胃黏膜定量聚合酶链式反应分析用于检测幽门螺杆菌及抗生素耐药性

摘要

快速且准确的幽门螺杆菌（H. pylori）检测及耐药性测试方法对于临床实践中高效根除H. pylori具有重要意义。本方案旨在介绍一种特异性方法，即通过胃黏膜定量聚合酶链式反应（qPCR）实现H. pylori的快速检测及其对抗生素耐药性的分析。

摘要

Helicobacter pylori 是一种主要病原体，感染了全球近一半人口，且由于其对抗生素的耐药性日益增强，正对公共健康构成威胁。此外，Helicobacter pylori 还可导致慢性胃炎、胃和十二指肠溃疡、胃癌以及胃黏膜相关淋巴组织（MALT）淋巴瘤。因此，及时准确地诊断 H. pylori 感染并确定其抗生素耐药性至关重要。目前，H. pylori 诊断的现有方法 主要包括快速尿素酶试验（RUT）、尿素呼气试验（UBT）、血清抗体检测、抗原检测、胃镜检查以及细菌培养。然而，前五种检测方法无法获得可培养的细菌，更不用说进行耐药性检测。细菌培养耗时较长，且抗生素敏感性试验难以快速、常规开展。在临床实践中，快速而准确地鉴定 H. pylori 及其对抗生素的敏感性，对于有效根除该菌至关重要。本实验方案旨在概述一种针对胃黏膜样本的定量聚合酶链式反应（qPCR）技术，以加快 H. pylori 的诊断并评估其对抗菌药物的耐药性。qPCR 可用于检测 H. pylori 感染相关的 ureA 基因，以及分别与克拉霉素和喹诺酮类耐药相关的 23S rRNA 和 gyrA 基因突变。目前，由于缺乏标准化操作流程，胃黏膜样本的 qPCR 检测仍面临挑战。因此，有必要共享包含详细实验步骤的方法学信息，以确保实验流程的准确传达，推动形成可提高透明度的金标准操作规范。总体而言，本方案通过应用定量聚合酶链式反应（qPCR）技术，为评估 H. pylori 感染及其抗生素耐药性提供了一种经济、快速的替代传统方法的新途径。

引言

H. pylori 是一种革兰氏阴性细菌，可在低氧环境下存活。该生物属于多个不同的遗传种群，具有高度的遗传多样性。尽管该生物通常呈螺旋状，但也可转变为杆状¹它是主要病原体之一，感染了全球近50%的人口²通常，感染发生在患者儿童期保持为健康携带者状态，症状在成年后才显现。已有报道称其与慢性胃炎、胃及十二指肠溃疡、胃癌以及胃黏膜相关淋巴组织（MALT）淋巴瘤相关³表现形式的差异 H. pylori 感染可能源于不同细菌菌株的致病因子，以及宿主自身的特性及其饮食模式⁴研究表明，吸烟和饮酒的男性感染疾病的风险更高 H. pylori 感染⁵消除的有效性 H. pylori 多项研究已证实其在预防胃癌及癌前病变方面的效果^6,7因此， H. pylori 世界卫生组织（WHO）国际癌症研究机构建议将根除作为一项预防措施⁸.

快速而准确地诊断H. pylori感染是大多数无症状消化不....

方案

本研究遵循中国广州南方医科大学广东省人民医院伦理委员会制定的伦理准则（批准文号：KY2024-1115-01）。纳入年龄在18至60岁之间的患者。若受试者在检测前2周内曾使用抗生素、抗菌类草药、质子泵抑制剂（PPIs）或H₂受体拮抗剂，则被排除于本研究之外。此外，近3个月内接受过抗H. pylori治疗，或患有严重心、肝、肾疾病，重度神经病变或精神障碍的个体亦不符合参与条件。存在胃镜检查禁忌证者（如胃肠道穿孔、高龄、生命体征不稳定等）亦被排除。本研究未纳入妊娠期或哺乳期女性。受试者的知情同意书主要包括以下内容：（1）研究背景与目的；（2）哪些人群不适合参与本研究项目？（3）参与研究的要求有哪些？（4）参与研究可能带来的益处；（5）可能发生的不良反应、风险及不适；（6）隐私保护措施；（7）受试者权利；（8）受试者声明；（9）研究者声明等。

1. 胃黏膜取样

1. 采样耗材的准备
   1. 准备含有保存液的采样管。
   2. 准备胃镜活检钳。
2. 采样对象的准备
   1. 采集慢性胃炎、胃溃疡、十二指肠溃疡、胃癌或疑似患者的标本。采集过程中需遵循无菌操作规程。
      注：所采集的标本包括来自患者或疑似患者的胃黏膜组织。
   2. 确认用药史。
      1. 确保患者在4周....

结果

通过qPCR评估胃组织中H. pylori感染及抗生素耐药性
用于鉴定H. pylori的qPCR检测通过靶向ureA基因进行，而抗生素耐药性则通过检测23S rRNA和gyrA基因中的特异性突变来确定（表1）。所有三组样本的CT值所反映的质量控制数据均处于可接受范围内，表明样本在检测时处于标准状态，从而保证了结果的可信度。本研究选取了五份结果各异的样本（标记为A、B、C、E和F），以验证实验设计的可靠性（图2）。样本“A”H. pylori检测呈阳性，其CT值仅在H. pylori可检出范围内，提示该患者对两种抗生素均敏感，使用任一药物均可能获得良好疗效。样本“B”所有检测参数的CT值均在可检出范围内，表明H. pylori感染阳性，且对克拉霉素和左氧氟沙星均耐药；对此类情况，建议临床医生考虑其他治疗方案。样本.......

讨论

传统的检测方法，如快速尿素酶试验（RUT）、尿素呼气试验（UBT）、组织学检查、培养以及血清学方法，已被用于H. pylori的检测。每种诊断方法在不同临床背景下均具有各自的优势和特定的局限性¹⁷。从胃黏膜活检样本中培养H. pylori通常被视为诊断的金标准。然而，该方法耗时耗力，且其准确性受限于技术难题、培养所需条件以及细菌浓度可能较低等因素。另一方面，组织病理学检查具有较高的敏感性和特异性，但细菌浓度及染色方法的选择会直接影响组织学评估结果¹⁸。与传统H. pylori检测方法的局限性相比，分子诊断技术可有效绕过培养步骤，显著缩短检测时间¹⁹。

此外，日益升高的耐药率已严重影响了根除治疗的效果。目前，克拉霉素是根除H. pylori的关键抗生素。然而，当存在耐药性时，治疗成功的可能性急剧下降，导致该抗生素失效，同时仍会促进其他细菌种类耐药性的产生。一种可能的策略是.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
浴槽培养箱	ALLSHENG	MK2000-2	提供恒温环境
生物安全柜	海尔	HR1500-B2
离心机	赛默飞世尔科技	THERMO ST16R	离心去除管壁残留液体
Chelex-100	sigma	C7901	树脂
胃镜活检钳	Boston Scientific Corporation		胃黏膜取样
幽门螺杆菌 23S rRNA 基因和 gyrA 基因突变检测试剂盒	江苏默乐生物科学	CFDA 20223400137	用于 H. pylori 及耐药基因（克拉霉素和喹诺酮类）的qPCR检测试剂盒
核酸提取试剂	江苏默乐生物科学	SEDA 20150076	用于DNA提取
SDS 软件	Applied Biosystems	7300/7500	数据分析
热循环仪	赛默飞世尔科技	ABI 7500	用于幽门螺杆菌及耐药基因（克拉霉素和喹诺酮类）的qPCR检测
涡旋混合器	JOANLAB	VM-5005	用于试剂混匀