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通过液相色谱结合蒸发光散射检测器测定脂质纳米颗粒RNA递送系统中的四种组分

DOI：

10.3791/67711

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2025年5月30日

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1Shimadzu (China) Co., Ltd., 2Medical College of Fudan University

本文内容

摘要

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本研究建立了一种利用高效液相色谱结合蒸发光散射检测器（ELSD）对脂质纳米颗粒（LNP）RNA递送系统中四种组分进行定量分析的方法。该方法具有良好的分离效果、高灵敏度和高效率。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文介绍了一种用于分析脂质纳米颗粒（LNP）组分的方法。LNP作为RNA类药物的关键载体，主要由胆固醇、经修饰的聚乙二醇（PEG）、可电离脂质和辅助脂质组成。这些组分极性较弱，在反相色谱中表现出较强的保留作用，难以实现有效分离，且缺乏明显的紫外吸收特性。为解决这一难题，采用液相色谱系统与蒸发光散射检测器（ELSD）联用。通过系统性地调整色谱柱类型，并优化流动相的梯度洗脱程序，实现了四种关键组分的快速、完全的基线分离。采用最新的ELSD技术显著提高了检测灵敏度，并拓宽了方法的线性范围。实验结果表明，在5 µg/mL至250 µg/mL的浓度范围内，LNP的四种组分均表现出良好的线性关系，相关系数均大于0.999，准确度范围为94.2%至108.0%。在精密度实验中，10 µg/mL标准溶液的保留时间和峰面积的相对标准偏差分别低于0.1%和2%。利用该方法分析不同LNP样品时，所有组分均成功分离，并实现了各自含量的准确定量，凸显了该分析方法的强健适应性。

引言

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脂质纳米颗粒（LNP）是最先进的非病毒基因递送系统之一，主要用于递送核酸类药物，如反义寡核苷酸、小干扰核苷酸、mRNA等1,2,3。LNP通常由四种组分构成：可电离脂质、聚乙二醇（PEG）修饰的脂质、磷脂和胆固醇。其中关键组分为可电离脂质，它是决定核酸药物递送效率的决定性因素。其余三种组分可提高LNP的稳定性，并降低免疫系统的识别4,5,6。

LNP 中四种组分的不同比例会显著影响纳米颗粒的自组装过程，进而影响活性药物成分（API）的包封效率、递送效率以及体内释放速率in vivo7,8,9。因此，建立一种对 LNP 组分的定量分析方法至关重要，以促进最优 LNP 递送系统的合成10,11。

高效液相色谱法（HPLC）是一种现代分析技术，广泛应用于药物分析，以其高效率、高灵敏度和自动化能力而著称。HPLC 包含多种检测器，如常规紫外（UV）检测器，以及通用型检测器，如示差折光检测器（RID）、蒸发光散射检测器（ELSD）、电雾化检测器（CAD）和高选择性射频（RF）检测器等12。

在分析缺乏特征紫外吸收基团因而无法在紫外检测器中产生响应的LNP四种组分时，考虑使用通用型检测器。尽管示差折光检测器（RID）是其中一种选择，但由于其不适用于梯度分析，且相较于另外两种通用型检测器灵敏度相对较低，因此未被选用12。此外，虽然电雾式检测器（CAD）具有高灵敏度，但其高昂的成本使其应用受限12。

