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方法文章

可视化滨海湿地中甲烷循环微生物的动态变化

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DOI：

10.3791/67715

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2025年1月31日

 ,  ,  , 
1School of Earth, Environmental and Marine Sciences, University of Texas - Rio Grande Valley

本文内容

摘要

该方案可检测美国南部德克萨斯州沿海湿地中与甲烷循环相关的关键基因，并可视化其空间分布，从而加深对这些动态生态系统中甲烷调控机制及其环境影响的理解。

摘要

滨海湿地是最大的生物源甲烷排放源，其中产甲烷菌将有机质转化为甲烷，而甲烷氧化菌则氧化甲烷，因此在调控甲烷循环中发挥着关键作用。由于气候变化的影响，美国南部德克萨斯州的湿地频繁遭受天气事件、盐度波动以及人类活动的干扰，这些因素均会影响甲烷循环过程。尽管这些过程具有重要的生态意义，但南德克萨斯滨海湿地中的甲烷循环仍缺乏充分研究。为弥补这一空白，我们开发并优化了一种检测与产甲烷菌和甲烷氧化菌相关基因的方法，包括以mcrA作为产甲烷菌的生物标志基因，以及pmoA1、pmoA2和mmoX作为甲烷氧化菌的生物标志基因。此外，本研究旨在利用地理信息系统（GIS）软件ArcGIS Pro，可视化展示产甲烷菌和甲烷氧化菌丰度在时空上的分布模式。将这些分子技术与先进的地理空间可视化手段相结合，为深入理解南德克萨斯湿地中产甲烷菌和甲烷氧化菌群落在时空尺度上的分布提供了关键见解。因此，本研究建立的方法体系为绘制湿地微生物动态图谱提供了可靠框架，有助于加深对不同环境条件下甲烷循环机制的理解，并支持更广泛的生态与环境变化研究。

引言

滨海湿地是重要的生态系统，通过碳封存、蒸散作用和甲烷（CH₄）排放等过程，在气候调节、生物多样性保护和水资源管理方面发挥着关键作用。4）排放1这些生态系统包括淡水和咸水湿地2，具有很高的生产力，并作为吸收二氧化碳（CO₂）的关键区域2）并从陆地和海洋环境中捕获有机质3,4湿地内部的动态相互作用促进了微生物的CH4 生产与消耗5，使其成为CH最大的天然来源之一46作为第二重要的温室气体，CH4 其全球变暖潜势约为CO的27至30倍24,7,8,9，使得对CH的研究4 沿海湿地的排放物在气候变化时代至关重要。CH₄的排放4 受多种环境因素影响，尤其是盐度，在微生物过程中起着关键作用10淡水湿地由于硫酸盐含量较低，有利于微生物产生更多的甲烷，因此对大气甲烷有显著贡献。4 生产，而咸水湿地通常排放的CH4 由于硫酸盐浓度较高11,12,13.

滨海湿地的 CH4 排放通常由两类微生物控制，即产甲烷菌和甲烷氧化菌14。产甲烷菌通过一种称为产甲烷作用的过程，在缺氧沉积物中分解甲酸盐、乙酸盐、氢气或甲基化化合物等底物来生成 CH415。该代谢途径中的关键酶是甲基辅酶 M 还原酶（MCR），因为它催化产甲烷作用的最后一步，同时也是限速步骤15,16,17。编码 MCR α 亚基的 mcrA 基因是一种功能标记基因，存在于所有产甲烷古菌中18。此外，在滨海湿地中，硫酸盐-甲烷过渡带（SMTZ）形成于产甲烷带之上，此处向上扩散的甲烷与向下迁移的硫酸盐相遇并被消耗殆尽19。在此区域内，厌氧甲烷氧化古菌（ANME）利用 MCR 酶将甲烷氧化为二氧化碳，同时硫酸盐还原细菌（SRB）将硫酸盐还原为硫化物。SRB 在对氢气和乙酸盐的竞争中胜过产甲烷菌，从而在硫酸盐耗尽之前限制了甲烷的生成16,17。

