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方法文章

高效且安全的小鼠肾脏基因递送 通过 腺相关病毒载体的缓慢逆行性肾盂注射

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DOI：

10.3791/67716

⸱

2025年8月1日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Medical Genetics, Oregon Health & Science University, 2Department of Molecular Microbiology and Immunology, Oregon Health & Science University, 3Division of Neuroscience, Oregon National Primate Research Center

本文内容

摘要

本报告详细介绍了腺相关病毒载体的局部注射方法 通过 小鼠肾脏中肾盂的有效且安全的基因转导

摘要

有效方法的开发 体内 将基因递送至肾脏的工具与方法对于推动肾脏基础研究及肾脏疾病的基因治疗至关重要。此外，随着基因检测技术的进步，单基因肾脏疾病的检出率不断提高，这进一步凸显了基因治疗在治疗甚至治愈难治性遗传性肾脏疾病方面的潜力。在这一领域，腺相关病毒（AAV）载体因其作为高效基因递送平台的优异性能而受到越来越多关注 体内 基因递送；然而，针对肾脏中每一种具有治疗意义的细胞类型，腺相关病毒（AAV）载体介导的基因递送最有效且最安全的方法尚未完全确立。本文详细描述了AAV载体慢速逆行肾盂（RP）注射的方法，并展示了当选用合适的AAV衣壳时，该方法在小鼠肾脏中具有高效的转导潜力。此外，该方法不仅适用于标准的氯化铯超速离心纯化的AAV（CsCl AAV）载体，也适用于通过超滤离心制备的AAV（CU AAV）载体小量制备物，后者可利用无需专业AAV载体技术的简便方法快速制备。例如，本研究证明，通过慢速RP注射CsCl和CU AAV-KP3载体均可在小鼠肾脏近端小管中实现高效转导，且未见明显组织损伤，而此前报道的水动力学方法则不可避免地导致组织损伤。因此，本研究强调，选择特定AAV衣壳衍生的载体进行慢速逆行RP注射是一种有效且安全的肾脏基因递送方法。该方法可广泛应用于包括基因治疗研究在内的多种肾脏研究领域。使用CU AAV载体小量制备物将显著提高实验通量，并提升获取初步数据和关键研究见解所需的时间与成本效率。

引言

在小型和大型实验动物中实现有效且安全的肾脏基因递送方法，为推进基础肾脏研究和探索创新治疗策略提供了关键机遇。建立此类方法对于多种肾脏疾病的基因治疗尤为重要。近期临床遗传检测技术的进步表明，单基因性肾脏疾病的患病率高于此前估计，影响约30%的慢性肾脏病（CKD）患者1。CKD以进行性肾损伤为特征，最终导致肾功能衰竭，目前尚无真正有效的疾病修饰疗法。血液透析和肾移植是当前可用的治疗手段，但这些方法存在局限性，显著影响CKD患者的生活质量2。因此，作为一种已在临床上证实可有效治疗遗传性疾病的强大策略，基因治疗近年来受到广泛关注，被视为治疗导致CKD的遗传性肾脏疾病的新途径3,4,5,6。该方法可直接针对疾病的根源，有望实现治愈。

尽管该领域不断取得进展，但将基因递送至肾脏在科研和治疗应用中仍然是一个重大挑战。由于肾脏结构复杂以及存在独特的生理屏障（包括由肾小球内皮细胞、肾小球基底膜和足细胞足突构成的肾小球滤过屏障），高效靶向肾脏细胞递送治疗性基因十分困难。目前已探索了多种靶向肾脏的基因递送策略，包括直接向肾皮质（RC）注射7,8、肾动脉（RA）注射9,10,11、肾静脉（RV）注射12,13,14、肾盂（RP）注射15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25，以及病毒或非病毒基因递送载体的静脉（IV）注射19,26,27,28,29,30，还有超声联合微泡介导的核酸递送技术31,32。这些方法展现出不同的转导效率或功能效果，结果往往不一致且难以解释（参见文献3,33,34,35综述）。目前肾脏基因递送技术仍不成熟，导致不同载体系统和方法之间难以进行直接比较。然而，局部递送方法能够将高浓度的递送剂直接送达肾脏，通常比全身性静脉注射获得更优的效果。此外，腺相关病毒（AAV）载体因其良好的安全性以及已被证实的临床转化潜力36,37，成为研究最广泛、最受认可的肾脏基因转移首选载体。

