自动粪便分析仪与直接湿片显微镜检测粪便样本中寄生虫感染的比较分析

摘要

寄生虫感染对公共卫生构成了重大挑战，尤其是在发展中国家和地区。本研究比较了一种自动粪便分析仪与传统直接湿片显微镜检查方法的诊断效能。

摘要

随着社会经济的发展，肠道寄生虫病的患病率逐年显著下降。然而，寄生虫感染在全球范围内仍然是一个重要的公共卫生问题，特别是在发展中国家和地区。及时诊断和治疗对于控制这些疾病的传播至关重要。传统的直接湿片显微镜检查方法虽然广泛应用，但操作繁琐、易造成污染，且依赖技术人员的经验。本文介绍了一种自动粪便分析仪，可实现粪便样本处理的自动化，相较于传统的直接湿片显微镜检查方法，具有操作简便、检测快速、工作环境清洁卫生以及高灵敏度和特异性等优势，从而提高了诊断效率与准确性。

我们比较了三种不同的粪便分析方法：直接湿片显微镜检查法、自动粪便分析仪（AI报告）和自动粪便分析仪（用户审核）。AI报告采用自动图像分析和机器学习算法，识别粪便样本中的寄生虫及虫卵等成分，能够快速处理大量样本，提高检测效率。用户审核同样使用自动粪便分析仪，但额外增加了用户审核步骤，由经验丰富的技术人员对AI报告结果进行复核，以提高结果的准确性和可靠性。该分析仪在AI报告模式下的敏感性为84.31%，用户审核模式下为94.12%；特异性在AI报告模式下为98.71%，用户审核模式下为99.69%，使其成为寄生虫感染临床诊断与治疗中不可或缺的工具。

引言

在全球范围内，肠道寄生虫病仍然是一个重大的公共卫生问题，主要集中在发展中国家。中华人民共和国卫生部的历史数据显示，感染率从1992年的62.63%显著下降至2015年的5.96%^1,2,3。尽管总体感染率已大幅下降¹，全国加权流行率为0.47%，估计感染者达598万³，但中国广东省人群的华支睾吸虫（Clonorchis sinensis）感染流行率仍高达4.90%⁴。广东等特定地区C. sinensis感染率依然较高，凸显了建立精准诊断方法的必要性。

寄生虫病的诊断可通过显微镜检查、医学影像学、血清学和分子生物学方法实现。利用酶联免疫吸附试验（ELISA）进行血清学分析有助于寄生虫病的诊断，但其敏感性中等，约为80%⁵。分子生物学诊断技术具有较高的敏感性和特异性⁶，但因其操作繁琐、耗时较长且检测成本较高，难以适用于大规模常规筛查。

C. sinensis 虫卵在患者粪便中的检出是确诊该病的基础。Kato-Katz 厚涂片法是一种经典方法，常用于检测 C. sinensis 虫卵，广泛应用于寄生虫病的诊断^7,8。尽管该方法成本低廉，但在面对大量标本需要筛查时，耗时较长、劳动强度大，不适合临床实践应用。目前大多数基层医院采用直接湿片显微镜检查法。然而，该方法仍然耗时且劳动密集，伴有难闻的粪便气味，容易造成交叉污染和较高的生物安全风险，且检测结果依赖于检验人员的技术水平和工作细致程度⁹。

传统的诊断技术虽然具有价值，但在灵敏度和实用性方面存在局限性。然而，随着科学技术的不断进步，粪便检测正变得越来越自动化和标准化。在临床实验室中，采用基于数字图像的方法对粪便中的寄生虫或虫卵进行定量检测的自动化仪器正日益普及。这类仪器具有操作简便、检测快速、工作环境清洁卫生以及高灵敏度和高特异性等优势。自动粪便分析仪利用数字成像技术，通过显微镜及其集成的数字成像系统，拍摄一系列低倍和高倍的数字显微图像，以记录显微观察结果。系统随后将这些图像传输至计算机数据处理系统，由其进行识别与分析。近期，我们尝试诊断多种寄生虫感染，重点在于检测粪便样本中的寄生虫及其虫卵。阳性样本通过其形态学特征的存在予以确认。我们评估了自动粪便分析仪在粪便样本中检测寄生虫的能力，并证实其可作为传统显微镜检查方法的有效补充。自动粪便分析仪由主机和配套软件组成，软件包含多个专用单元，分别为自动采样单元、穿刺采样单元、样本性状与颜色观察单元、摄像单元以及试剂卡单元（图1）。

