颅神经嵴细胞三维培养 体外 多重检测的分化方案

摘要

我们介绍一种三维（3D） 体外 生成可重复大小的神经球以诱导小鼠胚胎干细胞分化为颅神经嵴细胞的分化方案。我们展示了该方法相较于以往方案可减少变异性，并阐述了其如何用于多重检测以研究颅神经嵴细胞的发育过程。

摘要

颅神经嵴细胞（CNCC）具有生成外胚层和间充质衍生物的显著能力，因此在研究调控细胞命运决定和可塑性机制方面备受关注。该细胞群体起源于背侧神经上皮，在发育中的胚胎中具有短暂性和相对稀少的特点，这使得在体内进行功能检测、基因组筛选和生物化学分析具有挑战性。in vivo。为克服这些限制，已开发出多种体外模拟CNCC发育的方法。in vitro。基于神经球（NS）的培养方法提供了一个复杂的微环境，可在三维条件下模拟前部神经上皮的发育过程。这些系统可在同一培养板中生长大量神经球，从而获得较多CNCC，但所产生的神经球在形态、大小以及形成的CNCC数量方面存在高度变异性，导致定量分析难以实施。本方案介绍了一种在96孔板格式下由小鼠胚胎干细胞（mESC）可重复生成神经球的方法。在96孔板中生成的神经球可产生颅神经嵴细胞（CNCC），并可进一步培养。通过控制起始细胞数量，该方法减少了神经球之间在大小和形态上的差异，提高了实验间的可重复性。最后，该培养系统适用于多种应用，具有更高的灵活性，因而高度可定制，适合多重实验条件的并行操作。

引言

颅神经嵴细胞（CNCC）是一类干细胞样细胞群体，起源于胚胎发育最前端的神经板与表层外胚层交界处¹随后，神经嵴细胞经历上皮-间质转化（EMT），从神经上皮脱离，并沿背腹方向迁移到胚胎内的不同部位，在这些部位分化为多种多样的细胞类型。²研究这一细胞群体具有重要意义，因其具有显著的可塑性³ 以及分化为外胚层和中胚层衍生物的独特能力，例如颅面骨和软骨⁴尽管神经嵴细胞在胚胎中相对容易获取，但它们是一类短暂存在的细胞群体，数量较少，这使得系统性的机制研究难以开展 体内近年来，为克服这些局限性，已分离并鉴定出多种CNCC细胞系。其中，O9-1 CNCC细胞系是研究神经嵴细胞迁移及迁移后发育过程的有力工具。^5,6；然而，该细胞系无法用于研究迁移前与神经嵴诱导及特化相关的早期事件。在这方面，近年来在细胞系的开发中取得了显著进展 体外 通过使用类似发育中神经上皮的三维结构——神经球（NS），在培养皿中诱导颅神经嵴细胞（CNCC）分化的方案^7,8- 胚胎干细胞（ESC）集落后经分化获得。这些三维培养方案可高效生成大量颅神经嵴细胞（CNCC），支持开展生物化学与基因组学机制研究^9,10神经球在添加了N2B27补充剂的培养基中，于低吸附培养板上进行培养，并加入成纤维细胞生长因子（FGF）和表皮生长因子（EGF）。^10,11 以促进细胞增殖。这些操作在培养皿中进行，于同一培养板中培养大量神经球（NS）。在生长过程中，NS内的细胞聚集并持续分裂，成熟时直径可达100–200 µm。当达到成熟阶段（约第5天），NS附着于基质并分化为类似于颅神经嵴细胞（CNCC）的细胞 在体内 对应物^9,12这些神经嵴来源的细胞（CNCC）随后经历上皮-间质转化（EMT）并从球体表面脱离。根据神经球（NS）大小的不同，可观察到形态学差异：较大的神经球核心区域颜色较深，这是由于营养和氧气供应不足，导致细胞发生凋亡。¹³尽管此类方案在分化终点能够产生大量颅神经嵴细胞（CNCC），但仍存在若干局限性，使得对分化过程中发生的各种分子动态变化的研究几乎无法实现。首先，由于使用大小不一的胚胎干细胞（ESC）克隆，难以控制每次实验的起始细胞数量。这导致生成的神经球（NS）形态和直径各异，通过激活特定信号通路而表现出不同的发育行为，进而影响细胞分化的一致性，因而无法在特定时间点获得均一的样本。其次，在同一培养板中培养多个神经球时常导致它们相互融合¹⁴ 并可能释放信号分子，影响邻近细胞的微环境，从而影响其发育。总体而言，这些操作在样品之间和实验之间产生了较大的变异性。