相比之下，好氧甲烷氧化细菌在好氧环境中氧化CH420，并利用不同形式的甲烷单加氧酶（MMO）。其中包括颗粒型甲烷单加氧酶（pMMO），这是一种含铜的酶，嵌入在细胞质内膜中；以及可溶性甲烷单加氧酶（sMMO），一种含铁的酶，存在于细胞质中。对于pMMO而言，存在三个基因操纵子pmoCAB21；其中，pmoA基因在所有甲烷氧化菌中最为保守。pmoA有两个不同的生物标志基因：pmoA1和pmoA222。此外，为了全面了解甲烷氧化菌，mmoX基因被用作分子生物学工具，用于鉴定含有sMMO的甲烷氧化菌23。产甲烷菌与好氧甲烷氧化菌在代谢途径和环境需求上的这种差异，凸显了调控滨海湿地生态系统中甲烷循环的复杂微生物相互作用。

博卡奇卡（BC）湿地是美国得克萨斯州南部一个生产力较高的咸水环境，受墨西哥湾（GOM）潮汐影响，地表盐度水平变化较大，尤其因其靠近高盐度的马德雷泻湖24。这种交替的涨潮与落潮过程导致氧气水平波动25，可能改变沉积物中产甲烷菌和甲烷氧化菌的活性26。相比之下，沿海淡水湿地被认为是CH4通量的重要热点区域27。得克萨斯州南部的沿海淡水湿地，包括远离墨西哥湾潮汐影响的兰乔维耶霍雷斯卡（RV）和洛萨诺班科（LB），具有独特的水文管理方式。RV在低水位期间会通过河水进行脉冲式补水，而LB则为离线水流系统，无此类补水措施。此外，RV因人工泵入大量淡水，LB因属于牛轭湖，两者均维持较低的盐度水平。不同的环境因素可能显著影响得克萨斯州南部沿海湿地的甲烷循环过程。然而，该地区沿海湿地中的甲烷循环仍是一个尚未得到充分研究的领域。

聚合酶链式反应（PCR）和实时PCR（也称为定量PCR [qPCR]）是检测和量化环境样品中特定基因相对丰度的基本且广泛应用的技术。这些技术可特异性扩增目标DNA区域，以指示与CH4循环相关基因的存在及其相对数量，从而提供甲烷循环潜力的指标。然而，由于提取的环境DNA中可能存在多种抑制因素，PCR引物组的可用性和扩增效率可能受到限制，并受环境类型的影响28,29。因此，本研究主要建立了一种用于检测美国南德克萨斯州沿海湿地中CH4循环相关基因存在的优化PCR方法（图1），并进一步可视化其在这些生态系统中的定量相对丰度。本研究的结果可推广应用于其他沿海地区，以增进对不同沿海生态系统中CH4循环过程及微生物动态的理解。

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方案

1. 样品采集

  1. 使用沉积物抓取采样器或铲子采集沉积物样品。
    注意：样品于凉季（10月至次年2月，平均温度为20℃）从三个不同滨海湿地的两个站点采集。 °C）以及温暖季节（4月至6月，平均温度为27 °C）2023年和2024年季节。在沿海淡水湿地采集样品时使用了沉积物抓斗采样器（图2）并使用铁锹采集受潮汐影响的沿海咸水湿地样本。
  2. 首先将采样器放入浅水水体中，使其在自身重力作用下下沉至沉积物表面（位于表层50 cm以内），尽量减少对沉积物结构的扰动，如图所示 图2.
  3. 从水柱中取出，水深通常为60 cm至215 cm30将沉积物样品转移至自封袋中，并立即置于冰盒中保存。
    注意：在前往下一站点之前，需使用去离子水（DI 水）清洗抓斗采样器。
  4. 所有样品均于 -20 ℃ 保存 °C 立即在实验室中进行。
  5. 在每个采样点，测定表层水体的水质参数，如盐度和温度 原位 使用多参数水质测定仪。
    注意：每次在各站点使用后，探针均用去离子水（DI 水）冲洗。