图1：仪器的组成部分。 请点击此处查看此图的放大版本。

本研究于2024年7月对广东省人民医院住院患者的2,305份新鲜粪便样本采用自动粪便分析仪和直接涂片显微镜法进行了双盲评估（图2）。一组实验人员采用直接涂片显微镜法进行检测，另一组则使用配备人工智能生成报告的自动粪便分析仪。在记录两组检测结果后，第三组实验人员对手动采集的自动分析仪图像进行了复核，重点检查疑似寄生虫或虫卵、与自动分析结果存在偏差的图像、模糊或缺失的图像，以及背景复杂且残留物过多的图像。该过程包括对结果进行修正，修正后的结果称为自动粪便分析仪的用户审核结果。最终，由第四位人员对结果进行汇总和统计分析。通过双盲检测寄生虫/虫卵，并比较三种方法的检测时间和结果，评估全自动粪便检测仪器的有效性。

图 2：研究计划的示意图。 请点击此处查看此图的放大版本。

方案

本研究经中国广州南方医科大学广东省人民医院伦理审查委员会批准（批准号：KY2024-445-02）。所有参与者在入组前均签署了书面知情同意书。研究中使用的试剂和设备列于材料表中。

1. 标本采集

1. 使用粪便自动分析仪制造商提供的标本采集管，确保采集管带盖、可密封、清洁、干燥、不泄漏，并具有适合多点采样的开口和容量。
2. 尽可能选取新鲜的异常粪便物质，其中含有黏液、脓液或血液，目标采集量约为 0.5 g。当粪便稀薄或呈水样时，使用一次性移液器收集所需样本体积。
   注意：必须注意防止所有非患者粪便样本的污染。包括但不限于来自灌肠剂或油性泻药的粪便、便盆或马桶中的样本、被植物、土壤、污水、消毒剂、洗涤剂、尿液、月经血或白带污染的粪便。

2. 粪便检测方法

1. 直接湿片显微镜检查法^10,11
   1. 在洁净的载玻片上滴加1-2滴生理盐水溶液。
   2. 从粪便的异常区域或多个区域取少量样本进行涂片。
   3. 将样本均匀涂布在载玻片上，调整涂片厚度以确保细节清晰可见。
   4. 在涂片上加盖盖玻片，避免产生气泡。
   5. 在低倍镜（10×）下观察超过10个视野。若发现寄生虫卵或寄生虫，切换至高倍镜（40×）进行详细的形态学观察。
      注意：建议以“城垛”序列方式对玻片进行低倍镜检查，以最大限度降低漏检风险。
2. 自动粪便分析仪（图3）
   1. 打开计算机和分析仪电源，点击启动软件，输入用户名和密码登录，等待仪器完成自检。
   2. 使用合适的样本采集管收集合格粪便样本。
      注意：首选样本为约0.5 g的新鲜异常粪便，其中含有黏液、脓液或血液。
   3. 将样本采集管放入分析仪的样本架中，将样本架置于自动进样口，自检完成后点击“开始”进行首次检测。
      注意：后续检测将由仪器自动识别并执行。仪器机器人将对样本拍照留档。
   4. 向样本管中加入5 mL稀释液，通过气动混匀充分混合，待样本静置后进行分析。
      注意：样本采集管内衬有特殊滤膜，可去除无病理意义的残留物，如大量植物纤维、种子及未消化的食物残渣。
   5. 让样本流入计数池进行分析，分析仪将在显微镜下捕获高分辨率显微图像，软件将对图像进行处理和识别。
   6. 切换至结果界面，查看检测图像，并将结果发送至实验室信息管理系统（LIS）或打印输出。
   7. 点击停止结束检测。
   8. 选择“冲洗并关机”。
   9. 装载浓缩清洗液架，仪器将自动完成冲洗和关机程序。