本文介绍一种克服上述困难的策略，即通过将小鼠胚胎干细胞（mESC）聚集在未经组织培养处理的U型底96孔板中，生成具有产生颅神经嵴细胞（CNCC）能力的单个神经球（NS）。与使用已建立的神经嵴细胞系相比，从mESC开始可研究CNCC发育的特化过程及其早期阶段。本方案首先将mESC集落解离，获得单细胞悬液，随后将特定数量的mESC接种至未经组织培养处理的U型底96孔板的每个孔中。细胞在孔中聚集培养两天后，转移至未经组织培养处理的平底96孔板，使神经球能够贴附于孔底。通过控制每个神经球起始的细胞数量及其在分化过程中的微环境，本方案减少了样本间的变异性，从而提高了实验的可重复性。我们认为，该平台将便于设计多重实验，例如测试不同培养条件的影响或进行基因扰动筛选。

方案

1. 从小鼠 ESC 克隆中制备单细胞悬液

注意：本方案适用于在经明胶包被的组织培养处理过的6孔板中、饲养层细胞失活条件下培养的CK35小鼠胚胎干细胞（mESC）（一种具有生殖系传递能力的小鼠胚胎干细胞系，可用于后续构建体内模型¹⁵）。一个组织培养处理过的6孔板中的单孔可获得约1.5 × 10⁶个mESC，足以满足本方案后续实验需求。如有需要，可按比例放大。请根据所选用的胚胎干细胞株、维持培养方法以及相应的培养基，对初始步骤进行相应调整。本方案需在无菌条件下操作。有关本方案所用全部材料、试剂和设备的详细信息，请参见材料表。

1. 从在 mESC 培养基中培养至 70%–80% 汇合度的 mESC 开始。本研究中使用的 mESC 培养基成分见表 1。
   注意：mESC 汇合度不可超过 80%，否则细胞将开始分化，从而影响后续聚集体形成。细胞集落应致密，形态健康（无裂纹或波浪状边缘，核质对比清晰）。
2. 配制 CNCC 分化培养基。CNCC 分化培养基成分见表 1。
   注意：添加生长因子后，培养基可在 4 °C 避光保存最多 3 周。
3. 在 DMEM-Knockout 培养基中配制浓度为 2 mg/mL 的新鲜胶原酶溶液。
   注意：使用胶原酶可确保仅集落被消化脱离，而饲养层细胞不受影响；若饲养层细胞进入后续步骤，将干扰神经球（NS）的聚集。使用前用 0.22 µm 滤器过滤胶原酶溶液。
4. 吸除 mESC 培养皿中的 ESC 培养基。
5. 沿孔壁轻柔加入 1 mL PBS，轻轻摇动培养板以确保充分洗涤。
6. 移除 PBS，加入 2 mL 胶原酶溶液，于 37 °C 孵育 30–45 分钟。
   1. 孵育开始 20 分钟后，在光学显微镜 10 倍物镜下观察培养板，之后每 5 分钟观察一次。
   2. 当集落边缘出现卷起时，用力轻敲培养板侧壁，集落即可脱落。
7. 使用 5 mL 血清移液管收集集落，并转移至 15 mL 圆锥形离心管中。
   注意：在光学显微镜下检查培养板是否残留集落，如有残留可用 PBS 洗涤收集。
8. 在室温（RT）下以 16 × g 离心 3 分钟，使集落沉淀。
9. 尽可能吸除离心管中的上清液，注意勿扰动管底的细胞集落。
10. 加入 1 mL 0.05% 胰蛋白酶溶液，于 37 °C 孵育 5 分钟。
11. 先用 p1000 移液器、再用 p200 移液器反复吹打，充分解离离心管中的集落。
    注意：此步骤可确保获得单细胞悬液。
12. 加入 2 mL mESC 培养基以终止胰酶消化作用，于 160 × g 室温离心 3 分钟。弃去上清液，加入 1 mL CNCC 分化培养基。
13. 按照制造商说明，使用自动细胞计数仪 或显微镜下标准化计数系统进行细胞计数。
14. 计数后，用足够的 CNCC 分化培养基稀释，使细胞浓度达到每 50 µL 含 3000 个活细胞。
15. 使用 p200 移液器，将 50 µL 细胞悬液接种至未经组织培养处理的 U 型底 96 孔板的每个孔中，随后补加 CNCC 分化培养基至每孔总体积为 200 µL。
    注意：在加样过程中，需不时使用 p1000 移液器吹打单细胞悬液，以维持细胞悬液浓度均一。
16. 置于 37 °C、5% CO₂ 培养箱中过夜孵育。

