黑 腹果蝇 梳理行为的量化以评估过度梳理表型

Summary

此处介绍的方法涉及对获取的 黑腹果蝇 的镜头进行手动注释，以用于特定的修饰行为。它允许量化梳理发作的次数和梳理所花费的总时间，以评估非典型的自我梳理表型。

Abstract

刻板印象修饰中的可观察变化被转化应用于模式生物中。这些变化代表了在人类行为中引起类似偏差的病态;例如，过度的梳理是抽动秽语综合症或强迫症等疾病中存在的强迫症和强迫行为的代表。提出的梳理测定可以评估 黑腹果蝇中异常的自我梳理表型。苍蝇被记录 10 分钟，这些记录被观察并针对先前定义的梳理行为进行盲注。通过手动注释镜头，可以获得梳理频率和进行自我梳理所花费的时间的定量测量。该检测相对便宜，需要很少的实验室环境中尚不可用的材料，并且很容易适应任何旨在观察梳理的给定研究的特定需求。此外，与计算机科学密集型的自动化方法相比，执行分析所需的技能水平较低，这使得该方案非常适合小型实验室和学生。我们详细讨论了执行该分析所需的步骤及其目前的局限性。

Introduction

黑腹果蝇 是行为和神经生物学研究中一种成熟的模式生物，为驱动类似人类行为的机制提供了见解。这种生物体的自我梳理是一种高度规范且定义明确的行为，遵循很容易相互区分的刻板印象¹。果蝇表现出的单独梳理行为通常可以按解剖区域² 分类，最容易定义为后或前。 果蝇 的梳理最初将集中在前部区域，随后过渡到后端³。在典型情况下，苍蝇表现出梳理行为以保持清洁（例如，通过去除灰尘），并在暴露于可能有害的外部刺激（如病原微生物）时发生⁴。

修饰行为的异常，特别是自发的强迫性修饰，已在各种模型系统中用作强迫和/或强迫行为的指标。观察啮齿动物、鸟类和犬科动物等生物体的强迫性梳理行为的转化发现，让我们深入了解了在人类中引发类似强迫行为的条件⁵。这些包括拔毛癖、强迫症和抽动秽语综合症⁶ 等疾病。过度梳理行为也被用作评估 黑腹果蝇类似神经发育条件模型中行为表型的基准。在脆性 X 综合征 （FSX） 和相关自闭症谱系障碍 （ASD） 的果蝇模型中观察到强迫性梳理行为。过度的自发梳理发生在 dfmr1 突变下，dfmr1 是 ASD 和 FSX 相关基因 FMR1⁷ 的直系同源物。在这些突变体中，后端和前端之间的修饰分布也存在显着变化⁸。这些变化被解释为反映了一些患有这些疾病的患者表现出的强迫性和强迫性以身体为中心的行为。在使用此处描述的梳理测定法时，我们观察到了 RNAi 介导的市售 GAL4 驱动程序和 UAS-RNAi 系产生的 果蝇 基因 Atg8a 敲除后果蝇的梳理行为⁹。

此方法涉及对针对特定修饰行为拍摄的苍蝇素材进行手动注释。以前旨在评估梳理行为的研究，例如使用染料等间接方法的研究，虽然可以有效地量化梳理的功效，但不允许测量梳理的持续时间或频率¹⁰。然而，该测定允许量化果 蝇 梳理频率和持续时间，包括一般和按解剖区域。与当前的自动化方法相比，此处详述的方法具有一些优势，因为它很容易修改，并且可以由缺乏计算背景的个人进行。由于大多数实验室都可以轻松获得所需的设备，我们提出了一种经济高效的方法来评估是否存在过度的自我修饰表型（参见 材料表）。这使得该方法易于本科院校使用，并且很容易适应培训环境或教学实验室。