图 3：自动化粪便分析仪系统工作流程。 请点击此处查看此图的放大版本。

3. 方法学评估

1. 检测时间的计算
   注意：通过记录每次检测程序的开始和结束时间来计算检测时间。通过分析每种方法在检测寄生虫时的灵敏度和特异性来比较检测结果。
   1. 直接湿片显微镜法
      1. 对于每份粪便样本，测量取米粒大小的粪便并将其均匀涂布在玻片上的所需时间。
      2. 测量每位受试者结果判读所需的时间。
      3. 将每位受试者的涂片操作和结果判读时间相加。
      4. 将步骤 3.1.1.3 的总和乘以受试者人数，得到直接湿片显微镜法的总检测时间（T₁）。
      5. 将步骤 3.1.1.4 中得到的 T₁ 除以检测样本数，得到直接湿片显微镜法的平均检测时间（t₁）。
   2. 自动粪便分析仪（AI 报告）
      注意：该过程可由单人完成。
      1. 测量每份样本使用自动粪便分析仪的检测时间（T₂）。
      2. 将 T₂ 除以检测样本数，得到自动粪便分析仪（AI 报告）的平均检测时间（t₂）。
   3. 自动粪便分析仪（用户审核）
      1. 测量每份样本使用自动粪便分析仪的检测时间（参见步骤 3.1.2）。
      2. 测量每份样本的手动图像复核时间。当开始复核自动粪便分析仪采集的某一样本图像时，立即启动计时器（秒表或数字计时器）。仔细检查图像以识别任何相关成分或异常。该样本复核完成后停止计时，记录每份样本的复核时间，并将数据输入电子表格以供进一步分析。
      3. 将每份样本的自动粪便分析仪检测时间和手动图像复核时间相加。
      4. 将步骤 3.1.3.3 的总和乘以受试者人数，得到自动粪便分析仪（用户审核）的总检测时间（T₃）。
      5. 将 T₃ 除以检测样本数，得到自动粪便分析仪（用户审核）的平均检测时间（t₃）。
2. 检测结果的比较
   注意：以直接湿片法为基准，评估自动粪便分析仪的 AI 生成报告和用户审核结果的性能。
   1. 收集直接湿片显微镜法的结果，作为基准方法。
   2. 收集自动粪便分析仪 AI 生成报告的结果。
   3. 收集自动粪便分析仪用户审核的结果。
3. 计算评估指标。
   1. 当自动粪便分析仪（AI 报告或用户审核）和直接湿片显微镜法的结果均显示目标分析物存在时，将该样本视为真阳性（TP）。
   2. 当自动粪便分析仪（AI 报告或用户审核）和直接湿片显微镜法的结果均显示目标分析物不存在时，将该样本视为真阴性（TN）。
   3. 当自动粪便分析仪的 AI 报告或用户审核显示目标分析物存在，但直接湿片显微镜法未确认其存在时，将该样本视为假阳性（FP）。
   4. 当自动粪便分析仪的 AI 报告或用户审核显示目标分析物不存在，而直接湿片显微镜法实际检测到其存在时，将该样本视为假阴性（FN）。
   5. 按以下方式计算特异性：
      ​特异性 = 真阴性（TN）/（真阴性 + 假阳性）
   6. 按以下方式计算灵敏度：
      ​灵敏度 = 真阳性（TP）/（真阳性 + 假阴性）
   7. 按以下方式计算阳性预测值（PPV）：
      PPV = 真阳性（TP）/（真阳性 + 假阳性）
   8. 按以下方式计算阴性预测值（NPV）：
      ​NPV = 真阴性（TN）/（真阴性 + 假阴性）
   9. 使用统计软件计算 Kappa 值。
   10. 按以下方式计算符合率：
       ​符合率 = 一致结果数（AI 报告和用户报告均与基准一致）/ 总样本数。
   11. 按以下方式计算阳性检出率：
       阳性检出率 = 阳性样本数 / 总样本数。