常见的AAV血清型及工程化衣壳在小鼠静脉注射后，已证明可有效转导肾脏中的系膜细胞和间充质细胞28,30,38。值得注意的是，近期研究表明，在肾病综合征和Alport综合征的小鼠模型中，静脉注射AAV9可有效转导足细胞，但在健康肾脏中未观察到该效应38,39；而静脉注射一种工程化的AAV2衣壳则可在健康和炎症状态下的小鼠肾脏中特异性靶向肾小球内皮细胞40。历史上，通过静脉途径转导肾小管一直具有挑战性。然而，最近研究发现，通过肾实质注射特定AAV衣壳（如AAV-KP1）41，可实现近端小管的转导效率，较基准AAV9衣壳提高一个数量级以上38。尽管仍需进一步优化，这些进展为肾脏基础研究和基因治疗开辟了新的途径，提供了以往无法实现的研究机会。

本文详细介绍了慢速逆行肾盂注射腺相关病毒载体作为向小鼠肾脏递送基因的有效且安全的方法38作为该技术的代表性示例，AAV-KP3被选为典型衣壳，因其被发现是六种衣壳之一（即AAV-KP1、AAV-KP2、AAV-KP3）41AAV-DJ42AAV2G943，以及 AAV2.7m844) 在小鼠经肾动脉注射后，与AAV9相比显示出增强的肾脏转导效果38值得注意的是，缓慢逆行RP注射的肾组织未表现出明显组织损伤，而此前报道的采用水动力法处理的组织则不同。23,24此外，AAV 小量制备载体45 通过快速简单的离心超滤法粗略纯化（即CU AAV载体）所获得的肾脏转导水平，在相同载体基因组滴度给药条件下，约为经标准氯化铯（CsCl）密度梯度超速离心法纯化的AAV载体（即CsCl AAV载体）所能达到水平的70%。因此，本文所提出的方法与观察结果为致力于增强小鼠乃至更大动物肾脏基因递送的研究人员提供了宝贵且实用的资源。

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方案

此处所述的所有动物实验均经俄勒冈健康与科学大学机构动物照护与使用委员会批准 & 科学大学（OHSU）进行，并遵循OHSU动物护理指南。本研究使用八周龄C57BL/6J雄性小鼠。本研究中使用的试剂和设备列于下文 材料表.

1. 通过无腺病毒的质粒转染法生产 AAV 载体

  1. 在37 °C、5%二氧化碳（CO₂）培养箱中，使用添加了10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素-链霉素混合液和1 mM L-谷氨酰胺的高糖（4.5 g/L）杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）培养人胚胎肾（HEK）293细胞2).
  2. 在转染前第-2天（即转染前48小时），接种4 × 106 每个T225培养瓶中接种HEK 293细胞，加入40 mL培养基，具体操作如步骤1.1所述。第0天细胞融合度达到约95%。
    注意：培养规模可根据具体应用进行调整。对于AAV小量制备（步骤2），应根据目标滴度和载体浓度准备适当数量的培养瓶，需考虑到纯化过程通常会导致约50%的材料损失。为实现 >6 × 1012 vg/mL 的 AAV9 和 AAV-KP3 载体，用于小鼠视网膜下注射，剂量为 3 x 1011 在50 µL载体溶液中使用vg/小鼠时，建议至少使用2个培养瓶。对于大规模AAV载体生产，例如用于氯化铯密度梯度纯化的AAV载体（CsCl AAV），通常使用25个或更多培养瓶。
  3. 第0天：质粒DNA转染
    1. 转染前准备
      1. 确保细胞融合度达到约95%。
      2. 将添加了1%青霉素-链霉素混合液和1 mM L-谷氨酰胺但不含FBS（即无血清培养基）的DMEM在37 °C水浴中预热。
      3. 使线性聚乙烯亚胺（PEI）溶液恢复至室温。
    2. 质粒DNA混合物的制备
      1. 将质粒（pAAV-CAG-tdTomato、pRepCap 和 pHelper 各 15 µg）混合于 1 mL 不含 CaCl₂ 的磷酸盐缓冲液（PBS）中2 或 MgCl2 在无菌的1.5 mL微量离心管中。每瓶总DNA量为45 µg。
        注意：如果质粒DNA溶液的体积很小，可忽略不计。但如果总溶液体积≥225 µL，则建议进行体积调整。本研究中所用质粒的序列信息可在 补充文件 1.
    3. PEI 转染
      1. 向1 mL PBS中加入90 µL PEI溶液（1 mg/mL），然后与上述制备的PBS-质粒DNA混合液在50 mL聚丙烯管中混合。最终体积约为2 mL（相当于培养基体积的5%）。
      2. 涡旋振荡试管5秒，并用离心机短暂离心，使液体全部收集至管底。
    4. 室温孵育15分钟，以形成质粒DNA-PEI复合物。
    5. 15分钟孵育结束后，将步骤1.3.1.2中配制的40 mL预热无血清培养基加入质粒DNA-PEI复合物中，总体积约为42 mL。
    6. 将 T225 培养瓶中的培养基更换为步骤 1.3.4 中所述的含有质粒 DNA-PEI 复合物的无血清培养基。
    7. 将细胞在此转染培养基中培养至第5天收获（无需更换培养基）。
    8. 第2天，在倒置荧光显微镜下观察转染了表达荧光蛋白质粒（如pAAV-CAG-tdTomato）的细胞，以评估质粒转染效率。
      注意：上述条件通常可实现超过70%的转染效率。可能会观察到一些形态学变化（如细胞伸长），这可能是由于无血清环境所致。
    9. 在第3至5天，继续将转染的细胞置于含5% CO₂的37 °C培养箱中培养2.
    10. 第5天，将细胞和含病毒的培养基收集至50 mL聚丙烯管中。
    11. 将样品储存于 -80 °C，直至使用。