Protocol

注意: 图 1 显示了该协议的概述。

1. 拍摄准备

1. 将四个三孔培养皿并排放在白色表面上，每个培养皿都用载玻片覆盖。
2. 将摄像头（此处为 Raspberry Pi 系统，但任何能够提供高清视频的摄像头都足够了）放置在盘子上方。
   1. 检查以确保所有菜肴都在框架和焦点上。
   2. 检查以确保载玻片上没有眩光，这会限制培养皿中苍蝇的可见度。通过调整印版位置或调暗录制空间的灯光来消除眩光。
   3. 使用高分辨率（最小 1920 x 1080 像素）准确可视化苍蝇肢体。
3. 在进行录制的长凳上标记盘子和摄像头的位置。
   注意: 这将限制将来使用设备时在步骤 2 上花费的时间。在同一时间和同一空间进行检测将限制基于预期作之外的因素的行为变异性。
4. 在覆盖有封口膜和纸巾的冰块上用寒冷对 4-9 日龄的果蝇进行轻度麻醉（CO₂ 麻醉会对行为产生重大影响）。
   1. 将苍蝇轻敲到块上，麻醉后，使用画笔尽快将苍蝇移动到观察室。
      注意:这种转移应尽快进行，因为过度暴露于任何类型的麻醉都会对苍蝇产生负面影响。
5. 在每个孔中放置一只果蝇。
6. 让文件在麻醉后 30 分钟内适应新环境。在此之后，请勿触摸或打扰含有苍蝇的井，因为增加的压力源会影响行为。

2. 记录苍蝇

1. 驯化 30 分钟后，用相机记录苍蝇。
2. 使用通过 PiSpy¹¹ 运行的 Raspberry Pi 摄像头进行行为数据收集。
   注意:该软件是免费的，可在 GitHub （https://github.com/gpask/PiSpy） 上获得，并且可以轻松设置 Pi 系统，价格低于 300 美元。其他摄像机（如果已经可用）也足以录制素材
3. 使用以下命令流程使用 Pi 开始录制。
   1. 打开终端并键入 cd PiSpy。然后，键入 python3 PiSpy.py，输入所需的录制长度，然后输入所需的帧速率。选择所需的分辨率，然后单击 Quick Capture。
   2. 使用 Preview Camera 功能可确保苍蝇清晰可见。
4. 以推荐的 24 fps 帧速率记录苍蝇 10 分钟并保存文件（PiSpy 会自动保存到视频文件夹）。

3. 视频分析（图 2）

1. 要分析视频，请将文件导入 Elan 6.8 软件¹²。
   注意:该软件最初是为心理语言学 tallow 开发的，用于详细注释视频和深入分析诱骗行为
2. 如下图所示分配每一行，以手动注释单个素材。
   1. 使用以下命令流程执行此作: 层 > 添加新层 > 在盘子中的 层名称 > 添加 中键入位置。
3. 根据研究的需要，记录并量化各种特定行为（前后梳理、行走、睡眠和站立）。
   1. 按照以下步骤进行注释。
      1. 双击要注释的层。右键单击并沿所选层拖动光标一段时间，其中显示单个修饰回合。单击鼠标左键，选择 New Annotation （新建注释 ），然后双击新突出显示的时间段。键入在该时间点表现出的行为的缩写。
   2. 慢慢观察视频，用鼠标擦洗它们，并添加注释。在注记期间放大单个苍蝇井，以防止错误地识别行为。这些可能包括用苍蝇敲击玻璃边缘或移动腿，这最初可能看起来像梳理。
4. 对视频进行完全注释后，获取每个行为的细分。确保在整个视频中使用相同的缩写或注释才能使用此功能。
   注意:Elan 6.8 将提供行为发生的次数、行为的总持续时间以及每个行为所花费的平均时间。
   1. 将梳理回合定义为 2 秒不间断的梳理。按如下方式识别观察到的每种行为。在进行测定之前定义解剖区域的参数。
      1. 前部梳理:将在苍蝇身体前部区域进行的梳理确定为前部梳理。
         注意:这种行为几乎总是涉及用苍蝇的前两条腿摩擦前部，如头部或长鼻。
      2. 后梳理:将在苍蝇体的前后端进行的梳理确定为后梳理。
         注意:此外，为简单起见，翅膀包含在后部区域。这种行为几乎总是涉及与中央和最后一组腿的动态摩擦运动。发生后梳理的一个很好的指标是，乍一看，苍蝇可能看起来好像缺少了最后的腿，如图 2D 所示。