2. 转移至平底96孔板以进行CNCC分化

1. 第二天（第1天），在光学显微镜下观察培养板。确保每个孔底部可见一个边界清晰的小细胞簇。将培养板放回培养箱中过夜。
   注意：主要聚集体周围可能存在一些细胞，部分可能已死亡。这不会影响神经球（NS）的聚集。
2. 第2天，缓慢从每个孔中移除100 µL培养基。
   1. 吸取培养基时，注意不要吸走神经球（NS）。为避免此情况，将移液枪头靠近液面，远离孔底。
3. 将一支p200移液枪枪头的尖端从末端向上约3-4 mm处剪断。使用此改造枪头吸取神经球（NS）及剩余培养基。
   注意：为便于吸取神经球（NS），可在吸取前轻轻吹打数次。
4. 将神经球（NS）和剩余培养基转移至未经TC处理的平底96孔板中，并在光学显微镜下确认转移结果，随后向每个新孔中加入100 µL预温的CNCC分化培养基。将神经球（NS）置于37 °C、5% CO₂培养箱中培养至第4天。
5. 第4天，从每个孔中移除100 µL培养基，并替换为100 µL预温的CNCC分化培养基。
   注意：为避免干扰神经球（NS）在孔底的贴附，应缓慢地吸出并更换培养基。
6. 第5天和第6天，在光学显微镜下检查神经球（NS）的贴附情况。确保较亮的细胞——从神经球（NS）上脱离——开始围绕神经球主体分布。
7. 第7天，按照步骤2.5所述更换培养基。此后每2天以相同方式更换一次培养基，直至实验终点。