2. 腺相关病毒载体（AAV小量制备）的离心超滤纯化（CU）

  1. 将步骤 1.3.11 中的冷冻样品在 37 °C 水浴中解冻。
  2. 保留 1 mL 粗裂解液用于 DNA 点杂交分析（作为第 1 组分）。
  3. 向一个 50 mL 离心管中加入 80 µL 1 M 氯化镁（MgCl2，终浓度为 2 mM）、160 µL 0.1 M 氢氧化钠（NaOH，终浓度为 0.4 mM）和 16 µL 粘质沙雷氏菌核酸酶（终浓度为 100 单位/mL）。在 37 °C 下孵育 1 小时，孵育期间每 15 分钟涡旋混匀一次 。
  4. 将经粘质沙雷氏菌核酸酶处理的样品 收集至一个 250 mL 离心瓶中，在 4 °C 下以 10,000 × g 离心 30 分钟。
  5. 使用 50 mL 血清移液管将上清液 转移至一个 50 mL 聚丙烯管中。
  6. 使用 0.45 µm PVDF 注射式滤器过滤上清液以去除碎片。保留 1 mL 经 0.45 µm 滤膜过滤的样品用于 DNA 点杂交分析（作为第 2 组分）。
  7. 向一个 100 kDa 分子量截留值（MWCO）的离心超滤管中加入 10 mL 分子生物学级水，在 4 °C 下以 2,000 × g 离心 10 分钟，弃去滤过液。
  8. 向离心超滤管中加入 15 mL PBS 中的 5% 山梨醇溶液，在 4 °C 下以 2,000 × g 离心 10 分钟，弃去滤过液。
  9. 按步骤 2.6 所述加入最多 15 mL 的 0.45 µm 滤过样品，在 4 °C 下以 2,000 × g 离心 15 分钟进行浓缩，直至达到约 500 µL 的目标体积。保留 1 mL 滤过液用于 DNA 点杂交分析（作为第 3 组分）。
    注意：每次离心前，使用移液器重悬截留物以破坏浓度梯度。切勿用移液器吸头接触膜。若 15 分钟离心后未达到目标体积，可根据管中剩余体积适当延长离心时间。
  10. 重复步骤 2.9，直至全部样品完成过滤，达到约 500 µL 的目标体积。保留步骤 2.10 第一和第二次循环所得滤过液各 1 mL 用于 DNA 点杂交分析（作为第 4 组分和第 5 组分）。
    注意：单个离心超滤管可用于处理来自两个或多个培养瓶的样品。
  11. 加入 15 mL PBS 中的 5% 山梨醇溶液，在 4 °C 下以 2,000 × g 离心 15 分钟，直至达到约 500 µL 的目标体积。保留 1 mL 滤过液用于 DNA 点杂交分析（作为第 6 组分）。
  12. 重复步骤 2.11（作为第 7 组分）。
    注意：若下游实验需要更高的 AAV 滴度，最终目标体积可进一步减少至 150 µL。
  13. 将超滤后的 AAV 载体转移至带 O 形圈的 2 mL 螺口管中。保留 10 µL 超滤后的 AAV 载体用于 DNA 点杂交分析（作为第 8 组分）。
  14. 采用先前所述方法通过 DNA 点杂交分析测定 AAV 滴度46。
    注意：与氯化铯纯化的载体（CsCl AAV）相比，CU 纯化的载体（CU AAV）含有更高水平的空壳衣壳污染及宿主细胞来源的杂质。这些因素可能影响转导效率和免疫反应，在数据分析时需谨慎考虑。

