
      注意：也可使用蒸馏水代替 SMS 培养基以模拟土壤环境，从而允许仅在该条件下生长的微生物生长。必要时，可在播种培养基中添加抗真菌剂（如放线菌酮），以抑制真菌生长。
  4. 缓慢地将3-4 mL接种过的SMS琼脂培养基倒入中间平板，覆盖整个表面。静置约5-10分钟，使SMS琼脂培养基凝固。检查琼脂是否已完全凝固。随后，用无菌刀片刮去平板表面多余的SMS琼脂，仅保留各个扩散室内的琼脂小块。
  5. 移除一张0.03 µm聚碳酸酯膜滤膜的保护衬片后，用无菌镊子小心地将其放置在顶板内侧。然后，用无菌镊子将另一张0.03 µm聚碳酸酯膜滤膜放置在已接种的中板暴露面上。
  6. 将顶板和底板与中间板及聚碳酸酯膜一起夹紧，注意对齐各板的螺丝孔，以完成组装（图1B）。拧紧螺母和螺栓以固定组件。
    注意：建议同时组装一个仅含无菌SMS琼脂但不接种的对照iChip，并与接种后的iChip一同埋入土壤中，以验证密封性。此举可排除环境中微生物侵入的可能性，并作为阴性对照。

5. 原位 培养与回收

  1. 在聚苯乙烯盒中采集的土壤内，使用无菌铲子挖出一个比iChip尺寸更大的凹坑。将组件垂直植入凹坑中，并用土壤紧密填埋，确保所有表面均被完全覆盖。然后让其 原位 培养2至4周，根据所需时间进行。在孵育期间，定期使用无菌蒸馏水润湿土壤，以防止扩散室中接种的SMS琼脂块干燥。
    注意：将装置垂直放置可防止在常规土壤湿润过程中水分持续渗入扩散室，而水平放置时可能发生此类渗漏。
  2. 在完成所需的孵育后，轻轻松动植入的iChip周围的土壤以回收iChip。随后用无菌生理盐水清洗，去除附着的土壤颗粒，并将其转移至生物安全柜中进行后续处理。
  3. 拆下组件上的螺母和螺栓，然后小心拆解。使用无菌镊子取出聚碳酸酯膜，并将中间板转移至准备好的培养皿中。
  4. 使用无菌木制涂布棒从每个扩散室中取出单独的琼脂小块。将琼脂小块接种至适当的培养基中，如SMS琼脂或0.1x胰蛋白胨大豆肉汤琼脂，以尝试实验室培养。
    注意：可通过常规方法（如琼脂覆盖法）对培养获得的分离株进行抗菌物质产生的筛选15.
  5. 或者，对回收的含有琼脂块进行染色并成像 原位 培养难培养的土壤细菌以确认微菌落在以下条件下的生长 原位 条件。
    注意：为了提高检测灵敏度，可使用能够染色细菌的荧光染料对研碎的琼脂块进行染色，随后进行荧光显微镜观察。

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结果

本方案中使用的iChip是按照所示方式设计、3D打印并组装的 图1本方案的概述如图所示 图2实验所用土壤样品采自印度拉贾斯坦邦焦特布尔印度理工学院校园内。该地点的唯一三词地址为“communicate.supervising.recurrence”。所选地点为半干旱地区，温度为 40 °C 采样当天。土壤样品于夏季中期采集。样品在6-7英寸深度无菌采集，地下温度为 35 °C 放入无菌聚苯乙烯盒中，并在采集后24小时内送至实验室进行处理。随后进行系列稀释，并接种于胰蛋白胨大豆琼脂培养基上，以确定合适的稀释度。该土壤的可培养微生物密度为8 × 106 CFU/g 土壤。10-3 土壤悬液的稀释液含有约 8 x 102 CFU/mL，选择此浓度用于接种。2周后 原位 孵育后，我们能够从0.1x胰蛋白胨大豆肉汤琼脂的琼脂块中回收到多个分离株。将从琼脂块中生长出的分离株在0.1x胰蛋白胨大豆肉汤琼脂上划线培养，以获...

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讨论

地球上众多独特的生境孕育了各具特色的微生物群落，展现出巨大的多样性。然而，由于难以提供适合其生长的培养条件，这一多样性至今仍未被充分探索。某些细菌依赖其他微生物释放的代谢产物才能存活，因此无法在实验室条件下独立生长。此外，细菌在调控生物地球化学循环中发挥着关键作用，而这些过程在实验室环境中难以模拟。大部分微生物多样性及其所编码的新型化学结构存在于不可培养的微生物组分中，因而尚未被发掘。 "暗物质".

概念 原位 培养解决了这一关键问题。利用扩散室在细菌的自然生境中进行培养，扩散室允许营养物质和代谢物的流入，同时防止污染。本方案提供了iChip技术的操作指南，该技术是扩散室的高通量改进方法，可用于从任何环境中（本例为土壤）分离和建立不可培养细菌的纯培养。

尽管该方法与传统的扩散室相比能够实现大规模高通量的纯培养物分离，但仍存在若干关键步骤和局限性需要考虑。例如，选择合适的样品稀释度对于在尽可能多的通道中获得单个细胞至关重要。若用于涂布的稀释度过低，可能导致分离回收效率显著下降。对于难培养细菌而言...

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披露

作者声明不存在利益冲突。

致谢

A.V. 获得印度政府总理研究奖学金（Prime Minister's Research Fellowship，PMRF）项目资助。V.V. 获得印度科学技术部创新科学探索研究奖学金（Innovation in Science Pursuit for Inspired Research Fellowship，INSPIRE）项目资助。 & 技术部，印度政府。I.B. 的访问部分由美国国际教育交流基金会（USIEF）的富布赖特 APE 奖学金资助。作者感谢生物科学系 &感谢生物工程学系及焦特布尔印度理工学院为本研究提供的后勤支持与基础设施。特此感谢焦特布尔印度理工学院微生物生理学实验室的Dr. Sudarshna Negi、Aastha Kapoor女士、Tamal Dey先生、Bharat Pareek先生、Ajeet Singh先生及其他成员提供的技术支持。

ADSB-2024 参与者队列

2024年土壤细菌抗生素发现（ADSB）短期课程参与者团队，该课程在生物科学系举办 & 生物工程，印度理工学院焦特布尔分校（按字母顺序列出）：

Abinash Kumar Jena, Banishree Jali, Bharat Gurnani, Bharat Pareek, Dipro Mukherjee, Garima Kanwar Shekhawat, GT Vishnu, Jayita Sarkar, Krishna Saharan, Kriti Singhal, Lekh Raj, Mitta Bindusree, Phulen Sarma, Priyanka Kumari, Rachana Dinesh, Satyendra Singh 和 Swathi Sujith

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
3D 打印机Protolabs, USA1631-8333D 打印服务提供商
琼脂糖 Himedia, 印度MB002培养基组分
酪蛋白氨基酸Sisco, 印度68806培养基组分
酪蛋白水解物 ASES, 印度C5890培养基组分
聚碳酸酯膜Sterlitech, USAPCT00347100耗材
马铃薯淀粉Himedia, 印度GM403培养基组分
PowerPointMicrosoft, USAN/A用于 iChip 组件初步设计的制作
PTC CreoPTC, USAN/A用于 iChip 组件的 3D 计算机辅助建模
胰蛋白胨大豆肉汤Himedia, 印度M011实验室培养基
What3WordsWhat3Words, 英国N/A用于记录采样地点的坐标

参考文献

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