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方法文章

胃黏膜定量聚合酶链式反应分析用于检测幽门螺杆菌及抗生素耐药性

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DOI：

10.3791/67704

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2025年3月7日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory Medicine, Guangdong Provincial People's Hospital (Guangdong Academy of Medical Sciences), Southern Medical University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

快速且准确的幽门螺杆菌（H. pylori）检测及耐药性测试方法对于临床实践中高效根除H. pylori具有重要意义。本方案旨在介绍一种特异性方法，即通过胃黏膜定量聚合酶链式反应（qPCR）实现H. pylori的快速检测及其对抗生素耐药性的分析。

摘要

Helicobacter pylori 是一种主要病原体，感染了全球近一半人口，且由于其对抗生素的耐药性日益增强，正对公共健康构成威胁。此外，Helicobacter pylori 还可导致慢性胃炎、胃和十二指肠溃疡、胃癌以及胃黏膜相关淋巴组织（MALT）淋巴瘤。因此，及时准确地诊断 H. pylori 感染并确定其抗生素耐药性至关重要。目前，H. pylori 诊断的现有方法 主要包括快速尿素酶试验（RUT）、尿素呼气试验（UBT）、血清抗体检测、抗原检测、胃镜检查以及细菌培养。然而，前五种检测方法无法获得可培养的细菌，更不用说进行耐药性检测。细菌培养耗时较长，且抗生素敏感性试验难以快速、常规开展。在临床实践中，快速而准确地鉴定 H. pylori 及其对抗生素的敏感性，对于有效根除该菌至关重要。本实验方案旨在概述一种针对胃黏膜样本的定量聚合酶链式反应（qPCR）技术，以加快 H. pylori 的诊断并评估其对抗菌药物的耐药性。qPCR 可用于检测 H. pylori 感染相关的 ureA 基因，以及分别与克拉霉素和喹诺酮类耐药相关的 23S rRNA 和 gyrA 基因突变。目前，由于缺乏标准化操作流程，胃黏膜样本的 qPCR 检测仍面临挑战。因此，有必要共享包含详细实验步骤的方法学信息，以确保实验流程的准确传达，推动形成可提高透明度的金标准操作规范。总体而言，本方案通过应用定量聚合酶链式反应（qPCR）技术，为评估 H. pylori 感染及其抗生素耐药性提供了一种经济、快速的替代传统方法的新途径。

引言

H. pylori 是一种革兰氏阴性细菌，可在低氧环境下存活。该生物属于多个不同的遗传种群，具有高度的遗传多样性。尽管该生物通常呈螺旋状，但也可转变为杆状1它是主要病原体之一，感染了全球近50%的人口2通常，感染发生在患者儿童期保持为健康携带者状态，症状在成年后才显现。已有报道称其与慢性胃炎、胃及十二指肠溃疡、胃癌以及胃黏膜相关淋巴组织（MALT）淋巴瘤相关3表现形式的差异 H. pylori 感染可能源于不同细菌菌株的致病因子，以及宿主自身的特性及其饮食模式4研究表明，吸烟和饮酒的男性感染疾病的风险更高 H. pylori 感染5消除的有效性 H. pylori 多项研究已证实其在预防胃癌及癌前病变方面的效果6,7因此， H. pylori 世界卫生组织（WHO）国际癌症研究机构建议将根除作为一项预防措施8.

快速而准确地诊断H. pylori感染是大多数无症状消化不良患者治疗过程中的关键环节。对H. pylori的诊断包括侵入性和非侵入性方法的结合。侵入性技术通常包括用于直接观察的内镜检查、组织样本的组织学分析、检测细菌活性的快速尿素酶试验（RUT）以及细菌培养。另一方面，非侵入性策略包括尿素呼气试验（UBT），用于测量细菌代谢活动；粪便抗原试验（SAT），用于检测粪便中的细菌蛋白；血清学检测，用于检测血液中的抗体；以及利用遗传物质进行检测的分子诊断技术。尽管这些诊断方法各自具有特定的优势和局限性，但在临床实践中，目前尚无任何一种方法被普遍认可为金标准9。