因此，选择了蒸发光散射检测器（ELSD）。该检测器具有独特的增益模式选项——“宽范围”模式，可同时分析高浓度和痕量组分，从而提高灵敏度并扩展线性范围。

本文采用高效液相色谱系统与蒸发光散射检测器联用，通过优化色谱柱、流动相梯度洗脱及其他条件，实现了对脂质纳米颗粒（LNP）四种组分的有效分离和定量分析13。

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方案

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1. 仪器准备

  1. 仪器设置
    1. 设置配备蒸发光散射检测器（ELSD）的高效液相色谱（HPLC）系统。
  2. 色谱柱安装
    1. 按照色谱柱上的箭头方向安装色谱柱（C4-300；150 mm × 4.6 mm 内径，5 µm），一端连接自动进样器出口，另一端连接ELSD入口。
  3. 流动相制备
    1. 制备流动相：A相为10 mM三乙胺乙酸铵水溶液（pH = 7.0），B相为10 mM三乙胺乙酸铵甲醇溶液（pH = 7.0）。
    2. 配制A相时，准确称取1.01 g三乙胺，溶于1000 mL水中，充分混匀，用乙酸调节pH至7.0。
    3. 配制B相时，将1.01 g三乙胺溶于1000 mL甲醇中，混匀，用乙酸调节pH至7.0。
  4. 方法编辑
    1. 打开液相色谱-蒸发光散射检测器（LC-ELSD）各模块的电源开关，启动LabSolutions 软件，然后打开Realtime Analysis窗口。
    2. 点击File ，选择New 创建新的方法文件。将方法中的LC Stop Time修改为15，并点击Apply to all Acquisition Time。
    3. 然后点击Pump 以修改泵参数。将分析模式设为Binary High-Pressure Gradient （B.GE），流速设为1.0 mL/min。
    4. 接着，将初始泵B浓度（%B）设为80%，并修改流动相梯度：3 min时%B为80%，4 min时%B为85%，从5.5 min到12 min期间%B为100%，12.1 min时%B恢复至80%。
    5. 随后，点击Column Oven，将柱温箱温度设为55 °C。最后点击ELSD ，将漂移管温度修改为40 °C，并保存方法。
      注：参数汇总见Table 1。
  5. 启动并平衡仪器。
    1. 点击Download 和Startup 以启动并平衡仪器。

2. 标准溶液和样品的制备

  1. 标准溶液的制备
    1. 分别精确称取四种LNP组分的标准品各10.0 mg，加入1 mL甲醇溶解，涡旋至完全溶解，得到每种组分浓度为10 mg/mL的储备液。
    2. 使用移液器准确吸取四种储备液各100 µL至样品瓶中，再加入600 µL甲醇，充分混匀，制备得到浓度为1000 µg/mL的混合中间溶液1。
    3. 准确吸取四种储备液各20 µL至样品瓶中，再加入920 µL甲醇，充分混匀，制备得到浓度为200 µg/mL的混合中间溶液2。
    4. 随后，根据表2进行系列稀释，制备浓度分别为5 µg/mL、10 µg/mL、20 µg/mL、50 µg/mL、100 µg/mL、200 µg/mL和250 µg/mL的一系列标准溶液。
  2. 样品的制备
    1. 使用移液器准确吸取100 µL样品至样品瓶中，加入900 µL甲醇，充分混匀。此时应确保样品中LNP浓度被稀释10倍，且LNP已从核酸药物中解离。

3. 数据采集

  1. 将标准溶液和样品溶液放入液相色谱仪的自动进样器中。
  2. 在实时分析窗口的辅助工具栏中点击实时批处理，然后在文件菜单中点击新建，以创建新的批处理表。
  3. 在批处理表中输入进样瓶编号（Vial#）、样品盘名称（Tray Name）、数据文件名称以及标准溶液和样品溶液的进样体积，并选择步骤1.4中保存的方法文件。在文件菜单中点击保存批处理文件以保存批处理文件。
  4. 等待液相色谱仪的压力和色谱图基线稳定后，点击辅助工具栏中的启动实时批处理以开始数据采集。

4. 数据分析

  1. 建立标准曲线
    1. 打开 LabSolutions 软件的 浏览器窗口，将标准溶液数据拖入 定量结果视图 以建立标准曲线。接着修改数据处理参数，点击 方法视图 中的 编辑。
    2. 在 积分参数 窗口中，将斜率值更改为 10000。然后在 识别参数 中，将识别方法更改为 峰带法，并将 默认带宽 设置为 0.1 分钟。
    3. 随后修改 定量参数：将 定量方法 更改为 外标法，并将 校准点数量 设置为 7。选择校准曲线类型为 指数型。接下来修改 化合物 参数。
    4. 输入四种 LNP 组分的名称及其标准溶液浓度。双击峰顶点以更新保留时间。最后点击 查看，完成数据处理参数的修改。
    5. 在 定量结果视图 中将 样品类型 修改为 标准品（计算点），并根据浓度将标准溶液的校准点等级设为 1–7。标准曲线建立完成后，点击菜单栏中的 文件，保存方法文件。
  2. 样品的定量分析
    1. 将样品数据拖入浏览器窗口的 定量结果视图，即可显示样品中四种 LNP 组分的浓度结果。

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结果

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采用该方法对LNP标准溶液进行分析，四种组分的分离度均大于1.5，实现了基线分离。此外，如图1所示，在高浓度标准溶液中未观察到残留峰。在5至250 µg/mL的浓度范围内建立了校准曲线，相关系数均超过0.999，表明该方法具有宽广的线性范围和良好的线性关系。校准曲线如图2所示。

为考察该方法的重现性，将浓度为 10 µg/mL 的标准溶液重复进样并分析六次。保留时间的相对标准偏差（RSD）小于 0.1%，峰面积的相对标准偏差（RSD）小于 2%，表明该方法具有良好的重现性。相应的色谱图如图3所示。

对于实际LNP样品的分析，将样品用甲醇稀释10倍，以促进LNP与药物的解离。随后分析了LNP中四种组分的含量，测得浓度范围为150 µg/mL至1500 µg/mL。采用该方法分析来自多家制造商的LNP样品，均获得了稳定且较高的分离度和灵敏度。这些样品的具...