4. 分析结果

1. 将数据输入电子表格并进行统计分析。
2. 对于计数数据，使用率和比例进行描述，并采用配对双侧卡方检验进行组间比较。
3. 使用独立样本T-检验比较两种方法的平均检出时间。
4. 通过Kappa（κ）一致性检验评估不同技术在寄生虫种类检出上的一致性。
5. 以P < 0.05为差异具有统计学意义。

结果

三种检测方法检测时间的比较
直接湿片显微镜法的平均检测时间为每份样本每人1.55分钟，自动粪便分析仪（AI报告）为每份样本每人1.30分钟，自动粪便分析仪（用户审核）为每份样本每人1.47分钟。直接湿片显微镜法所需时间是自动粪便分析仪（AI报告）的1.1倍（t = 2.442，P = 0.020）。相反，自动粪便分析仪（用户审核）与直接湿片显微镜法的检测时间相近（t = 0.048，P = 0.962，表1）。

三种检测方法结果的比较
直接湿片显微镜检查法检出51份寄生虫卵阳性样本和2,254份阴性样本，检出率为2.21%。自动粪便分析仪（AI报告模式）检出72份阳性样本，检出率为3.12%。对自动粪便分析仪的结果进行人工复核和校正后，共确认55份阳性样本，其中包含17份假阳性（表2）。自动粪便分析仪在AI报告模式和用户审核模式下的粪便寄生虫/虫卵阳性检出率均高...

讨论

寄生虫病是全球公共卫生领域的重要问题¹²，尤其是在发展中国家，可导致营养不良、发育迟缓、贫血和胆道梗阻等健康问题¹³，并与社会经济落后和教育水平低下密切相关。粪便寄生虫检测已成为临床实践中的常规项目，检测的准确性、速度和效率是此类检测的关键要求。

寄生虫检测采用多种方法，包括显微镜检查、影像学、血清学和分子技术。酶联免疫吸附试验（ELISA）可用于血清学诊断，但敏感性较低⁵。分子方法在敏感性和特异性方面表现优异⁶，但操作复杂且成本较高，不适合常规筛查。通过粪便样本中直接检测虫卵可确诊感染，其中Kato-Katz法是一种经济有效的传统方法^7,8，但用于大规模筛查时较为耗时费力。出于成本考虑，基层医疗常采用直接涂片显微镜检查，但该方法耗时较长，存在生物安全风险，且依赖检测人员的技术...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
全自动粪便分析仪（FA280S）软件	ORIENTER	v.1.028(RecoV2.9.14)	全自动粪便分析仪（FA280S）系统的配套软件
浓缩清洗液	ORIENTER		适用于管路清洗
盖玻片	SAIL BRAND		保护样本免受损伤和污染
一次性塑料吸管	南通灵科生物科技		用于吸取生理盐水的一次性塑料吸管
FA280S	ORIENTER	A022201035	全自动粪便分析仪
冲洗液	ORIENTER	Q/WWT-019-2021	用于全自动粪便分析仪管路的冲洗
显微镜	OLYMPUS	3H51278	用于细胞观察
显微镜载玻片		WS-7101	为显微镜检查提供稳定、平整的样本承载表面
样本稀释液	ORIENTER	四川荣机械 20150025	适用于粪便样本的稀释
样本架	ORIENTER		用于装载样本的支架
样本管	ORIENTER	四川荣机械 20200204	粪便采集器
氯化钠注射液	广东大翔制药有限公司	H14020786	用于稀释
SPSS 统计软件	IBM	SPSS Statistics 22.0	适用于多种科研与分析任务
木签			一次性木签，用于挑取适量粪便样本