方法文章

表征生物体液中的细胞外囊泡

DOI：

10.3791/67699

⸱

2025年2月28日

 ,  ,  ,  , 
1North Texas Eye Research Institute, University of North Texas Health Science Center, 2Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, University of North Texas Health Science Center, 3Department of Pharmacology and Neuroscience, University of North Texas Health Science Center

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在这里，我们展示了从人类受试者的生物体液（如眼泪和唾液）中收集的细胞外囊泡 （EV） 的表征方法。该方法中使用的扫描仪能够从 1 μL 样品中检测 EV 的表型、大小和总颗粒数。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

细胞外囊泡 （EV） 是由细胞产生的结构，通过将生物分子从一个细胞转运到另一个细胞来参与细胞间通讯。EV 已被证明可以在体内短距离和远距离传播，并且具有组织特异性。EV 不仅存在于组织中，而且几乎存在于所有体液中，例如眼泪、唾液、脑脊髓液、血液等。尽管可以从眼泪和唾液中无创收集 EV，但一次只能收集少量 EV，这可能会导致获得足够的 EV 来分析蛋白质的问题。本文讨论的扫描仪是一种纳米颗粒分析仪，它为这个问题提供了解决方案，使我们能够从低至 1 μL 的生物液体中表征和研究 EV 的表型、大小和总颗粒数。该协议将从难以从患者身上提取的小体积样本中扩展 EV 的知识。这可以提高患者的舒适度，并有可能确定一系列疾病和病症的新治疗靶点。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

细胞通过各种信号转导机制与邻近细胞进行交流，包括细胞外囊泡 （EV） 的释放，这在细胞间通讯中起着关键作用。EV 通过将 DNA、RNA 和蛋白质等遗传货物从一个细胞传递到另一个细胞来参与细胞间通讯 1,2,3,4,5。目前，EV 分为三类:外泌体、微泡和凋亡小体，其特征在于它们的大小。外泌体最小，直径为 30-150 nm 6,7,8，由内体膜系统形成 9,10,11（图 1）。微泡比外泌体大，因为它们的范围为 100-1000 nm 12,13,14 和芽离开质膜 11,12,13（图 1）。凋亡小体是最大的 EV，范围为 1000-5000 nm 12,14,15，它们也从质膜上发芽 12,16,17（图 1）。除了大小之外，EV 还可以根据其他生物物理特性进行分类，包括密度、分子标志物（如 CD63、CD81、CD9）以及生物发生机制18。EV 可以在相邻细胞之间短距离传播，也可以在全身长距离传播 19,20,21,22,23。EV 存在于生物体液中，例如血液 24,25,26、脑脊髓液27、28、29、眼泪30、31、32 和唾液 33,34,35 等。

迄今为止，超速离心是从样品36、37、38 中分离 EV 的最知名方法之一。该方法需要多轮离心和超速离心，这可以通过提高速度来从细胞和细胞碎片中分离 EV 来实现。该方法可以从低速开始，使用沉淀细胞，然后以中速去除较大的囊泡，最后进行超速离心步骤以沉淀 EV18。虽然超速离心被认为是最好的分离方法，但仍然存在一些局限性，因为它会改变 EV 的形态 39,40,41。另一种用于分离 EV 的技术是流式细胞术，它突出了多时间点和终点评估以及高通量单 EV 分析的优势。然而，流式细胞术的局限性包括但不限于孔隙堵塞和信号微弱。使用的另一种方法是梯度离心，它使用不同密度的材料与 EV 一起离心，与超速离心相比，可以更好地分离 EV。虽然这种技术提高了分离效果，但它是劳动密集型的、耗时的，并且可能导致样品的大量损失。此外，沉淀和过滤也可用于分离 EV。这两种技术都简单快捷，但都可能导致样品污染。虽然有几种技术可以隔离 EV，但每种技术都有其优点和局限性，如下所列（表 1）42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54， 55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67。

分离出 EV 后，即可进行分子测定以表征 EV。蛋白质印迹是寻找表面和货物蛋白表达 68,69,70 的常见测定方法，聚合酶链反应 （PCR） 用于 EV 的 miRNA 表达 71,72,73 74,75,76。这些检测是已建立的，可以产生有趣的结果。这些方法的一个局限性是它们需要来自 EV 的大量蛋白质或 RNA 才能获得读数77，这对于小体积或 EV 浓度的样品来说是一个问题。

