表征生物体液中的细胞外囊泡

Brenna S. Hefley; Pawan Shrestha; Brenda Vasini; Purnima Sharma; Dimitrios Karamichos

doi:10.3791/67699

方法文章

表征生物体液中的细胞外囊泡

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DOI：

10.3791/67699

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2025年2月28日

Brenna S. Hefley¹^,² , Pawan Shrestha¹^,² , Brenda Vasini¹^,² , Purnima Sharma¹^,² , Dimitrios Karamichos¹^,²^,³

¹North Texas Eye Research Institute, University of North Texas Health Science Center, ²Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, University of North Texas Health Science Center, ³Department of Pharmacology and Neuroscience, University of North Texas Health Science Center

本文内容

摘要

本文展示了从人体受试者的生物液体（如泪液和唾液）中收集的细胞外囊泡（EVs）的表征方法。该方法所使用的扫描仪能够检测仅1 µL样本中EVs的表型、大小及总颗粒数。

摘要

细胞外囊泡（EVs）是由细胞产生的一类结构，通过将生物分子从一个细胞转运至另一个细胞，参与细胞间通讯。研究表明，EVs 可在体内进行短距离和长距离运输，并具有组织特异性。EVs 不仅存在于组织中，几乎所有的体液中均可发现其存在，例如泪液、唾液、脑脊液、血液等。尽管可通过非侵入性方式从泪液和唾液中收集 EVs，但单次可采集的体积较小，可能导致难以获得足够用于蛋白质分析的 EVs。本文所述的检测仪是一种纳米颗粒分析仪，可为该问题提供解决方案这一问题，使我们能够仅用1 µL生物液体即可表征和研究细胞外囊泡（EVs）的表型、大小及总颗粒数。本方案将拓展从小体积、难获取的患者样本中获得的EVs相关知识，有助于提高患者的舒适度，并可能为多种疾病和障碍发现新的治疗靶点。

引言

细胞通过多种信号机制与邻近细胞进行通讯，其中包括释放细胞外囊泡（EVs），这些囊泡在细胞间通讯中发挥关键作用。EVs通过将遗传物质（如DNA、RNA和蛋白质）从一个细胞传递到另一个细胞来参与细胞间通讯¹^,²^,³^,⁴^,⁵。目前，EVs可分为三类：外泌体、微囊泡和凋亡小体，其分类依据主要是大小。外泌体是最小的一类，直径为30–150 nm⁶^,⁷^,⁸，由内体膜系统形成⁹^,¹⁰^,¹¹（图1）。微囊泡比外泌体更大，大小范围为100–1000 nm¹²^,¹³^,¹⁴，由质膜出芽形成¹¹^,¹²^,¹³（图1）。凋亡小体是EVs中最大的一类，大小范围为1000–5000 nm¹²^,¹⁴^,¹⁵，同样由质膜出芽形成¹²^,¹⁶^,¹⁷（图1）。除了大小之外，EVs还可根据其他生物物理特性进行分类，包括密度、分子标志物（如CD63、CD81、CD9）以及其生成机制¹⁸。EVs可在相邻细胞之间进行短距离传播，也可在体内进行长距离传播¹⁹^,²⁰^,²¹^,²²^,²³。EVs存在于多种生物体液中，例如血液²⁴^,²⁵^,²⁶、脑脊液²⁷^,²⁸^,²⁹、泪液³⁰^,³¹^,³²和唾液³³^,³⁴^,³⁵等。