2. 基因组DNA提取

  1. 在开始基因组DNA提取操作前，将样品在室温下解冻。
  2. 将约500 mg的沉积物样品转移至15 mL离心管中，并在4,250 × g条件下离心3分钟，以去除全部水分。
  3. 按照制造商的说明书31，使用土壤DNA提取试剂盒提取基因组DNA，稍作修改，并立即在-20 °C保存。
    注意：所做的修改旨在减少重复步骤并提高工作流程效率。
    1. 将最多500 mg的土壤样品加入含有玻璃珠/陶瓷球的离心管中。
    2. 向含珠/球的管中加入978 µL磷酸钠缓冲液。
    3. 向含珠/球的管中加入122 µL裂解缓冲液，以溶解外部污染物。
    4. 使用珠磨均质器以5倍速度水平均质20秒，并重复2次。
      注意：本研究中使用了珠磨均质器，因此对速度进行了调整。
    5. 将混合物在14,000 × g条件下离心10分钟。
    6. 将上清液转移至一个新的2.0 mL微量离心管中。
    7. 加入250 µL蛋白质沉淀溶液（PPS），以将溶解的核酸与细胞碎片及裂解基质分离。通过倒置混匀管10次进行混合。
    8. 在14,000 × g条件下离心5分钟，使沉淀形成，从而去除细胞碎片和裂解基质。
    9. 将上清液转移至一个新的15 mL微量离心管中。
    10. 向15 mL管中的上清液加入1.0 mL结合基质悬浮液。
      注意：加入前需摇动结合基质悬浮液以重新悬浮。
    11. 将离心管置于旋转仪上旋转2分钟，使DNA与结合基质结合。
    12. 将所有离心管放置于支架上静置3分钟，使结合基质沉降。
    13. 3分钟后，弃去750 µL上清液，并用移液器轻轻将剩余上清液与沉淀混合。
    14. 将750 µL混合液转移至SPIN过滤柱中，在14,000 × g条件下离心1分钟。清空接液管并重复使用。对剩余混合液重复此步骤。
    15. 加入500 µL已配制的洗涤液（已加入适量乙醇），以进一步溶解杂质。利用移液器枪头液体的冲击力轻轻重悬沉淀。
    16. 在14,000 × g条件下离心1分钟以去除杂质。清空接液管并重复使用。
    17. 再次在14,000 × g条件下离心2分钟，不添加任何试剂。
    18. 更换为新的洁净接液管，并将SPIN过滤柱在室温下晾干5分钟。
    19. 加入50 µL无DNA酶的水（DES），并在14,000 × g条件下离心1分钟。
      注意：在本方案中，使用50 µL DES进行DNA洗脱，以确保提取的环境DNA（eDNA）获得最佳回收率和稳定性。

3. DNA 定量

  1. 在0.5 mL离心管中加入1 µL提取的DNA和200 µL荧光染料，通过移液充分混匀。
  2. 立即用铝箔包裹离心管以避光，并在室温下孵育5分钟。
  3. 按照制造商的操作说明，使用荧光计在ONE DNA浓度模式下测定DNA浓度。

4. 通过常规PCR检测16S rRNA、pmoA1、pmoA2、mmoX 和 mcrA

  1. 进行常规PCR（cPCR）之前，将所有样品和试剂在冰桶中解冻。
  2. 将所有提取的环境DNA（eDNA）样品稀释至10 ng/µL。
    注意：引物列表见表1。
  3. 为每个样品配制25 µL的cPCR反应体系，包括12.5 µL的2x PCR预混液、0.5 µL的正向和反向引物（10 µM）（引物列表见表1）、1 µL的10 ng/µL eDNA，以及10.5 µL的无核酸酶水。
    注意：配制主混合液时应多准备一个样品的量，以减少移液误差。
  4. 按照以下程序进行cPCR反应：95 °C预变性2分钟，随后进行40个循环，每个循环包括95 °C变性45秒、72 °C延伸30秒，最后在72 °C延伸5分钟；不同引物的退火温度有所不同（不同基因所用引物的退火温度见表1）。
    注意：对于mcrA基因， ML引物在前五个循环中，退火与延伸步骤之间采用0.1 °C/s的慢速升温速率时可获得理想条带32。
  5. 在预先加入溴化乙锭（EtBr）染色的琼脂糖凝胶中观察cPCR产物。
    注意：使用2.5%琼脂糖凝胶配合50 bp DNA标记物，使用0.9%琼脂糖凝胶配合1 kb DNA标记物。2.5%琼脂糖凝胶使用1x TAE缓冲液，0.9%琼脂糖凝胶使用0.5x TAE缓冲液。