本文讨论的纳米粒子分析仪允许用户克服表 1 和表 2 中提到的许多限制 78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,90 .这种方法不需要使用隔离技术，这将有助于克服 EV 产量降低的问题。该方法还允许用户分析低至 1 μL 样品体积的表面和货物蛋白、总 EV 计数和 EV 大小。这是通过使用公司提供的跨延肽芯片完成的，该芯片使用带有跨膜蛋白抗体 CD63、CD81 和 CD9 的抗体微阵列来识别溶液中的 EV，如图 2 所示。荧光抗体可确认 EV 的存在，并防止污染颗粒扭曲结果。

该技术的总体目标是提供一种耗时更少的方法来分析 EV 以及分析少量样品中的 EV。使用这款纳米颗粒分析仪，用户可以从低至 1 μL 的样品中分析大小、总颗粒数量和表面蛋白质，这是泪液和唾液等生物体液的理想选择。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

所描述的所有研究均符合赫尔辛基宣言。在纳入研究之前，已获得每个受试者的书面同意。根据联邦和机构指南，获得了奥胡斯大学医院 （1-10-72-77-14） 和麦基院长研究所 （1576837-2） 的机构审查委员会 （IRB） 批准。在处理之前，所有泪液和唾液样本都经过去标识化处理。所有研究均由北德克萨斯州地区机构审查委员会 （#2020-030） 审查和批准。如上所述，以下实验步骤符合所有指南并已获得批准。

1. 第 1 天:样品制备和孵育

  1. 收集生物体液样本，即受试者的眼泪和唾液，或从冰箱中解冻样本。
    1. 撕裂:使用玻璃毛细管从外侧半月板被动收集泪液。
      1. 将玻璃毛细管放在下眼睑上，注意不要接触角膜。
      2. 在 10 分钟内收集 10 μL 的泪液。
      3. 立即使用泪液或将其储存在 -20 °C。
    2. 唾液:在 1.5 mL 微量离心管中收集被动流口水的唾液
      1. 让捐赠者将唾液汇入他们的嘴里。
      2. 让供体用漏斗将口水流入试管中。
      3. 立即使用唾液或储存在 -20 °C。
  2. 在添加样品之前，将 tetraspanin 芯片放入洗芯片板中 15 分钟，使其达到室温。将芯片放入孔中时，确保芯片底部朝上，并且芯片不接触孔的侧壁。
  3. 在笔记本中记录 ID 号和芯片号，以跟踪芯片。
  4. 插入套件随附的通用串行总线 （USB），然后将带有相关套件编号的文件夹提取并保存到您选择的指定区域。
  5. 在 1.5 mL 试管中吸取 99 μL 溶液 B。
  6. 将 1 μL 生物液加入上一步制备的 1.5 mL 试管中。
  7. 旋转管子。
  8. 取 70 μL 步骤 1.6 中的溶液，移液到 tetraspanin 芯片上。
  9. 将薄膜放在芯片清洗板上，以防止样品蒸发。
  10. 在室温 （RT） 下在无振动的工作台上孵育 16 小时。

2. 第 2 天:芯片清洗

  1. 打开芯片清洗机。
  2. 从板中取出步骤 1.9 中的薄膜。
  3. 将板放入切屑垫圈中，确保其锁定到位，然后合上盖子。
    注意: 如果正确锁定到位，板不会轻易移动。
  4. 按洗屑机上的 CW-TETRA v0 选项。
  5. 选择要清洗的起始行和行数。
  6. 按芯片清洗机上的 Continue（继续 ）。
  7. 洗涤芯片时，按如下方式在试管中制备含有抗体的封闭溶液:
    1. 每个芯片准备 300 μL 封闭溶液。
    2. 每个芯片添加 0.6 μL 或每种抗体（在添加到封闭溶液中之前涡旋并旋转抗体）
    3. 涡旋封闭液 + 抗体混合物。
      注:遮光盖住封闭液 + 抗体混合物，以确保抗体稳定性。这必须在使用当天完成。
  8. 当芯片垫圈发出啁啾声时，在芯片顶部添加 250 μL 封闭溶液 + 抗体混合物。
  9. 合上盖子，然后按 Continue（继续）。
    注意:洗屑机现在将进行 1-h 孵育以及几轮额外的清洗和漂洗。
  10. 当洗屑器发出啁啾声时，取下洗屑板并将切屑向上移动。
  11. 将板放回切屑垫圈中，确保其锁定到位。合上盖子，然后按 Continue（继续）。
  12. 当洗屑机完成程序后，取出板并将芯片放在纸巾上。遮挡光线下的芯片。