迄今为止，超速离心法是分离样本中外泌体（EVs）最广为人知的方法之一³⁶^,³⁷^,³⁸。该方法需要进行多轮离心和超速离心，可通过逐步提高转速的方式，从细胞及细胞碎片中分离出外泌体。该流程通常从低速离心开始，沉淀细胞，随后进行中速离心以去除较大的囊泡，最后通过超速离心步骤沉淀外泌体¹⁸。尽管超速离心法被认为是外泌体分离的最佳方法，但仍存在一些局限性，例如会改变外泌体的形态结构³⁹^,⁴⁰^,⁴¹。另一种用于分离外泌体的技术是流式细胞术，其优势在于可实现多个时间点和终点评估，并支持高通量的单个外泌体分析。然而，流式细胞术的局限性包括但不限于孔道堵塞和信号微弱等问题。另一种常用方法是密度梯度离心法，该方法利用不同密度的介质与外泌体一同离心，从而实现比超速离心更优的分离效果。尽管该技术提高了分离纯度，但操作繁琐、耗时较长，且可能导致样品大量损失。此外，沉淀法和过滤法也可用于外泌体的分离。这两种方法操作简便、快速，但均可能导致样品污染。尽管目前存在多种外泌体分离技术，但每种方法均有其优缺点，如下所列（表1） ⁴²^,⁴³^,⁴⁴^,⁴⁵^,⁴⁶^,⁴⁷^,⁴⁸^,⁴⁹^,⁵⁰^,⁵¹^,⁵²^,⁵³^,⁵⁴^,⁵⁵^,⁵⁶^,⁵⁷^,⁵⁸^,⁵⁹^,⁶⁰^,⁶¹^,⁶²^,⁶³^,⁶⁴^,⁶⁵^,⁶⁶^,⁶⁷。

外泌体分离完成后，可进行分子检测以表征其特性。Western blot 是检测外泌体表面蛋白及携带蛋白表达的常用方法。⁶⁸^,⁶⁹^,⁷⁰ 以及采用聚合酶链式反应（PCR）检测miRNA表达水平⁷¹^,⁷²^,⁷³ 用于EVs⁷⁴^,⁷⁵^,⁷⁶这些检测方法已较为成熟，能够产生引人关注的结果。然而，这些方法的局限性在于需要从细胞外囊泡（EVs）中获取大量蛋白质或RNA才能获得可检测信号。⁷⁷，这对于起始体积较小或细胞外囊泡浓度较低的样本而言是一个问题。

本文讨论的纳米颗粒分析仪使用户能够克服表1和表2 ⁷⁸^,⁷⁹^,⁸⁰^,⁸¹^,⁸²^,⁸³^,⁸⁴^,⁸⁵^,⁸⁶^,⁸⁷^,⁸⁸^,⁸⁹^,⁹⁰中所述的诸多限制。该方法无需使用分离技术，有助于克服外泌体（EVs）得率降低的问题。该方法还允许用户仅用低至1 µL的样本体积，即可分析外泌体的表面蛋白和内容物蛋白、总外泌体数量以及外泌体大小。该过程通过使用该公司提供的四跨膜蛋白芯片实现，该芯片采用含有四跨膜蛋白抗体（CD63、CD81和CD9）的抗体微阵列，以识别溶液中的外泌体，如图2所示。荧光标记抗体可确认外泌体的存在，同时防止污染颗粒干扰实验结果。

该技术的总体目标是提供一种更省时的方法来分析细胞外囊泡（EVs），并能够利用少量样本进行EV分析。使用这种纳米颗粒分析仪，用户仅需1 µL样本即可分析颗粒的大小、总粒子数量以及表面蛋白，非常适合泪液和唾液等生物液体的分析。

方案

所有所述研究均遵循《赫尔辛基宣言》。在纳入研究前，已从每位受试者处获得书面知情同意。根据联邦和机构指南，已获得奥胡斯大学医院（1-10-72-77-14）和迪恩·麦吉研究所（1576837-2）的机构审查委员会（IRB）批准。在处理前，所有泪液和唾液样本均已去标识化。所有研究均经北德克萨斯地区机构审查委员会（#2020-030）审查并批准。以下方案遵守所有相关指南，并如上所述获得批准。