通过定量实时 PCR 检测 pmoA1、pmoA2、mmoX 和 mcrA

注意：使用实时荧光定量 PCR 系统通过 qPCR 检测了以产甲烷菌和甲烷氧化菌为靶标的基因（如 pmoA1、pmoA2、mmoX 和 mcrA）的丰度。

  1. 分别制备每个基因的标准品，以获得每个基因的标准曲线。
    1. 使用凝胶电泳中每个基因产生最亮条带的样品，通过cPCR扩增目标基因。操作方法及引物参照第4节所述。
    2. 使用凝胶回收试剂盒纯化扩增产物，并按照第3节所述方法测定DNA浓度，于-20 °C保存。
      注意：将纯化的标准品分装至不同的离心管中，以便后续使用。
    3. 利用qPCR拷贝数计算网站，根据测得的DNA浓度计算基因拷贝数。
    4. 将计算出的拷贝数标准品用无核酸酶水稀释，制备浓度范围为108至102 拷贝/µL的标准品系列，用于后续qPCR检测。
    5. 对每个拷贝数设置三个重复，并包括一个阴性对照（NTC，无模板DNA），以制备标准曲线。
      注意：每条标准曲线的R2值均大于0.99。
  2. 为所有样品、标准品和NTC配制20 µL的qPCR反应体系。所有样品均需进行三重复qPCR分析。
    1. 开始实验前，将所有反应组分（包括qPCR预混液、引物、无核酸酶水、标准品和样品）置于冰架上冷却。
    2. 为每个样品、标准品和NTC配制20 µL的qPCR反应体系，包含10 µL SYBR Green预混液、0.5 µL的10 µM正向引物、0.5 µL的10 µM反向引物、8 µL无核酸酶水，以及1 µL的10 ng/µL模板DNA、标准品或去离子水。
      注意：使用下表所示的引物组可在常规PCR中为qPCR检测pmoA1和mcrA基因获得最佳结果（见表1）。为提高准确性，每个样品应设置三重复。以下步骤提供了一种高效方法，为每个样品配制总体积为60 µL的三重复反应体系。
      1. 在2 mL离心管中配制反应混合液，包含预混液、特定基因的正向和反向引物以及无核酸酶水，但不加入模板DNA。
        注意：配制反应体系时应考虑移液误差。例如，若有24个样品和8个标准品，则应按33个反应总量计算，而非32个，以减少移液误差。在此情况下，三重复反应所需的总体积如下：预混液990 µL（33个反应 × 3重复 × 10 µL）、正向引物49.5 µL（33 × 3 × 0.5 µL）、反向引物49.5 µL（33 × 3 × 0.5 µL）、无核酸酶水792 µL（33 × 3 × 8 µL）。
      2. 根据样品和标准品数量准备相应数量的PCR管。
      3. 将57 µL已配制的反应混合液分装至每个PCR管中。
        注意：为实现每个样品的三重复qPCR检测，每管中加入57 µL反应混合液（不含模板DNA、标准品或水）。该体积将均分为三份，每孔加入19 µL。
      4. 向每管中加入3 µL模板DNA、标准品或无核酸酶水，并通过轻弹管底混匀。
        注意：此时每管中反应体系总体积为60 µL。
    3. 将每管中20 µL的反应混合液分装至96孔qPCR板的指定孔中。使用加样器将粘性PCR封板膜密封PCR板。
    4. 将密封后的PCR板在1,000 × g条件下离心1分钟，确保充分混匀并消除孔内气泡。
  3. 将PCR板放入热循环仪中。开启qPCR仪器，打开相关软件以设置反应程序。
    1. 根据qPCR预混液说明书设置反应程序。采用以下程序：95 °C预变性10分钟，随后进行35个循环，每个循环包括95 °C变性15秒，退火步骤在表1中对应引物指定的退火温度下进行45秒，最后72 °C延伸30秒。
    2. 将96孔qPCR板中的标准品和NTC的排布方式设置为与含样品的PCR板一致。
  4. 采用绝对定量标准曲线法对每个样品中扩增产物及基因拷贝数进行定量分析33。