Results

该分析产生定量数据，测量带注释镜头中修饰行为的时间和频率。 图 2 概述了设置的代表性图像以及如何定义行为。鉴于视频分析引入的主观性，视频的所有注释都应该对执行分析的研究人员不知情。

该方法用于评估 果蝇 基因 Atg8a 在梳理行为发展中的作用。 Atg8a 与人类基因 GABARAP 同源，该基因在一些抽动秽语综合征 （TS） 患者中的表达降低⁹。TS 是一种以不自主运动和发声为特征的疾病，称为抽搐，通常与其他引起强迫/强迫行为的疾病共病¹³。我们旨在通过利用 TS 和其他神经发育模型的常见行为标志物强迫性梳理来了解这种表达的减少如何影响这种神经发育状况的发展。通过比较通过 Gal4-UAS 系统产生的 RNAi 介导的 Atg8a 敲低突变体之间的梳理频率和时间¹⁴，以及它们各自的 UA...

Discussion

总体而言，这种易于执行且具有成本效益的分析可以对 黑腹果蝇 的梳理行为进行稳健的表征。该技术可以深入了解大量先前确定的梳理行为的频率、参与所花费的时间和解剖学分布。梳理将要发生或正在进行的一个很好的指标是腿部位置的变化，特别是抬高 6 条腿中的任何一条。特别注意腿部运动后的行为有助于识别梳理行为。该分析允许进行行为注释，范围从一般的完全梳理到特定于解剖区域的刻板印象的梳理行为，例如针对苍蝇的翅膀、头部或腿部的行为。可以包括或忽略其中任何一个，以满足研究的需要。在此处提供的代表性数据中，我们使用强迫性修饰作为与抽动秽语综合症等神经发育状况相关的强迫/强迫行为的代表性衡量标准。还可能收集其他数据，例如有关行走模式、睡眠时间和在培养皿内跌倒频率的信息。

除了提供相机或需要购买的相机外，该分析还具有成本效益，并且使用实验室空间中常见的工具。可以进行额外的调整，尤其是在建造观察室以满足研究需求或可用用品时。

在进行实验时避免使用标准二氧化碳麻醉剂至关重...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
16 GB Micro SD 卡	Adafruit	1294	用于介绍作系统
显示器	Adafruit	3578	任何能够通过 HDMI 或柔性电缆连接的显示器就足够
了 果蝇 Atg8a-RNAi UAS 线	布卢明顿股票中心	34340	代表数据中使用的线
果蝇 Ok6 驱动程序	N/A	N/A	数据中使用的线
载玻片	Fisher Scientific	12-550-A3	将苍蝇保持在收容
内 散热器	Adafruit		防止计算机过热
镜头	Adafruit	4563	仅用于高清摄像头
PiCamera	Adafruit	4561	这里使用了高清版本，但在预算限制下可以使用标准摄像头
Raspberry pi 4	Adafruit	4292	计算机 PiSpy 在
Ribbion 电缆	Adafruit	1648	用于连接相机和显示器
SB 组件 案例	Adafruit	4301	保护计算机
点板	Fisher Scientific	S99406	耐热玻璃版本已经可供我们使用，但细胞培养皿或塑料点板也足够
三脚架	百思买	6355959	对于相机的悬挂和定位，任何能够做到这一点的设备都足够
USB C 电源	Adafruit	1995	为计算机供电