3. 第 2 天:扫描芯片

  1. 打开扫描仪并打开扫描软件。
    注意:扫描仪将进行自我检查，以指示是否存在任何错误或是否可以继续扫描。
  2. 选择 Save Folder 并选择保存文件的位置。
  3. 选择 ChipFile 文件夹，然后选择在步骤 1.4 中保存的文件夹。
  4. 选择下拉选项以选择每个芯片，并将其定位在卡盘上的 Chip Position 中。对所有需要扫描的芯片重复此步骤。
  5. 单击 Chip Position （芯片位置） 下方的三个方块以打开荧光。方块将分别变为黄色、蓝色和红色。
  6. 向下按压卡盘盖并拉动，取下卡盘盖。
  7. 将芯片放在卡盘上，确保它们牢固固定。
  8. 将钉子放入孔中，重新装上卡盘盖，向下按压，然后滑动盖子以将其锁定到位。
  9. 将卡盘放在载物台上，确保其锁定到位。
  10. 选择 Scan Chips（扫描芯片）。
  11. 选择 确定。
  12. 一旦载物台完全移入机器中，请关闭门。
    注意:扫描单个芯片大约需要 12 分钟。
  13. 程序扫描完芯片后，打开门弹出载物台检查以查看扫描是否成功。
    1. 如果扫描成功，则丢弃芯片并将下一组芯片放在卡盘上，或将空卡盘放回载物台。然后，退出软件并在完成后关闭机器。
    2. 如果扫描不成功，请查看错误代码并更正错误。

4. 数据处理

  1. 打开分析软件。
  2. 选择 Prescan Data 并选择包含第 2 天步骤 3.2 中扫描的文件夹。
  3. 选择 Next（下一步）。
  4. 单击单元格并键入样品 ID，使用样品名称标记 Sample Name（样品名称 ）列中的芯片。
  5. 接下来，在 Channel Name（通道名称 ）列中标记 tetraspanins。红色 = CD63，绿色 = CD81，蓝色 = CD9。
  6. 选择 Next（下一步）。
  7. 从 Select Spot 组中选择 High CV 以检查下拉框，并通过禁用一个或两个点来关闭每个色卡的高 CV。
  8. 接下来，选择 High Count 并尝试关闭高计数警告。
    注:某些样品的计数可能过高，但仍能进行分析。
  9. 从下拉菜单中选择 所有点 ，选择 点蒙太奇，然后目视检查每个色块是否存在任何可能存在的变形或划痕。
  10. 选择 Next（下一步）。
  11. 在 CD63 通道中，将最小值设置为 300 以去除 Avg % Included 行中的红细胞;黄色细胞很好，并继续进入 CD81 通道。如果将最小值设置为 300 不会将红色单元格更改为黄色或白色，请继续执行步骤 4.14 进行故障排除。
  12. 在 CD81 通道中，将最小值设置为 300 以去除 Avg % Included 行中的红细胞;黄色细胞很好，并继续进入 CD9 通道。如果将最小值设置为 300 不会将红色单元格更改为黄色或白色，请继续执行步骤 4.14 进行故障排除。
  13. 在 CD9 通道中，将最小值设置为 400 以去除 Avg % Included 行中的红细胞;黄色单元格没有问题，请继续执行步骤 4.15。如果将最小值设置为 400 不会将红色单元格更改为黄色或白色，请继续执行步骤 4.14 进行故障排除。
  14. 故障 排除
    1. 将最小值增加 100 个单位。
    2. 如果步骤 4.14.1 不起作用，则在 Pick Chips to work on（选择要处理的筹码）部分中选择芯片，然后选择芯片。选择 Particle Count 并禁用具有高粒子计数的光斑。选择 Intensity/Size （强度/大小），选择 All Chips（所有色片），然后查看是否能解决问题。
    3. 如果步骤 4.14.2 不起作用，请在 Pick Chips to work on（选择要处理的 筹码 ）部分中选择芯片，然后选择芯片。选择 Single-Chip Cutoffs 并将最小值增加 100 个单位。然后选择 All Chips （所有条状标签 ） 以查看红色单元格现在是否为黄色。如果这不起作用，请重复此步骤，直到 Avg % Included 单元格现在为黄色或白色。
  15. 选择 Next（下一步）。
  16. 取消选择 IM 通道。
  17. 将右下角的热图值设置为包含所有粒子，然后选择 Add Plot to Report。
    1. 在下拉框中调整最大数量，然后手动输入一个值。
  18. 接下来，选择 Capture Probes 下中上部的下拉菜单，然后选择 CD63。
  19. 选择 Add Plot to Report（将绘图添加到报告 ）以将总粒子数添加到报告中。
  20. 选择 Analysis Mode （分析模式） 下的下拉菜单，选择 Colocation （共定位） 和 Add Plot to Report （将绘图添加到报告）。
  21. 接下来，选择 Size（大小），选择 Change view to Plot（将视图更改为绘图），然后选择 Add Plot to Report（将绘图添加到报表）。
  22. 最后，选择 Images 并选择 Add Plot to Report。
  23. 对 CD81 和 CD9 重复步骤 4.18–4.22，确保每次都取消选择 IM 通道。
  24. 将所有项目添加到报表后，选择 Export Report，确保它保存到正确的文件，然后选择 Folder。
    注意:Excel 文件和图像已生成，现在可用于进一步分析。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在分析芯片上的斑点时，通过观察 CD63、CD81 和 CD9 通道中荧光标记的 EV 来瞄准 EV 的最佳浓度，并且 MIgG 通道30,91 应保持黑色，因为这是如图 3A 所示的控制通道。生物液的 CD81 将减少。如果 CD63、CD81 和 CD9 通道中没有荧光，则不存在 EV（图 3B）。小心不要使芯片过度饱和（图 3C）。这将使分析软件难以计算 EV 的大小、总颗粒计数和表型的准确性。从最佳浓度的点开始，分析软件将能够测量 EV 的大小 （50-200 nm）、总颗粒计数和跨膜四蛋白表达（图 4），并将导出到单独的电子表格中以供进一步分析。四跨膜蛋白分析将包括 EV 上表面蛋白的共定位。共定位将用 "/" 表示，例如 "CD63/CD81"。这并不意味着 CD63 和 CD81 是结合的;这意味着 CD63 和 CD81 都位于 EV 的表面。