6. 南德克萨斯海岸湿地甲烷循环基因的可视化

  1. 开源地理信息系统（GIS）软件 ArcGIS Pro 并以指定名称保存项目文件 研究区域 在计算机的指定文件夹中。
  2. 点击 地图 在左上角 | 底图 并选择 带标签的地形图 作为 底图.
  3. 点击 定位 | 搜索 当搜索栏打开后，通过输入区域名称来定位研究区域；该区域将会显示出来。
  4. 使用地理配准绘制特定区域。
    1. 点击 查看 | 目录窗格 从上层。
    2. 双击 文件夹 来自产品目录 文件名.
    3. 右键单击 地理数据库 (.gdb) 文件 然后点击 新 | 特征类别 和 创建要素类 将会显示。
    4. 类型 名称 和 别名 框并单击 完成 在底部。
    5. 点击 查看 | 目录。该 别名 姓名将显示在 内容窗格.
    6. 点击 编辑 来自 上层 | 创建。该 创建特征 窗格将打开。双击 别名 在 创建特征 窗格，以及 配置工具反馈选项 将出现。
    7. 选择 线条然后在地图上绘制线条，以勾勒出研究区域的外部边界。绘制完成后，双击地图。
  5. 最小化 GIS 软件，然后打开一个电子表格。输入 样本名称 在第一列中，输入 纬度 在第二列中，以及 经度 在第三列中。使用接下来的四列用于qPCR数据 pmoA1, pmoA2, mmoX，以及 mcrA.
  6. 将文件保存在 CSV 格式 在计算机的任何特定文件夹中。
  7. 再次打开GIS软件并点击 添加数据 | XY 点数据.
  8. 从计算机的文件夹中选择 CSV 文件 输入表格 盒子。重命名文件名 输出要素类，然后点击 运行 在地图上显示采样点。
  9. 点击顶部的搜索栏进行搜索 克里金法.
  10. 选择采样站点文件，然后选择 pmoA1.
  11. 点击 环境 选择 采样站 在图层和蒙版中 | 单击 运行.
  12. 按照步骤 6.9、6.10 和 6.11 中所述的方案进行操作，以制备 克里金法 用于 pmoA2, mmoX，以及 mcrA 整个研究区域。
  13. 创建地图布局。
    1. 点击 插入 从上层 | 新版式，并选择 ANSI - 横向布局.
    2. 点击 地图框，选择 使用克里金法绘制地图，通过绘制一个矩形将所有地图放置在布局中，这将使地图在布局中可见。
    3. 选择 北向箭头 并将其放置在布局中以指示北方方向。
    4. 选择 比例尺 以显示地图上该区域的比例尺。
    5. 点击 图注 显示图例，然后将其放入布局中。
    6. 点击 网格 并选择任意一种黑色标线选项。这将创建包含纬度和经度的网格，并在其中显示 内容窗格 带有标签 黑色水平刻度标签网格.
    7. 双击 黑色水平刻度标签网格，然后选择 组分. 点击 蜱虫 1 和 网格，然后点击右侧的叉号以移除这些组件。
  14. 点击 分享 从上层开始，然后点击 导出布局. 选择文件类型为 PDF，使用计算机保存文件 名称框，将垂直分辨率设置为 500 DPI，然后单击 导出 生成地图的 PDF 文件。

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结果

为了了解南德克萨斯州沿海湿地中与CH4循环相关基因（mcrA、pmoA1、pmoA2和mmoX）的分布和丰度，对每个样品提取的环境DNA（eDNA）进行了巢式PCR（cPCR）和定量PCR（qPCR）分析。针对每个生物标志物，选用先前研究中报道的通用引物进行cPCR扩增（表1）22,34,35,36,37，并根据样品特性和环境条件对退火温度和引物浓度进行了优化调整。例如，16S rRNA、pmoA1和pmoA2在标准退火温度下未能有效扩增，因为这些基因大多在低于标准退火温度的条件下才能良好扩增（数据未显示）。此外，在cPCR过程中，使用10 ng/µL的...