目前，H. pylori 感染的主要治疗方法是使用抗生素。然而，由于多种因素的影响，旨在根除 H. pylori 的抗菌治疗成功率正在下降。治疗失败的主要原因被认为包括细菌对抗菌药物的耐药性以及患者对治疗方案的依从性不足10。其中，对克拉霉素耐药的 H. pylori 菌株已受到广泛研究关注11。此类耐药现象在多个国家的发生率呈上升趋势。H. pylori 的耐药性主要源于 23S rRNA 基因可变区的突变，导致核糖体发生构象改变，从而改变了克拉霉素的结合位点，削弱了 H. pylori 与克拉霉素之间的亲和力，阻碍了细菌蛋白质合成的抑制过程12。在 23S rRNA 基因的 2.9 kb 片段中，A2143G、A2142G 和 A2142C 位点的突变已被证实可导致对克拉霉素的耐药性。氟喹诺酮类药物耐药性的扩散也已成为多项研究的重点。已有研究报道，中国对左氧氟沙星的耐药率为 34.5%，意大利为 22.1%13。喹诺酮类药物主要通过抑制 H. pylori 拓扑异构酶 II 的活性，影响 DNA 的合成、复制及二级结构，从而实现抗菌作用。若编码拓扑异构酶亚基的 gyrA 和 gyrB 基因发生突变，将阻碍左氧氟沙星等抗生素与该酶的结合，导致无法抑制 H. pylori 基因组的复制，进而引发耐药性。其中，gyrA 基因的突变热点主要集中于第 87 和 91 位氨基酸，而 gyrB 基因的突变相对较少，且常伴随 gyrA 基因的突变发生14。左氧氟沙星耐药基因的突变位点主要包括位于 gyrA 基因内的六个突变位点（A260T、C261A、T261G、G271A、G271T、A272G）。由基因改变引起的耐药机制的明确，推动了 H. pylori 检测方法逐步从基于培养的技术向分子诊断技术转变。

尿素呼气试验（UBT）和血清学检测（SAT）是最常选用的非侵入性检测方法，但它们无法提供药物敏感性信息。因此，在临床实践中，开发一种快速且全面的技术以检测幽门螺杆菌（H. pylori）并评估其对药物的耐药性，对于有效根除该病原体至关重要15。在分子检测技术中，定量聚合酶链式反应（qPCR）已取得显著进展。与常规PCR不同，qPCR无需进行凝胶电泳，通过在退火阶段引入特异性引物和探针，可实现对DNA或RNA的精确定量。目前市售的qPCR试剂盒已具备识别幽门螺杆菌（H. pylori）感染及其药物耐药性的能力16。

目前临床上迫切需要一种既高效又全面的诊断方法，能够同时检测H. pylori感染并评估其耐药性。我们采用胃黏膜qPCR分析，结合不同的引物探针，用于H. pylori的检测及其抗生素耐药性的判断。

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方案

本研究遵循中国广州南方医科大学广东省人民医院伦理委员会制定的伦理准则（批准文号：KY2024-1115-01）。纳入年龄在18至60岁之间的患者。若受试者在检测前2周内曾使用抗生素、抗菌类草药、质子泵抑制剂（PPIs）或H2受体拮抗剂，则被排除于本研究之外。此外，近3个月内接受过抗H. pylori治疗，或患有严重心、肝、肾疾病，重度神经病变或精神障碍的个体亦不符合参与条件。存在胃镜检查禁忌证者（如胃肠道穿孔、高龄、生命体征不稳定等）亦被排除。本研究未纳入妊娠期或哺乳期女性。受试者的知情同意书主要包括以下内容：（1）研究背景与目的；（2）哪些人群不适合参与本研究项目？（3）参与研究的要求有哪些？（4）参与研究可能带来的益处；（5）可能发生的不良反应、风险及不适；（6）隐私保护措施；（7）受试者权利；（8）受试者声明；（9）研究者声明等。