这些结果将在健康和患病样本之间提供有价值的见解。我们将能够确定健康样本或患病样本是否产生更多的 EV、更大或更小的 EV，以及 EV 的表型。这些特征中的任何一个或全部都可能在疾病的生物发生和/或进展中发挥作用。有了这些结果，我们将能够看到 tetraspanin 水平是否缺失或增加，这可以深入了解细胞过程和 EV 的形成。

figure-results-1
图 1:不同电动汽车的类型和尺寸。请单击此处查看此图的较大版本。

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图 2:跨膜四蛋白芯片如何捕获和检测 EV 的示意图。请单击此处查看此图的较大版本。

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图 3:优化 EV 浓度。 （A） EV 的最佳浓度。（B） 阴性结果:不存在 EV。（C） 电动汽车的过度饱和。 请单击此处查看此图的较大版本。

figure-results-4
图 4:纳米颗粒分析仪生成的数据。 （A） 以纳米为单位测量的 EV 直径尺寸。（B） EV 的总颗粒数。（C） EV 共定位表型。 请单击此处查看此图的较大版本。

技术优势局限性
超速离心机高纯度42,43EV 形态变化42,44
均匀性42,45需要大容量42,44,46
功能42,43昂贵的42,43
流式细胞术在多个时间点评估样品47弱信号48,49
多个端点47,50毛孔堵塞51
高通量单 EV 分析52,53
密度梯度离心生产高纯度样品54劳动密集型55,56
样品种类55,57耗时55,58 
显著的产量损失54
降水简单59,60污染36,44,61
快速61,62非特异性63
高收益44,59,62
中性 pH值 36
过滤简单64 捕获外泌体65
快速64损害大水疱36
便宜的64滤饼66,67
外泌体堵塞65