3. CNCC 传代与维持

注意：一旦在神经嵴（NS）周围可见足够数量的细胞，即可进行颅神经嵴细胞（CNCC）传代。最早可在第7天进行，因为更早的时间点无法获得足量的CNCC。

1. 配制CNCC维持培养基。CNCC维持培养基的成分见表1。
   1. 将BSA溶解后，使用0.22 μm滤器过滤，再加入培养基中。添加生长因子后，将培养基置于4 °C避光保存，最多可保存3周。
2. 用PBS配制浓度为7.5 µg/mL的纤连蛋白溶液，充分混匀。
3. 向未经组织培养（TC）处理的96孔板中每孔加入100 μL纤连蛋白溶液，对孔板进行包被。在室温下于生物安全柜中孵育30分钟。
   注意：若CNCC将用于免疫荧光染色，应在包被前于孔底放置无菌玻璃盖玻片。确保盖玻片位于孔底且不漂浮，以避免包被到后续实验不使用的那一面。有关CNCC的固定与封片操作，请参见第5节说明。
4. 与此同时，在未经TC处理的平底96孔板中，尽可能吸除各孔中的CNCC分化培养基，并替换为50 µL的Accutase酶溶液。在37 °C孵育5分钟。
5. 孵育结束后，向每孔加入100 µL CNCC维持培养基以终止Accutase的消化作用。从待接种细胞的未经TC处理的平底96孔板各孔中移除纤连蛋白溶液。将解离后的迁移后CNCC通过40 µm滤器过滤，直接滤入待接种的未经TC处理的平底96孔板的孔中。
   注意：此步骤可去除细胞团块或此前未完全清除的神经嵴球（NS）。相同条件下培养的CNCC可收集至同一50 mL离心管中，随后接种至经TC处理的6孔板的同一孔中。在此情况下，使用1 mL纤连蛋白溶液对孔进行包被，并用1 mL CNCC维持培养基 终止Accutase作用。
6. 将迁移后的CNCC在37 °C孵育15–30分钟，使其贴壁。吸弃旧培养基 ，每孔更换100 µL新鲜CNCC维持培养基。每2天更换一次培养基 。
   注意：添加培养基时应轻柔操作，因快速流速可能诱导CNCC向神经谱系分化。若使用6孔板，则每孔使用1 mL CNCC维持培养基。

4. 免疫荧光染色用神经球的固定与封片

1. 在预定时间点，用剪刀剪去 p200 微量移液器吸头的尖端，轻轻吹打，将非 TC 处理的平底 96 孔板中的神经球（NS）转移至 DNA 低吸附的 2 mL 离心管中。
   注意：在较晚的时间点（第 7 天及以后），神经球已大到肉眼可见，但也更难脱离。
2. 在室温下让神经球在管中静置 3 分钟，尽可能吸除上清液，并用 1 mL 冷的 PBS 洗涤一次。
   注意：若转移早期时间点（第 3–4 天前）的小神经球，需在 16 × g 条件下离心 3 分钟，以确保神经球沉降至管底。
3. 吸除 PBS，并在化学通风橱中加入 2 mL 含 4% 多聚甲醛（PFA）的 PBS 溶液。室温孵育 20 分钟。
   1. 加入 4% PFA 溶液后，缓慢倒置离心管，使其侧向静置完成固定。此步骤的目的是使神经球轻微分散，避免聚集粘连。
4. 在化学通风橱中去除 4% PFA 溶液，用 1 mL 冷的含 0.5% Tween20 的 PBS 洗涤神经球。室温静置 3 分钟。共重复洗涤 3 次。
   注意：神经球将沉降至管底。
5. 去除 PBS/0.5% Tween20 溶液，加入 2 mL 含 0.1% Triton X-100 的 PBS 溶液。倒置离心管并侧向静置，室温孵育 1 小时。
6. 按照步骤 4.4 的方法，用冷的 PBS/0.5% Tween20 溶液洗涤神经球 3 次。
7. 去除 PBS/0.5% Tween20 溶液，加入含 2% BSA 的 PBS 溶液，在 4 °C 下封闭，至少 1 小时，建议过夜。
   注意：样品可在含 2% BSA 的 PBS 溶液中于 4 °C 保存最多 1 周。需避光保存。
8. 将适量稀释的一抗加入含 2% BSA 的 PBS 溶液中，配制总体积为 500 µL 的一抗溶液。本研究所用一抗混合液的具体信息见 表 2。
9. 尽可能吸除封闭液，用剪去尖端的 p200 微量移液器将神经球转移至 0.5 mL 离心管中。
10. 加入一抗溶液，缓慢吹打重悬神经球。在 4 °C 条件下于旋转摇床上孵育过夜。
11. 用冷的 PBS 在室温下洗涤神经球 3 次，每次 5 分钟。
12. 将所选二抗按适当比例稀释于含 2% BSA 的 PBS 溶液中，并加入 1/1000 的 DAPI，配制二抗溶液。本研究所用二抗混合液的具体信息见 表 2。
    注意：需将离心管避光保存。
13. 吸除 PBS，加入 500 µL 二抗溶液，并用铝箔包裹离心管以避光。在室温旋转摇床上孵育 1 小时。
14. 按照步骤 4.11 的方法，用冷的 PBS 洗涤神经球 3 次。
15. 尽可能吸除 PBS，注意不要吸走神经球，替换为 50 µL 透明化试剂，并按照试剂生产商的说明进行后续操作。
16. 室温避光孵育过夜。
17. 制备封片腔室。
    1. 在载玻片上贴三层双面胶带。使用透明无纤维胶带，以避免在封片腔室内残留杂质。
    2. 使用刀片在双面胶带上切割出一个 3 mm × 8 mm 的窗口。
       注意：腔室尺寸取决于样本的时间点。本示例适用于容纳 50 µL 封片介质，适合在较晚时间点（第 7–9 天）放置 10–20 个单个神经球。
18. 在体视显微镜下，用剪去尖端的低吸附 p200 移液器吸头，小心地将含透明化试剂的神经球转移至封片腔室中。使用 2× 至 4× 的放大倍数，以获得整个腔室的视野并足以识别神经球。若体视显微镜具备荧光成像功能，使用蓝色荧光滤光片可更易识别神经球，因为 DAPI 染色会使原本透明的神经球显现出来。
    注意：确认封片介质在腔室上方形成轻微凸起的弯月面，以确保腔室内无气泡。
19. 将盖玻片轻轻放置在表面，并轻压其两侧使其贴附。此步骤需在体视显微镜下进行，并确认神经球未被推出腔室外。
20. 避光保存于 4 °C，直至成像。