1. 第1天：样品制备与孵育

采集受试者的生物流体样本（如泪液和唾液），或从冰箱中取出样本进行解冻。
1. 泪液：使用玻璃毛细管从外侧半月处被动收集泪液。
  1. 将玻璃毛细管置于下眼睑上，注意不要触碰到角膜。
  2. 在10分钟内收集10 μL泪液体积。
  3. 立即使用泪液，或在 -20 保存 °C.
2. 唾液：用 1.5 mL 微量离心管收集被动滴流的唾液
  1. 让供体在口中积聚唾液。
  2. 让供体通过漏斗将唾液滴入试管中。
  3. 立即使用唾液，或在 -20 保存 °C.
将四次跨膜蛋白芯片放入芯片清洗板中静置15分钟，使其升至室温，然后再加入样品。放置芯片时，确保芯片编号朝下且正对上方，并避免芯片与孔壁接触。
在笔记本中记录ID编号和芯片编号，以便追踪芯片。
插入试剂盒附带的通用串行总线（USB），并将带有相应试剂盒编号的文件夹提取并保存至您选择的指定位置。
在1.5 mL离心管中加入99 μL的溶液B。
将1 μL生物流体加入上一步准备好的1.5 mL离心管中。
离心收集管中的样品。
从步骤1.6中取70 μL溶液，用移液器将溶液加至四跨膜蛋白芯片上。
将薄膜置于芯片清洗板上，以防止样品蒸发。
在室温（RT）下振荡孵育 16 小时–自由工作台

2. 第2天：芯片清洗

打开芯片清洗机。
从孔板上取下步骤 1.9 中的封膜。
将孔板放入芯片清洗机中，确保其牢固锁定，并盖上盖子。
注意：若已正确锁定，孔板将不易移动。
在芯片清洗机上按下 CW-TETRA v0 选项。
选择起始行及需要清洗的行数。
按下芯片清洗机上的继续按钮。
在芯片清洗过程中，按以下步骤在离心管中配制含抗体的封闭液：
1. 每张芯片准备 300 µL 封闭液。
2. 每张芯片加入 0.6 µL 的每种抗体（加入封闭液前需涡旋振荡并短暂离心抗体）。
3. 涡旋振荡封闭液与抗体混合液。
  注意：需避光保存封闭液与抗体混合液，以确保抗体稳定性。该溶液必须在使用当天配制。
当芯片清洗机发出提示音时，向芯片表面加入 250 µL 封闭液与抗体混合液。
盖上盖子，按下继续按钮。
注意：芯片清洗机将开始进行 1 小时的孵育，并随后进行多轮清洗和漂洗。
当芯片清洗机发出提示音时，取出芯片清洗板，将芯片沿斜坡向上移动。
将孔板重新放回芯片清洗机中，确保其牢固锁定。盖上盖子并按下继续按钮。
当芯片清洗机完成程序后，取出孔板并将芯片放置在纸巾上。避免光照芯片。

3. 第2天：扫描芯片

打开扫描仪并启动扫描软件。
注意：扫描仪将进行自检，以提示是否存在任何错误或是否可以继续扫描。
选择 保存文件夹，并指定文件保存位置。
选择 ChipFile 文件夹，并选择步骤 1.4 中保存的文件夹。
通过下拉选项选择每张芯片，并在卡盘上的 芯片位置 处定位。对所有需要扫描的芯片重复此步骤。
单击 芯片位置 下方的三个方块以开启荧光，方块将分别变为黄色、蓝色和红色。
按下盖子并将其拉出，以取下卡盘盖。
将芯片放置在卡盘上，确保其牢固固定。
将卡盘盖重新安装，将定位销插入孔中，向下按压，并滑动盖子使其锁定到位。
将卡盘放置到载物台上，确保其锁定到位。
选择 扫描芯片。
选择确定。
当载物台完全进入仪器内部后，关闭门。
注意：扫描单张芯片大约需要 12 分钟。
程序完成芯片扫描后，打开门以弹出载物台，检查扫描是否成功。
1. 如果扫描成功，丢弃芯片，并将下一组芯片放置到卡盘上，或把空卡盘放回载物台。然后退出软件，并在完成后关闭仪器。
2. 如果扫描失败，请查看错误代码并纠正错误。

