原位 使用隔离芯片分离和培养顽固土壤细菌 （iChip）

Summary

该协议描述了隔离芯片（iChip）的设计和使用，用于在其自然环境中原 位 培养顽固的土壤微生物。它还描述了产生抗菌素的土壤细菌的 原位 培养。该协议可以适应从具有其他理想特性的不同生态位中回收细菌。

Abstract

生态系统中蕴藏着数百万种环境微生物，其中一些能够生产与生物技术相关的产品，如酶、维生素、氨基酸、有机酸、抗寄生虫剂和抗菌剂。这些环境细菌中的大多数被认为是“不可培养的”，因为实验室培养方法无法满足其营养/环境要求。此外，由于它们在自然界中共存，它们也可能依赖于微生物群落中另一个成员产生的营养物质/代谢物。将“未培养”的微生物多样性引入培养物将提供一个机会来探索它们可能编码的大量生物活性产品。本文介绍了iChip技术的实施，该技术是一种多通道扩散室，专为“不可培养”细菌的高通量原 位 培养而开发。鉴于抗菌素耐药性的全球威胁，本文提供了详细的方案，用于原 位 培养和回收能够生产抗菌剂的微生物“暗物质”分离株。该协议描述了从土壤样本收集步骤到分离株回收所涉及的步骤，并强调了可能影响分离成功的合理因素。这项技术的使用不仅有助于分离出原本“无法培养”的细菌以发现抗生素，而且还使研究人员能够深入研究复杂的土壤生态，然后可以将其用于无数其他应用。

Introduction

土壤、水体和极端环境等自然环境中存在着丰富的以前未被探索的微生物库。然而，利用这种巨大的微生物生物多样性具有挑战性，因为大多数微生物无法使用传统的实验室培养基和方法轻松培养。大平板计数异常描述了这种现象，突出了可以目视观察到的微生物数量与在培养基中观察到生长的微生物数量不一致¹。绕过这一障碍，使微生物及其产品的不可培养的多样性能够获得，就有可能满足各种生物技术需求。

例如，抗菌素耐药性的发展已成为对全球公共卫生的威胁。主要制药公司一直不愿寻求新抗菌药物的发现，导致与现有抗生素耐药性的出现率相比，发现率下降 ^2,3。因此，迫切需要发现新型抗菌药物⁴。由于微生物群落是同时进化或竞争⁵ 一起进化的，因此它们已经发展出产生新型化合物的潜力，从而提高它们的生存机会。环境微生物及其产物的巨大多样性尚未得到充分探索，因为传统的基于实验室培养的方法往往会导致分离出相似的已知微生物。这是因为传统的培养基和方法偏向于培养与人类相关的微生物，无法模仿自然环境。设计培养基来培养环境微生物具有挑战性，因为某些物种的生长可能需要各种营养物质，通常由附近的其他微生物产生，以及特定....

Protocol

1. 设计和3D打印

1. 根据样品类型、每个扩散室的体积、要使用的膜尺寸以及所需的通量（扩散室数量）选择设计和尺寸。
   注意：中间板的厚度和每个通道的直径决定了每个圆柱形扩散室的体积。尺寸取决于要容纳的单个扩散室的数量，膜的尺寸直接取决于覆盖的扩散室的数量（图1）。
2. 使用任何演示软件程序中的 插入 形状选项来插入必要尺寸的圆以用作 iChip。在其中插入较小的圆圈以表示通道。将较小的圆圈排列成所需的图案，为顶板/底板和中板准备初步设计。选择设计，然后使用右键菜单将初步设计另存为图片。
3. 使用初步设计作为模板，开始使用计算机辅助设计 （CAD） 软件创建 2D （2D） 设计。
   1. 从草图菜单中，插入预定义的形状，主要是圆形，以创建板和通道阵列的基本设计。
   2. 使用尺寸选项设置板和通道的实际尺寸。单击 “确定 ”以完成设计，然后使用挤出功能将 2D 设计转换为所需厚度的 3D 模型。
   3. 最后，使用 文件菜单保存 以立体光刻 （STL） 文件格式保存 3D 模型的副本，兼容 3D 打印。
4. 根据所需的应用选择印刷材料....

Results

该协议中使用的 iChip 的设计、3D 打印和组装如 图 1 所示。所描述的协议概述如 图2所示。用于实验的土壤样本是从印度拉贾斯坦邦的印度理工学院焦特布尔校区采集的。该地点唯一的三个词地址是“communicate.supervising.recurrence”。选择的地点是采样当天温度为40 °C的半干旱区。土壤样品采集于仲夏。样品在6-7英寸深度、亚表面温度为35°C处无菌采集到无菌聚苯乙烯盒中，并在采集后24小时内带到实验室进行处理。然后将它们连续稀释并接种在胰蛋白酶大豆琼脂上以估计适当的稀释度。土壤的可培养微生物密度为8 × 10⁶ CFU/g土壤。土壤悬浮液的^10-3 稀释度含有~8 x 10² CFU/mL，选择用于播种。经过 2 周的 原位 孵育后，我们能够从 0.1x 胰蛋白酶大豆肉汤琼脂上的琼脂塞中回收了几种分离株。将从琼脂塞中生长的分离物在0.1x胰蛋白酶大豆肉汤琼脂上划线，以获得具有单一菌落形态的纯培养物。其中.......

Discussion

地球上众多独特的栖息地拥有代表巨大多样性的独特微生物群落。由于提供种植所需的适当生长条件的局限性，这一点仍未得到探索。一些细菌依赖其他细菌释放的代谢物生存，因此无法在实验室条件下独立生存。此外，细菌在协调生物地球化学循环方面也发挥着至关重要的作用，这是实验室环境中无法模拟的。大多数微生物生物多样性及其编码的新颖化学结构都消失在微生物“暗物质”的不可培养部分中。

原 位 栽培的概念解决了这个关键问题。细菌在其自然栖息地使用扩散室进行培养，该扩散室允许营养物质和代谢物流入，但防止污染。该协议为iChip技术的实施提供了程序指导，iChip技术是用于培养的扩散室的高通量进步，以及从任何环境（在本例中为土壤）中建立不可培养细菌的纯培养。

尽管与传统扩散室相比，该方法提供了纯培养物的大量高通量分离，但应考虑几个关键步骤和局限性。例如，选择适当的样品稀释度对于获得最大通道数中的单个细胞是必要的。用于电镀的非常低的稀释度可能会导致分离物回收效率严重下降。挑.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D打印机	Protolabs， USA	1631-833	3D打印服务提供商
Agarose	Himedia， India	MB002	培养基成分
Casamino Acids	Sisco， India	68806	培养基成分
酪蛋白消化	ASES，印度	C5890	介质组件
聚碳酸酯膜	Sterlitech，美国	PCT00347100	消耗品
马铃薯淀粉	Himedia，印度	GM403	介质组件
PowerPoint Microsoft	，美国	N/A	用于创建 iChip 组件 初步设计
PTC Creo	PTC，美国	N/A	用于 3D 计算机辅助iChip 组件的建模
胰蛋白酶大豆肉汤	Himedia，印度	M011	实验室培养基
What3Words	What3Words，英国	N/A	用于记录采样位置的坐标