表 1:EV 隔离技术的优势和局限性。 隔离 EV 的各种方法列表，包括其优点和局限性。

技术优势局限性
动态光散射测量粒径为 1 nm 至 6 μM的颗粒 78 不适用于测量大分子量标准的复杂外泌体样品79 
下限为 10 nm，适用于单分散系统79 无法区分受污染的蛋白质和外泌体79
透射电子显微镜 （TEM）观察外泌体的形态79,80 复杂的样品制备79 
观察内部结构81 由于荧光信号夸大，无法根据大小和形状区分外泌体82 
纳米粒子跟踪分析在 10 nm 至 2 μM 范围内测量外泌体的浓度、大小和大小分布78 无法区分 EV 与蛋白质聚集体和其他污染物83 
快速样品制备和测量78,84昂贵的 NTA 仪器85 
样品可以以天然形式回收84 对振动敏感85
蛋白质印迹 （WBs）可定性和定量分析标志蛋白79,86 复杂且耗时79 
分析细胞培养基中的外泌体79 EV 分离株可能含有脂蛋白和其他污染物86 
流式细胞术更高的灵敏度和高分辨率成像耗时费力，检测限为 400 nm79,88 
区分染色的外泌体和容器87 
所需的低样品浓度79 光信号阻碍了精度和分辨率88 
外观测量外泌体上的四跨膜蛋白（CD9、CD63 和 CD81）89 不测量较大的 EV 尺寸75
测量 EV 货物蛋白90

表 2:EV 特性分析技术的优势和局限性。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

该协议中最关键的步骤是确保达到 EV 的最佳浓度。需要有足够的 EV 才能获得读数，但不能有太多的 EV 会使芯片过度饱和。确定最佳 EV 浓度的最佳方法是使用 1 μL 样品进行优化运行，看看是否需要调整浓度。另一个关键步骤是查看样品中是否有大量的细胞碎片，这可以通过在分析软件中查看芯片上的大块来确定。如果样品中有细胞碎片，则对样品进行简单的离心或过滤即可解决此问题。

另一个关键步骤是确保芯片不接触孔壁，并在将芯片放置在斜坡上时避免接触芯片的中心区域。扫描仪将从芯片中心的方块读取数据，因此必须避免用镊子接触该区域，以防止损坏 EV。

这种方法确实有一些局限性，例如仪器检测的 EV 浓度不足。可以通过干燥样品或使用浓缩管来提高浓度。另一个限制是分析软件仅测量 50-200 nm 范围内的 EV，从尺寸测量中排除了一些微泡和所有凋亡小体75。

隔离的方法有很多种（表 1 42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52， 53,54,55,56,57,58，59,60、61、62、63、64、65、66、67）并分析 EV（表 2 78、79、80、81、82、83、84、85、 86,87,88,89,90），目前 EV 分离的金标准是超速离心 36,37,38 以沉淀细胞用于 Western Blots 68,69,70 和 PCR 71,72,73,74 等测定，75,76.虽然该方案适用于大样品 42,44,46，但获取生物液可能具有挑战性，并且通常一次只能收集少量样品，这对于超速离心来说并不理想。相比之下，使用这种纳米颗粒分析仪，用户可以在低至 1 μL 的样品中生成有价值的数据，例如大小、总颗粒计数和 EV 表型，使其成为生物流体的理想选择。我们将能够从难以提取的小体积样本中扩展对 EV 的了解，这可以提高患者的舒适度，并可能找到各种疾病和病症的潜在治疗靶点。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者没有需要披露的竞争性经济利益或其他利益冲突。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们要感谢 NIH 的资助（EY031316 和 EY034714）。我们还要感谢 UNTHSC 和 NTERI 提供的实验室空间。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
ChipWasher 100NanoViewEV-CW100孵育、清洗、冲洗和干燥跨膜四蛋白芯片。此当前模型已不再可用。购买时的价格：9,995.00 美元 
ExoView 分析仪软件NanoViewN/A分析芯片信息并生成 excel 文件以供进一步分析。不再可用。
ExoView R100NanoViewEV-R100用于扫描 3 个波长的 tetraspanin 芯片。此当前模型已不再可用。购买时的价格： 110,000.00 美元
ExoView 扫描仪软件NanoViewN/A扫描 3 个不同波长的芯片。不再可用。
人跨膜四蛋白试剂盒Unchained LabsEV-TETRA-C包括 8 个跨膜四蛋白芯片、孵育溶液、封闭溶液、CD63 抗体、CD81 抗体、CD9 抗体、溶液 A、溶液 B、USB 和板盖。
可

参考文献

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