5. 神经嵴细胞的固定与免疫荧光载片

1. 从孔中移除CNCC维持培养基 ，并用PBS洗涤。通过移液枪将PBS沿孔壁缓慢加入，避免直接冲击细胞。
2. 按照步骤4.3–4.14中所述进行固定、通透和染色操作。
3. 将盖玻片置于载玻片上进行封片：先在载玻片上滴加封片剂，然后用镊子夹取并旋转盖玻片，使迁移后的CNCC面向载玻片，再将其放置在液滴上。
   1. 可选步骤：使用指甲油或其他常用的封片系统密封盖玻片边缘。
4. 避光保存于4 °C，直至成像。

结果

按照方案，将mESC集落解离后，将3000个细胞接种于未经TC处理的U型底96孔板中。第2天，将聚集形成的神经球（NS）转移至未经TC处理的平底96孔板中，使其贴壁。神经球聚集方案的简化示意图见图1A。神经球培养至第9天后进行免疫荧光染色。从神经球迁移至培养板上的细胞被转移至盖玻片上用于成像，并在CNCC维持培养基中继续培养至第13天。同时，以培养皿中生成神经球的方案作为对照和比较基准。本实验的总体目标是降低在培养皿中进行该方案时所观察到的神经球间变异。

在非TC处理的96孔板中单独培养时，神经球（NS）的表型变异性降低。所有神经球均从第5天开始贴壁，而在第7天，当在培养皿中培养时，贴壁的神经球比例变异较大，且总体比例较低（图1B，C）。此外，在培养皿中培养时， consistently 观察到神经球融合现象，第4天即可观察到（图1B）。在第9天，无论是在非TC处理的96...

讨论

体外 3D 分化模型可用于分析在 2D 细胞培养中难以观察甚至无法观察到的复杂细胞相互作用。目前已开发出多种模型用于体外研究颅神经嵴细胞（CNCC）的发育过程，这些模型通常直接来源于胚胎干细胞（ESC）集落^7,21或组织外植体^22,23。尽管这些系统在生成神经嵴细胞方面已被证明有效，但这些方法对培养方式和微环境具有显著的敏感性，导致神经嵴细胞（NS）内的细胞组成和细胞特性存在差异²⁴。此外，这些方法未考虑 ESC 集落大小和细胞数量的初始异质性。

