原位 分离与培养难培养土壤细菌的分离芯片（iChip）方法

摘要

本方案描述了一种分离芯片（iChip）的设计与使用方法，用于 原位 在其自然环境中培养顽固性土壤微生物。同时还描述了 原位 抗微生物物质产生菌的土壤细菌培养。该方案可经调整用于从不同生态位中分离具有其他理想特性的细菌。

摘要

生态系统蕴藏着数以百万计的环境微生物，其中一些能够产生具有生物技术应用价值的产物，如酶、维生素、氨基酸、有机酸、抗寄生虫剂和抗菌剂。大多数这类环境细菌被认为是“不可培养的”，因为实验室培养方法无法满足其营养或环境需求。此外，由于它们在自然界中与其他微生物共存，可能依赖于微生物群落中其他成员所产生的营养物质或代谢物。将这些“未培养”微生物的多样性引入培养体系，将为我们探索其可能编码的大量生物活性产物提供机会。本文介绍了iChip技术的应用，这是一种为高通量筛选设计的多通道扩散室， 原位 培养“不可培养”细菌。鉴于抗菌药物耐药性已成为全球性威胁，本文提供了一种详细的实验方案 原位 从可产生抗菌物质的微生物“暗物质”中培养和分离菌株的示例。本方案详细描述了从土壤样品采集到菌株分离的各个步骤，并强调了可能影响分离成功率的潜在因素。该技术的应用不仅有助于分离传统上“不可培养”的细菌以用于抗生素发现，还使研究人员能够深入探究复杂的土壤生态，进而为多种其他应用提供资源。

引言

在土壤、水体和极端环境等自然环境中，存在着大量尚未被探索的微生物资源库。然而，要利用这些丰富的微生物生物多样性十分困难，因为大多数微生物无法通过传统的实验室培养基和方法轻松培养。这种现象被称为“巨大平板计数异常”，它揭示了显微镜下可直接观察到的微生物数量与在培养基上能够生长的微生物数量之间存在显著差异¹。克服这一障碍并获取不可培养微生物及其产物的多样性，可能有助于满足多种生物技术需求。

例如，抗菌药物耐药性的发展已成为全球公共卫生的重大威胁。主要制药公司对抗微生物新药研发的兴趣不高，导致新型抗微生物药物的发现速度远低于现有抗生素耐药性的出现速度^2,3。因此，迫切需要发现新型抗微生物药物⁴。由于微生物群落在共同进化或竞争过程中已长期共存⁵，它们具备产生新型化合物的潜力，以提高自身的生存机会。环境微生物及其代谢产物具有极高的多样性，但尚未被充分挖掘，因为传统的基于实验室培养的方法往往只能分离出相似且已知的微生物。这是因为常规培养基和培养方法倾向于培养与人类相关的微生物，无法模拟自然生态环境。设计用于培养环境微生物的培养基具有挑战性，因为某些微生物的生长可能依赖多种营养物质——这些物质通常由周围其他微生物产生——并需要特定的....

方案

1. 设计与3D打印

1. 根据样本类型、每个扩散室的体积、所用膜的尺寸以及所需的通量（扩散室数量）来选择设计和尺寸。
   注意：中间板的厚度和每个通道的直径决定了每个圆柱形扩散室的体积。尺寸取决于需容纳的独立扩散室数量，而膜的尺寸则直接取决于所覆盖的扩散室数量（图1）。
2. 在任意演示文稿软件中使用插入图形功能，插入具有所需尺寸的圆形以作为iChip。在大圆内插入较小的圆形以表示通道。将这些小圆按所需排列方式布置，以初步设计顶板/底板和中间板的结构。选中设计后，通过右键菜单将其另存为图片。
3. 以初步设计为模板，开始使用计算机辅助设计（CAD）软件创建二维（2D）设计。
   1. 从草图菜单中插入预定义形状，主要为圆形，以构建板和通道阵列的基本设计。
   2. 使用尺寸标注功能设定板和通道的实际尺寸。点击确定完成设计，然后使用拉伸功能将2D设计转换为具有指定厚度的三维（3D）模型。
   3. 最后，通过文件菜单中的保存功能，将3D模型保存为适用于3D打印的立体光刻（STL）文件格式。
4. 根据预期应用选择打印材料，考虑因素包括首选的灭菌方法和埋植地点。例如，若需高压灭菌或将在高温环境中埋植，则应选....

结果

本方案中使用的iChip是按照所示方式设计、3D打印并组装的 图1该方案的概述如图所示。 图2实验所用土壤样品采自印度拉贾斯坦邦焦特布尔印度理工学院（IIT Jodhpur）校园。该地点的唯一三位词地址为“communicate.supervising.recurrence”。所选地点为半干旱区，温度为 40 °C 采样当天正值夏季中期。土壤样品在地下6-7英寸深度无菌采集，该深度的地下温度为 35 °C 放入无菌聚苯乙烯盒中，并在采集后24小时内送至实验室进行处理。随后进行系列稀释，并接种于胰蛋白胨大豆琼脂平板，以确定合适的稀释度。该土壤的可培养微生物密度为8 × 10⁶ CFU/g 土壤。10^-3 土壤悬液的稀释度约为 8 x 10² CFU/mL，选择此浓度用于接种。接种两周后 原位 孵育后，我们能够从0.1x胰蛋白胨大豆肉汤琼脂的琼脂块中回收到多个分离株。将从琼脂块中生长出的分离株在0.1x胰蛋白胨大豆肉汤琼脂上划线培养，以获得.......

讨论

地球上众多独特的生境孕育了各具特色的微生物群落，展现出巨大的多样性。然而，由于难以提供适合其生长的培养条件，这一多样性至今仍未被充分探索。某些细菌依赖其他微生物释放的代谢产物才能存活，因此无法在实验室条件下独立生长。此外，细菌在调控生物地球化学循环中发挥着关键作用，而这些过程在实验室环境中难以模拟。大部分微生物多样性及其所编码的新型化学结构存在于不可培养的微生物组分中，因而尚未被发掘。 "暗物质".

概念 原位 培养解决了这一关键问题。利用扩散室在细菌的自然生境中进行培养，扩散室允许营养物质和代谢物的流入，同时防止污染。本方案提供了iChip技术的操作指南，该技术是扩散室的高通量改进方法，可用于从任何环境中（本例为土壤）分离和建立不可培养细菌的纯培养。

尽管该方法与传统的扩散室相比能够实现大规模高通量的纯培养物分离，但仍存在若干关键步骤和局限性需要考虑。例如，选择合适的样品稀释度对于在尽可能多的通道中获得单个细胞至关重要。若用于涂布的稀释度过低，可能导致分离回收效率显著下降。对于难培养细菌而言.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
3D 打印机	Protolabs, USA	1631-833	3D 打印服务提供商
琼脂糖	Himedia, 印度	MB002	培养基组分
酪蛋白氨基酸	Sisco, 印度	68806	培养基组分
酪蛋白水解物	ASES, 印度	C5890	培养基组分
聚碳酸酯膜	Sterlitech, USA	PCT00347100	耗材
马铃薯淀粉	Himedia, 印度	GM403	培养基组分
PowerPoint	Microsoft, USA	N/A	用于 iChip 组件初步设计的制作
PTC Creo	PTC, USA	N/A	用于 iChip 组件的 3D 计算机辅助建模
胰蛋白胨大豆肉汤	Himedia, 印度	M011	实验室培养基
What3Words	What3Words, 英国	N/A	用于记录采样地点的坐标