3. AAV 载体的 CsCl 密度梯度纯化

  1. 将步骤 1.3.11 中的冷冻样品在 37 °C 水浴中解冻。
  2. 在 4 °C 下以 10,000 × g 离心 30 分钟，以去除细胞碎片。
  3. 收集上清液，并通过加入聚乙二醇 8000（PEG，终浓度为 8%）和氯化钠（终浓度为 500 mM）沉淀上清液中的 AAV 载体。
  4. 在冰上孵育 3 小时。
  5. 在 4 °C 下以 10,000 × g 离心 30 分钟，获得含有 AAV 的沉淀物。
  6. 弃去上清液，并用 10 mL 含有 Sarkosyl 的重悬缓冲液（50 mM HEPES、150 mM NaCl、1% Sarkosyl，pH 8.0）重悬沉淀物。
  7. 将沉淀物悬液转移至 15 mL 聚丙烯管中，4 °C 过夜保存。
  8. 次日，用粘质沙雷氏菌核酸酶（终浓度为 200 单位/mL）和 MgCl2（终浓度为 2 mM）处理沉淀物悬液。
  9. 在 37 °C 下孵育 1 小时。
  10. 在 4 °C 下以 10,000 × g 离心 30 分钟。
  11. 收集上清液，并加入氯化铯（CsCl，终折射率（RI）= 1.3710 ± 0.0005）和 EDTA（终浓度为 20 mM）。
  12. 将样品加入 29.9 mL 超速离心管中，并加入顶液（50 mM HEPES、150 mM NaCl、20 mM EDTA、CsCl（RI = 1.3710 ± 0.0005），pH 8.0）至满。
  13. 在 12 °C 下以 41,000 × g 离心 22 小时。
  14. 在超速离心管的底部和侧壁打孔，共收集 15 份 2 mL 的组分。
  15. 取每份 10 µL 用于检测折射率并进行 DNA 点杂交分析46。
  16. 根据折射率和 DNA 点杂交分析结果，确定含有 AAV 载体的最佳 5 个组分。
  17. 合并最佳的 5 个组分（总体积约 10 mL），并将折射率调整至 1.3710 ± 0.0005。
  18. 将样品加入 11.2 mL 超速离心管中，并加入顶液至满。
  19. 在 12 °C 下以 65,000 × g 离心 12 小时。
  20. 在 11.2 mL 超速离心管的底部和侧壁打孔，共收集 18 份 0.5 mL 的组分。
  21. 取每份 10 µL 用于检测折射率并进行 DNA 点杂交分析46。
  22. 根据折射率和 DNA 点杂交分析结果，确定含有 AAV 载体的最佳 6 个组分。
  23. 合并最佳的 6 个组分（总体积约 3 mL），并将其加载至透析夹中。
  24. 将透析夹漂浮于含 0.001% 非离子表面活性剂的 1.3 L PBS 缓冲液中，加入搅拌子搅拌 2 小时，以去除 CsCl。
  25. 重复步骤 3.24 两次（共透析 6 小时）。
  26. 将夹子转移至含 0.001% 表面活性剂的 500 mL PBS 缓冲液中 5% 山梨醇溶液中，进行 2 小时的缓冲液置换。
  27. 用注射器从透析夹中收集样品，并使用 0.22 µm PVDF 注射式滤器过滤收集的样品。
  28. 通过定量点杂交分析46测定 AAV 滴度。

4. 通过 SDS-PAGE 结合银染法对 AAV 载体制备物进行质量评估

  1. 将载体样品与6× Laemmli缓冲液混合，CsCl纯化的AAV载体使用1×1010 vg，CU纯化的AAV载体使用1×109 vg和1×1010 vg，总体积为18 µL（载体样品:6× Laemmli = 15:3），在100 °C下加热5分钟。
  2. 将加热处理后的AAV载体样品加入7.5% SDS-PAGE凝胶中，使用Tris-甘氨酸-SDS电泳缓冲液，以20 mA电流进行电泳。
  3. 从凝胶夹中取出凝胶，用超纯水冲洗，然后按照试剂盒说明书使用银染试剂盒对凝胶进行染色。
  4. 将加载CsCl纯化AAV载体的凝胶在显影液中孵育7分钟，而加载CU纯化AAV载体的凝胶仅孵育2分钟，以避免信号饱和。
    注意：与CsCl纯化的AAV载体相比，CU纯化的AAV载体样品中含有更高水平的蛋白质杂质。因此，在电泳结束后需将加载CsCl和CU纯化AAV载体的凝胶分开，并分别进行银染，以防止因染色方法灵敏度过高而导致信号饱和。