1. 胃黏膜取样

  1. 采样耗材的准备
    1. 准备含有保存液的采样管。
    2. 准备胃镜活检钳。
  2. 采样对象的准备
    1. 采集慢性胃炎、胃溃疡、十二指肠溃疡、胃癌或疑似患者的标本。采集过程中需遵循无菌操作规程。
      注：所采集的标本包括来自患者或疑似患者的胃黏膜组织。
    2. 确认用药史。
      1. 确保患者在4周内未服用针对幽门螺杆菌（H. pylori）的抗生素和铋剂，且在2周内未使用抑酸药物。
      2. 要求正在服用抗凝药物（如华法林、阿司匹林、氯吡格雷等）的患者停药5–7天。
  3. 标本采集
    1. 采样部位
      1. 根据新悉尼系统的要求，从胃窦、胃体大弯和小弯以及胃角共5个部位取活检组织。具体部位见图1：幽门环近端2–3 cm处胃窦小弯（A1）和大弯（A2）；距贲门4 cm处胃体小弯（B1）和距贲门8 cm处胃体大弯（B2）；胃角（IA）。
      2. 根据《中国消化内镜活检与病理检查规范化专家共识（草案）》，从距幽门5 cm处的胃窦小弯（靠近胃角）或胃角大弯处取活检组织（取1–2块）。
    2. 特殊标本采集部位说明
      1. 对于正在接受任何治疗的患者，在停药4周后，同时采集胃窦和胃体组织。
      2. 对于胃癌患者，采集胃大弯侧的组织，但不采集肿瘤组织。
      3. 对于胃溃疡患者，采集胃窦和胃溃疡边缘组织，避免采集溃疡底部组织。
      4. 对于萎缩性胃炎患者，采集胃窦和胃体组织，避免在胃黏膜萎缩区和肠上皮化生区域取样。
    3. 采样步骤
      1. 打开活检钳阀门，将其缓慢送至操作手侧。当活检钳头部进入视野后，打开钳瓣，操控内镜至采样部位的胃黏膜处。
      2. 施加轻微压力，闭合活检钳，夹取胃黏膜组织（直径：0.5–1 mm，约5–10 mg/块）。将钳取的组织样本放入采样管（含保存液）中，完成该部位取样。
      3. 继续完成其他部位的采样，并将所有样本置于同一采样管（含保存液）中。
      4. 完成全部部位采样后，拧紧采样管盖并密封，防止干燥。在管外标注唯一的识别编号。
      5. 尽快送检所采集的样本。样本在室温（RT）下放置不得超过24小时。长途运输过程中应避免临床标本反复冻融。若无法保证-20 ± 5 °C的温度条件，应于0–8 °C运输。样本可在-20 ± 5 °C条件下保存五个月；如需长期保存，应置于-70 °C以下。
    4. 注意事项
      1. 采样时应尽量将活检钳压深，以获取完整的黏膜全层组织。
      2. 取出活检钳并打开钳口时动作应轻柔，防止黏膜撕裂。

2. 核酸提取

  1. 提前将金属浴温度调节至 100 °C；若样品为冷冻状态，需取出并恢复至室温。
  2. 充分混匀裂解液，使亚氨基二乙酸树脂悬浮均匀。取 100 µL 裂解液加入带有滤芯的离心管中，或将胃黏膜组织直接放入离心管，加入 200 µL 裂解液，并通过涡旋振荡充分混匀。
  3. 将离心管置于 100 °C 的金属浴中加热 10 分钟，随后取出并冷却至室温。
  4. 在 9500 g 条件下离心 5–10 分钟。小心吸取上清液至另一支无菌离心管中，并做好标记。
  5. 立即进行后续实验，或暂时保存于 4 °C 待检。