为克服这些局限性，本文介绍了一种通过在未经TC处理的96孔板中聚集小鼠胚胎干细胞（mESC）来生成单个神经球（NS）的方法。该方案通过将mESC集落制备成单细胞悬液并控制实验中的初始细胞数量，实现了起始条件的标准化。这有助于...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.22 μm 注射器滤器	ClearLine	146560
15 mL 高透明度聚丙烯锥形管	Falcon	352096
200 µL ClearLine Plus 低吸附滤芯吸头	Dutscher	713263
40 µm 滤膜	Falcon	352340
5 mL 血清移液管	Starstedt	86.1253.001
50 mL 高透明度聚丙烯锥形管	Falcon	352070
Accutase	Merck-Sigma	A6964
Alexa Fluor 488 驴抗兔 IgG (H+L)	Thermofisher Scientific	A21206
Alexa Fluor 594 驴抗小鼠 IgG (H+L)	Thermofisher Scientific	A21203
Alexa Fluor 647 驴抗山羊 IgG (H+L)	Thermofisher Scientific	A31571
抗生素-抗真菌溶液	Merck-Sigma	A5955
B27 PLUS 添加剂	Thermofisher Scientific	17504044
牛血清白蛋白 (BSA)	Merck-Sigma	A9418
氯仿	Carlo Erba	438601
IV 型胶原酶	Thermofisher Scientific, Gibco	17104019
Costar 6 孔透明 TC 处理多孔板	Corning	3516
圆形盖玻片	VWR	630-2113
DMEM KnockOut	Thermofisher Scientific	10829018
DMEM/F12+Glutamax	Thermofisher Scientific	10565018
高糖 DMEM	Merck-Sigma	D0822
DNA LoBind 管, 2 mL	Eppendorf	30108078
无 DNase/RNase 蒸馏水	Thermofisher Scientific	10977-035
Dulbecco’s 磷酸盐缓冲液 (PBS)	Thermofisher Scientific	14190144
Eppendorf Safe-Lock 管, 0.5 mL	Eppendorf	30121023
Eppendorf Safe-Lock 管, 2 mL	Eppendorf	30120094
ESGRO mLIF 培养基添加剂	Merck-Sigma	ESG1107
70% 乙醇	Carlo Erba	528170
胎牛血清	Merck-Sigma	F7524
纤连蛋白	Merck-Sigma	F085-2MG
Fluoromount-G	Invitrogen	00-4958-02
明胶溶液	Merck-Sigma	ES-006-B
GlutaMAX	Thermofisher Scientific	35050061
人 EGF	Peprotech	AF-100-15-500UG
人 FGF-basic	Peprotech	100-18B
人 SOX9 抗体	R&Dsystems	AF3075
牛胰岛素	Merck-Sigma	I6634
iScript cDNA 合成试剂盒	Biorad	1708891
小鼠抗人 AP-2 alpha 单克隆抗体，未偶联	DSHB	3B5
小鼠抗人 PAX7 单克隆抗体，未偶联	DSHB	PAX7
N2 添加剂	Thermofisher Scientific	17502048
Neurobasal 培养基	Thermofisher Scientific	21103049
非组织培养处理板，96 孔，平底	Falcon	351172
非组织培养处理板，96 孔，U 型底	Falcon	351177
16% 甲醛溶液，电子显微镜级	Electron Microscopy Sciences	15710
丙-2-醇	Carlo Erba	415154
纯化抗微管蛋白 β 3 (TUJ1) 抗体	Biolegend	MMS-435P
RapiClear 1.47	Sunjin Lab	RC147001
RapiClear 1.52	Sunjin Lab	RC152001
Scotch 双面胶带 12.7 mm × 22.8 m			透明无纤维双面胶带
SensiFAST SYBR No-ROX 试剂盒	Meridian Bioscience	BIO-98020
无菌一次性外科手术刀片	Swann-Morton	05XX
Superfrost Plus 黏附载玻片	Epredia	J1800AMNZ
Triton X-100	Thermofisher Scientific	A16046.AP
TRIzol 试剂	FisherScientific	15596026
胰蛋白酶-EDTA (0.05%)	Thermofisher Scientific	25300054
Tween-20	Fisher Scientific	10113103
TWIST1 兔单克隆抗体 (IF 配方)	Cell signaling technology	E7E2G
β-巯基乙醇	Thermofisher Scientific	31350010