4. 数据处理

打开分析软件。
选择 预扫描数据 并选择包含第2天步骤3.2扫描结果的文件夹。
选择 下一步。
标记芯片 样本名称 通过单击单元格并输入样本编号，在列中填写样本名称。
接下来，标记四跨膜蛋白中的 频道名称 柱状图。红色 = CD63，绿色 = CD81，蓝色 = CD9。
选择 下一步.
选择 高变异系数 来自 选择斑点组 检查下拉框，并通过禁用一个或两个位点来关闭每个芯片的高变异系数（CVs）。
接下来，选择 高计数 并尝试关闭高计数警告。
注意：某些样本的计数值可能过高，但仍可进行分析。
选择 所有斑点 从下拉菜单中选择 斑点拼接图，并目视检查每张芯片是否存在可能的变形或划痕。
选择 下一步.
在 CD63 通道中，将最小值设为 300 以去除红细胞 平均百分比 % 包含该行；黄色细胞正常，继续进行CD81通道检测。若将最小值设为300后，红色细胞仍未变为黄色或白色，请转至步骤4.14进行故障排查。
在 CD81 通道中，将最小值设为 300 以去除红细胞 平均百分比 包含该行；黄色细胞正常，继续进行CD9通道检测。若将最小值设为300后，红色细胞仍未变为黄色或白色，请转至步骤4.14进行故障排查。
在 CD9 通道中，将最小值设为 400 以去除红细胞 平均百分比 % 包含该行；黄色单元格正常，继续执行步骤4.15。若将最小值设为400后红色单元格仍未变为黄色或白色，请转至步骤4.14进行故障排查。
故障排除
1. 将最小值增加100个单位。
2. 如果步骤 4.14.1 未成功，则选择芯片中的 挑选芯片 进行切片区段并选择芯片。选择 颗粒计数 并禁用粒子计数较高的区域。选择 强度/大小，选择 所有芯片， 并查看此操作是否解决了问题。
3. 如果步骤 4.14.2 未成功，请选择芯片中的 挑选芯片 进行切片区段并选择芯片。选择 单芯片截断值 并将最小值增加100个单位。然后选择 所有芯片 观察红细胞是否已变为黄色。如果此步骤无效，重复操作直至达到预期效果。 平均百分比 包含的细胞现在呈黄色或白色。
选择 下一步.
取消选择 IM 通道。
将右下角的热图值设置为包含所有颗粒，然后选择 将图表添加到报告.
1. 在下拉框中调整最大数值，并手动输入一个值。
接下来，选择顶部中央下方的下拉菜单 捕获探针 并选择 CD63.
选择添加 绘图以报告 将总颗粒数添加到报告中。
选择下拉菜单–下拉菜单下方 分析模式，选择 共定位，以及 将图表添加到报告.
接下来，选择大小，选择 切换视图为图表，并选择 将图表添加到报告.
最后，选择图像并选择 将图表添加到报告.
对 CD81 和 CD9 重复步骤 4.18–4.22，每次确保取消选择 IM 通道。
所有物品添加到报告后，选择 导出报告，确保其保存到正确的文件，然后选择 文件夹.
注意：Excel 文件和图像已生成，现在可用于进一步分析。

结果

分析芯片上的信号点时，应通过观察 CD63、CD81 和 CD9 通道中荧光标记的 EVs 来确定 EVs 的最佳浓度，而 MIgG 通道³⁰^,⁹¹ 应保持无信号，因其为对照通道，如图 3A所示。对于生物体液，CD81 信号会有所降低。若在 CD63、CD81 和 CD9 通道中均未检测到荧光信号，则表明缺乏 EVs（图 3B）。需注意避免芯片信号过饱和（图 3C），否则分析软件将难以准确计算 EVs 的粒径、总颗粒数及表型特征。在最佳浓度的信号点基础上，分析软件可测定 EVs 的粒径（50–200 nm）、总颗粒数以及四跨膜蛋白的表达情况（图 4），并导出至单独的电子表格中以供进一步分析。四跨膜蛋白分析将包括 EVs 表面蛋白的共定位情况，共定位以“/”表示，例如“CD63/CD81”。此处“/”并非表示 CD63 与 CD81 相结合，而是指 CD63 和 CD81 均存在于 EVs 的表面。

这些结果将为健康样本与病变样本之间的差异提供有价值的见解。我们将能够确定健康样本或病变样本是否产生更多的细胞外囊泡（EVs）、更大或更小的细胞外囊泡，以及细胞外囊泡的表型特征。这些特征中任何一项或全部都可能在疾病的发生和/或进展中发挥作用。通过这些结果，我们将能够观察到四跨膜蛋白（tetraspanin）水平是否存在缺失或升高，从而深入了解细胞过程及细胞外囊泡的形成机制。