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讨论

沿海湿地被认为是大气甲烷的重要来源，而甲烷是一种重要的温室气体40。尽管已有针对湿地中甲烷通量及产甲烷菌的研究41,42,43，但对于甲烷氧化菌在不同环境或不同管理措施下的作用机制仍知之甚少，尤其是在水位波动的湿地中44。此外，环境DNA（eDNA）中广泛存在的腐殖酸等抑制物使提取和扩增过程复杂化45，可能导致假阴性结果46。这一挑战还因引物在eDNA上的扩增效率存在差异而进一步加剧，提示此类研究中需进行系统性验证47。因此，本研究为理解南德克萨斯沿海湿地这一研究尚不充分的区域中的甲烷循环建立了基础方法体系。通过聚焦于PCR技术的开发与验证，本研究推动了在这些动态生态系统中对关键甲烷循环基因的检测能力。

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

我们感谢 C-REAL 成员在野外观察和实验室分析中提供的帮助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.2 mL PCR管赛默飞世尔科技AB0620https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AB0620?SID=srch-srp-AB0620
0.5 mL PCR管普洛麦格E4941https://www.promega.com/products/biochemicals-and-labware/tips-and-accessories/0_5ml-pcr-tubes/?catNum=E4941
10 μL型提示赛默飞世尔科技05-408-187Fisherbrand SureGrip 吸头，带架或可重复装填系统，天然色；10μL；| Fisher Scientific
15 mL 离心管赛默飞世尔科技14-959-53Ahttps://www.fishersci.com/shop/products/falcon-15ml-conical-centrifuge-tubes-5/p-193301
200 μL型尖端赛默飞世尔科技05-408-190Fisherbrand SureGrip 吸头，带架或可补充装，自然色；200μL；| Fisher Scientific
1000 μL型小技巧赛默飞世尔科技02-707-402https://www.fishersci.com/shop/products/sureone-micropoint-pipette-tips-specific-standard-fit/02707402?gclid=Cj0KCQiAp
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ArcGIS Pro esrihttps://www.esri.com/zh-cn/arcgis/products/arcgis-pro/overview?srsltid=AfmBOopatJ4
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CFX Duet 实时荧光定量 PCR 系统 Bio-Rad12016265https://www.bio-rad.com/zh-cn/product/cfx-duet-real-time-pcr-system?ID=97722926-9ed9-16a4-1d83-c92f587e427a
康宁 Lambda plus 单通道移液器
体积 0.5–10 μL		Sigma-AldrichCLS4071-1EAhttps://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/cls4071
康宁 λ 单通道移液器，体积范围 100-1000 μLSigma-AldrichCLS4075-1EAhttps://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/cls4075
康宁 λ 单通道移液器，体积范围 20-200 μLSigma-AldrichCLS4074-1EAhttps://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/cls4074
FastDNA土壤试剂盒MP Biomedical116560200-CFhttps://www.mpbio.com/us/116560000-fastdna-spin-kit-for-soil-samp-cf?srsltid=AfmBOoqOxxGilzY3IHNIZR
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基因拷贝数  计算器科学导论https://scienceprimer.com/copy-number-calculator-for-realtime-pcr .
高速台式离心机赛默飞世尔科技75004241https://newlifescientific.com/products/thermo-scientific-sorvall-st16-high-speed-benchtop-centrifuge-75004241?gad_source=1&gclid=Cj0KCQiApN
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高速微型离心机VWR75838-336https://us.vwr.com/store/product/20546590/null
Lysing Matrix E 管 含玻璃珠/陶瓷微球的管子
微量离心管赛默飞世尔科技02-681-320https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-low-retention-microcentrifuge-tubes-8/02681320?gclid=Cj0KCQiAp
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