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讨论

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LNP 的四种组分均表现出较弱的极性。当使用 C18 色谱柱进行分析时，目标化合物在色谱柱中表现出较强的保留作用，导致强保留组分的磷脂峰展宽。此外，在分析高浓度溶液后，残留物会在 C18 色谱柱柱头积聚，可能影响定量结果的准确性。色谱图如图5所示。

为了优化该方法，转而选用了一种疏水性较弱的C4色谱柱。这一选择旨在降低目标化合物与色谱柱之间的相互作用力，从而缩短分析时间。此外，采用优化后的方法，在系统中未检测到来自高浓度标准品的残留。本实验中使用的C4色谱柱专为生物样品设计，可获得分辨率高的色谱图，并具有尖锐且对称的峰形，从而提高了被分析组分的分离效率。

LNP 的四种组分含有相对较低的不饱和基团，导致在紫外检测器中响应较弱，因而灵敏度较低。目前，一些方法采用 CAD 检测器分析 LNP，但 CAD 检测器价格昂贵且使用成本较高12。为解决这一问题，本实验转而采用另一种通用型检测器——蒸发光散射检测器（ELSD）。与紫外...

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披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

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感谢生物制药公司为本实验提供脂质纳米颗粒（LNP）样品，并感谢岛津（上海）全球实验室耗材有限公司提供色谱柱。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
乙酸ANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc.CAEQ-4-000319-0050
天平Shimadzu (Shanghai) Global Laboratory Consumables Co.,LtdAP135W
色谱柱Shimadzu (Shanghai) Global Laboratory Consumables Co.,LtdShimNex WP C4(380-01235-74)
蒸发光散射检测器Shimadzu (China) CO.,LTDELSD-LT III(228-65900-46)
LabSolutions 软件Shimadzu (China) CO.,LTD
液相色谱仪Shimadzu (China) CO.,LTDLC40D XR
甲醇ANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc.CAEQ-4-003302-4000
移液器-100 µLShimadzu (Shanghai) Global Laboratory Consumables Co.,Ltd00-NAR-100
移液器-1000 µLShimadzu (Shanghai) Global Laboratory Consumables Co.,Ltd00-NAR-1000
三乙胺ANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc.CAEQ-4-012190-0250
超纯水系统MilliporeZIQ7000T0C
涡旋混合器ANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc.VM-B

参考文献

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  1. Zong, Y., Lin, Y., Wei, T., Cheng, Q. Lipid nanoparticle (LNP) enables mRNA delivery for cancer therapy. Adv Mater. 35 (51), e2303261(2023).
  2. Vlatko, I., et al. Non-immunotherapy application of LNP-mRNA: Maximizing efficacy and safety. Biomedicines. 9 (5), 530(2021).
  3. Eygeris, Y., et al. Chemistry of lipid nanoparticles for RNA delivery. Acc Chem Res. 55 (1), 2-12 (2021).
  4. Sun, D., Lu, Z. R. Structure and function of cationic and ionizable lipids for nucleic acid delivery. Pharm Res. 40 (1), 27-46 (2023).
  5. Rebecca, L., et al. Lipid nanoparticle formulations for enhanced co-delivery of siRNA and mRNA. Nano Lett. 18 (6), 3814-3822 (2018).
  6. Maugeri, M., Nawaz, M., Papadimitriou, A. Linkage between endosomal escape of LNP-mRNA and loading into EVs for transport to other cells. Nat Commun. 10, 4333(2019).
  7. Renee, C., et al. The effects of PEGylation on LNP based mRNA delivery to the eye. PLoS One. 15 (10), e0241006(2020).
  8. Benedicto, E., et al. Optimization of phospholipid chemistry for improved lipid nanoparticle (LNP) delivery of messenger RNA (mRNA). Biomater Sci. 10 (2), 549-559 (2022).
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  10. Melissa, P., et al. Optimization of lipid nanoparticles for the delivery of nebulized therapeutic mRNA to the lungs. Nat Biomed Eng. 5 (9), 1059-1068 (2021).
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  14. Zhang, Y., Wang, X. Performance comparison of different ELSD detectors in pharmaceutical analysis. Anal Methods. 7 (12), 4800-4807 (2015).

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LNP

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