细胞分泌示意图；外泌体、微囊泡、凋亡小体的大小，纳米尺度。
图 1：不同细胞外囊泡（EVs）的类型与大小。 请点击此处查看本图的放大版本。

抗体结合示意图，包含病毒颗粒；免疫反应；分子相互作用可视化。
图 2：四跨膜蛋白芯片捕获和检测细胞外囊泡（EVs）的示意图。 请点击此处查看该图的放大版本。

外泌体标志物荧光分析；最佳浓度、阴性结果、过饱和；显微镜结果。
图 3：优化细胞外囊泡（EV）浓度。（A）EV 的最佳浓度。（B）阴性结果：无 EV 存在。（C）EV 过饱和。请点击此处查看此图的放大版本。

细胞外囊泡分析；粒径、浓度、四跨膜蛋白表达；对比图表。
图4：纳米颗粒分析仪生成的数据。（A）以纳米为单位测量的EV粒径。（B）EV的总粒子数。（C）EV共定位表型。请点击此处查看该图的高清版本。

技术	优点	局限性
超速离心	高纯度^42,43	改变细胞外囊泡（EV）形态^42,44
	均一性^42,45	需要大体积样品^42,44,46
	功能完整性^42,43	成本昂贵^42,43
流式细胞术	可在多个时间点评估样品⁴⁷	信号弱^48,49
	多终点检测^47,50	孔道堵塞⁵¹
	高通量单个EV分析^52,53
密度梯度离心	可获得高纯度样品⁵⁴	操作繁琐^55,56
	适用于多种样品类型^55,57	耗时较长^55,58
		得率显著降低⁵⁴
沉淀法	操作简单^59,60	易受污染^36,44,61
	快速^61,62	非特异性沉淀⁶³
	高得率^44,59,62
	中性pH³⁶
过滤法	操作简单⁶⁴	截留外泌体⁶⁵
	快速⁶⁴	损伤大体积囊泡³⁶
	成本低⁶⁴	滤饼形成^66,67
		外泌体堵塞⁶⁵

表1：EV分离技术的优点与局限性。 各种EV分离方法的列表，包括其优点和局限性。

技术	优点	局限性
动态光散射	可测量尺寸范围为 1 nm 至 6 µM 的颗粒⁷⁸	不适用于粒径分布范围较大的复杂外泌体样品的测量⁷⁹
	下限为 10 nm，适用于单一分散体系⁷⁹	无法区分外泌体与污染蛋白⁷⁹
透射电子显微镜（TEM）	可观察外泌体的形态^79,80	样品制备过程复杂⁷⁹
	可观察内部结构⁸¹	由于荧光信号被放大，无法根据大小和形状区分外泌体⁸²
纳米颗粒追踪分析	可测量 10 nm 至 2 µM 范围内外泌体的浓度、尺寸及尺寸分布⁷⁸	无法区分细胞外囊泡（EVs）与蛋白聚集体及其他污染物⁸³
	样品制备和检测速度快^78,84	NTA 仪器价格昂贵⁸⁵
	样品可回收并保持天然状态⁸⁴	对振动敏感⁸⁵
Western Blot（WB）	可对外泌体标志蛋白进行定性和定量分析^79,86	操作复杂且耗时⁷⁹
	适用于分析细胞培养基中外泌体⁷⁹	分离得到的 EV 可能含有脂蛋白及其他污染物⁸⁶
流式细胞术	具有更高的灵敏度和高分辨率成像能力，	检测过程耗时且繁琐，检测下限为 400 nm^79,88
流式细胞术	可区分染色的外泌体与污染物⁸⁷	检测过程耗时且繁琐，检测下限为 400 nm^79,88
	所需样品浓度低⁷⁹	光学信号会干扰检测的准确性和分辨率⁸⁸
Exoview	可检测外泌体上的四跨膜蛋白（Tetraspanins，如 CD9、CD63 和 CD81）⁸⁹	无法检测较大尺寸的细胞外囊泡（EV）⁷⁵
	可检测 EV 的 cargo 蛋白⁹⁰