3. qPCR检测 H. pylori 以及耐药基因（克拉霉素和喹诺酮类）

  1. 从试剂盒中取出引物探针、混合酶溶液和检测试剂。将所有组分在冰上或2-8 °C条件下融化，并轻轻振荡混匀，然后低速瞬时离心。
  2. 取12.5 µL检测试剂 + 7.0 µL引物探针 + 0.5 µL酶溶液混合。先计算各试剂所需用量，加入适当体积的离心管中，充分混匀后短暂离心。
    注意：PCR反应体系总量应根据检测样本数量，以及一个强阳性对照、一个弱阳性对照、一个阴性对照和一个PCR阴性对照的总数进行计算。
  3. 配置好PCR反应液后，向每个PCR反应孔中加入20.0 µL PCR反应液。然后向含有PCR反应液的PCR反应孔中加入5.0 µL核酸。PCR阴性对照孔中不加任何样本或核酸。
  4. 将反应管放入荧光PCR扩增仪中，设置循环参数如下：首先在42 °C和95 °C下加热反应体系2 min；其次在95 °C变性10 s，在58 °C退火并延伸45 s，共循环40次。
  5. 在58 °C时收集FAM（23S rRNA基因突变）、HEX/VIC（gyrA基因突变）、ROX（H. pylori）和CY5（内标）的荧光信号及数据。
  6. 反应结束后保存数据，并使用特异性qPCR软件进行分析。

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结果

通过qPCR评估胃组织中H. pylori感染及抗生素耐药性
用于鉴定H. pylori的qPCR检测通过靶向ureA基因进行，而抗生素耐药性则通过检测23S rRNA和gyrA基因中的特异性突变来确定（表1）。所有三组样本的CT值所反映的质量控制数据均处于可接受范围内，表明样本在检测时处于标准状态，从而保证了结果的可信度。本研究选取了五份结果各异的样本（标记为A、B、C、E和F），以验证实验设计的可靠性（图2）。样本“A”H. pylori检测呈阳性，其CT值仅在H. pylori可检出范围内，提示该患者对两种抗生素均敏感，使用任一药物均可能获得良好疗效。样本“B”所有检测参数的CT值均在可检出范围内，表明H. pylori感染阳性，且对克拉霉素和左氧氟沙星均耐药；对此类情况，建议临床医生考虑其他治疗方案。样本...

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讨论

传统的检测方法，如快速尿素酶试验（RUT）、尿素呼气试验（UBT）、组织学检查、培养以及血清学方法，已被用于H. pylori的检测。每种诊断方法在不同临床背景下均具有各自的优势和特定的局限性17。从胃黏膜活检样本中培养H. pylori通常被视为诊断的金标准。然而，该方法耗时耗力，且其准确性受限于技术难题、培养所需条件以及细菌浓度可能较低等因素。另一方面，组织病理学检查具有较高的敏感性和特异性，但细菌浓度及染色方法的选择会直接影响组织学评估结果18。与传统H. pylori检测方法的局限性相比，分子诊断技术可有效绕过培养步骤，显著缩短检测时间19。

此外，日益升高的耐药率已严重影响了根除治疗的效果。目前，克拉霉素是根除H. pylori的关键抗生素。然而，当存在耐药性时，治疗成功的可能性急剧下降，导致该抗生素失效，同时仍会促进其他细菌种类耐药性的产生。一种可能的策略是...

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致谢

本工作由国家自然科学基金委员会-广东省政府联合基金培育项目（8220080645）和广东省医学科学技术研究基金项目（A2024108）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
浴槽培养箱ALLSHENGMK2000-2提供恒温环境
生物安全柜海尔HR1500-figure-materials-1B2
离心机赛默飞世尔科技THERMO ST16R离心去除管壁残留液体
Chelex-100 sigmaC7901树脂
胃镜活检钳Boston Scientific Corporation胃黏膜取样
幽门螺杆菌 23S rRNA 基因和 gyrA 基因突变检测试剂盒江苏默乐生物科学CFDA 20223400137用于 H. pylori 及耐药基因（克拉霉素和喹诺酮类）的qPCR检测试剂盒
核酸提取试剂江苏默乐生物科学SEDA 20150076用于DNA提取
SDS 软件Applied Biosystems7300/7500数据分析
热循环仪赛默飞世尔科技ABI 7500用于幽门螺杆菌及耐药基因（克拉霉素和喹诺酮类）的qPCR检测
涡旋混合器JOANLABVM-5005用于试剂混匀

参考文献

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