表2：EV表征技术的优点与局限性。

讨论

本方案中最关键的步骤是确保达到细胞外囊泡（EVs）的最佳浓度。EVs 的数量需足够以获得有效读数，但又不能过多，以免导致芯片过饱和。确定最佳 EV 浓度的最佳方法是使用 1 µL 样本进行一次优化实验，观察是否需要调整浓度。另一个关键步骤是检查样本中是否存在大量细胞碎片，这可通过分析软件中芯片上出现的大块物质来判断。如果样本中含有细胞碎片，可通过简单的离心或过滤处理来解决此问题。

另一个关键步骤是在将芯片沿斜坡放置时，确保芯片不接触孔壁，并避免触碰芯片的中心区域。扫描仪将从芯片中央的方块区域读取信号，因此必须避免用镊子接触该区域，以防干扰外泌体（EVs）。

该方法确实存在一些局限性，例如仪器检测时囊泡浓度过低。可通过干燥样品或使用浓缩管来提高浓度。另一局限性在于分析软件仅能测量50-200 nm范围内的囊泡，因此部分微囊泡及所有凋亡小体均被排除在粒径测量之外⁷⁵。

分离细胞外囊泡（EV）的方法有多种（表1 ⁴²^,⁴³^,⁴⁴^,⁴⁵^,⁴⁶^,⁴⁷^,⁴⁸^,⁴⁹^,⁵⁰^,⁵¹^,⁵²^,⁵³^,⁵⁴^,⁵⁵^,⁵⁶^,⁵⁷^,⁵⁸^,⁵⁹^,⁶⁰^,⁶¹^,⁶²^,⁶³^,⁶⁴^,⁶⁵^,⁶⁶^,⁶⁷），分析EV的方法也多种多样（表2 ⁷⁸^,⁷⁹^,⁸⁰^,⁸¹^,⁸²^,⁸³^,⁸⁴^,⁸⁵^,⁸⁶^,⁸⁷^,⁸⁸^,⁸⁹^,⁹⁰），目前EV分离的金标准是超速离心法³⁶^,³⁷^,³⁸，用于将细胞沉淀下来，以便进行如Western印迹⁶⁸^,⁶⁹^,⁷⁰和PCR⁷¹^,⁷²^,⁷³^,⁷⁴^,⁷⁵^,⁷⁶等检测。尽管该方法适用于大体积样本⁴²^,⁴⁴^,⁴⁶，但获取生物体液往往较为困难，通常每次只能收集到少量样本，这并不适合超速离心法。相比之下，使用这种纳米颗粒分析仪仅需1 µL样本即可获得有关EV大小、总颗粒数及表型等有价值的数据，因此特别适用于生物体液的分析。我们将能够利用难以提取的微量样本进一步拓展对EV的认识，这不仅可提高患者的舒适度，还可能发现多种疾病和障碍的潜在治疗靶点。

披露

作者声明无竞争性财务利益或其他利益冲突。

致谢

我们感谢美国国立卫生研究院（NIH）提供的资助（EY031316 和 EY034714）。我们还要感谢北德克萨斯健康科学中心（UNTHSC）和 NTERI 提供的实验室空间。

材料

本文使用的材料清单
姓名	公司	目录编号	评论
ChipWasher 100	NanoView	EV-CW100	用于孵育、洗涤、漂洗并干燥四跨膜蛋白芯片。此型号目前已不再供应。购买时价格：$9,995.00
ExoView Analyzer 软件	NanoView	N/A	分析芯片信息并生成可用于进一步分析的 Excel 文件。此产品目前已不再供应。
ExoView R100	NanoView	EV-R100	用于在三个不同波长下扫描四跨膜蛋白芯片。此型号目前已不再供应。购买时价格： $110,000.00
ExoView Scanner 软件	NanoView	N/A	在三个不同波长下扫描芯片。此产品目前已不再供应。
人源四跨膜蛋白检测试剂盒	Unchained Labs	EV-TETRA-C	包含 8 个四跨膜蛋白芯片、孵育液、封闭液、CD63 抗体、CD81 抗体、CD9 抗体、溶液 A、溶液 B、USB 数据线和板盖。

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表征生物体液中的细胞外囊泡

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