5. 通过 Western 印迹法鉴定 CU AAV 载体样品中的 AAV VP 蛋白

  1. 将1 × 109 vg的CU AAV载体样品与6x Laemmli缓冲液混合，总体积为18 µL（载体样品:6x Laemmli = 15:3），在100 °C加热5分钟。
  2. 将加热处理后的AAV载体样品加入7.5% SDS-PAGE凝胶中，使用Tris-甘氨酸-SDS电泳缓冲液，以20 mA电流进行电泳。
  3. 使用半干式转膜系统，将凝胶中的蛋白质电转移至经甲醇活化的聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。
  4. 用含5%脱脂奶粉的1x Tris-缓冲盐水-Tween 20（TBST）溶液在室温下封闭膜1小时。
  5. 将封闭后的膜与一抗溶液（兔多克隆抗VP抗体，用含5%脱脂奶粉的1x TBST溶液稀释至1:1000）在4 °C孵育过夜。
  6. 用1x TBST溶液洗涤膜，每次10分钟，共洗3次。
  7. 将膜与二抗溶液（辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG抗体，用含5%脱脂奶粉的1x TBST溶液稀释至1:5000）在室温下孵育1小时。
  8. 用1x TBST溶液洗涤膜，每次10分钟，共洗3次。
  9. 使用Western印迹成像系统检测膜上的信号。

6. 肾盂（RP）注射

  1. 术前准备与麻醉
    1. 使用精确到 0.1 g 的电子天平，在塑料烧杯中测量每只小鼠的体重。
    2. 根据小鼠体重，皮下注射美洛昔康（5 mg/kg），以提供术前镇痛。
    3. 用含 5% 山梨醇的 PBS 将 AAV 载体溶液稀释至浓度为 6.0 × 1012 vg/mL，并置于冰上保存。
      注意：为补偿气密性玻璃注射器和硅胶管中的死体积，需额外准备比总注射体积（50 μL × 待注射小鼠数量）多 40 μL 的 AAV 溶液。
    4. 使用持针器仅弯曲并折断 30 G 针头的针尖部分。
    5. 在体视显微镜下，按以下顺序连接部件：30 G 针尖、4 cm PE-10 管的钝端、15 cm 硅胶管、另一 30 G 针头以及气密性玻璃注射器，从针尖开始依次连接 （图 1D）。使用前对两根导管进行灭菌处理，并在无菌洞巾上完成组装以维持无菌状态。可耐受高压灭菌的硅胶管采用标准蒸汽灭菌法灭菌。在灭菌 PE-10 管前，将其一端斜向剪切，形成斜面针头，以便顺利插入硅胶管。将 PE-10 管浸入 2% 戊二醛中超过 10 小时进行灭菌，随后用无菌 PBS 充分冲洗，再投入使用。
    6. 将连接好的气密性玻璃注射器安装至输液泵上。
    7. 使用输液泵将步骤 6.1.3 中配制的 90 µL AAV 载体溶液吸入气密性玻璃注射器中。
    8. 设定输液泵的输注模式如下：目标体积为 50 µL，流速为 50 µL/min。
    9. 将小鼠放入塑料麻醉舱中，以 1.5 至 3.0 L/min 的流速通入含 4% 异氟烷的 100% 氧气，直至小鼠完全麻醉。
    10. 将小鼠鼻部置于鼻罩中，持续给予 1.5% 至 3.0% 异氟烷。在整个手术过程中，通过脚趾夹捏反射监测麻醉深度。
    11. 使用棉签蘸取眼用软膏涂抹于小鼠眼部，防止角膜干燥。
    12. 使用棉签蘸取脱毛膏去除小鼠左侧背部的毛发。
      注意：必须彻底冲洗干净脱毛膏，以防皮肤刺激。
    13. 将小鼠侧卧于连接热疗泵的闭环加热垫上，以维持体温在 37 °C（无需使用胶带固定）。
    14. 使用棉签蘸取聚维酮碘和 70% 乙醇，交替涂抹三次，以环形方式从切口部位开始对剃毛区域进行消毒。
    15. 用无菌手术洞巾覆盖小鼠。
  2. 向左侧肾脏进行肾盂注射
    1. 在左侧肾脏对应位置的肋脊角水平，使用无菌手术刀在皮肤层做约 1 cm 的切口。
    2. 完成皮肤切口后，以相同长度切开肌肉层。
      注意：若切口过短，则无法暴露肾脏，反而可能误暴露体积较小的脾脏；而若 切口过长，则切口本身无法固定肾脏，导致肾脏持续滑回腹腔内。
    3. 用手指轻压腹部（避免直接接触肾脏），使肾脏经切口处自然外露（图 1A）。
    4. 轻微清除周围脂肪组织，使肾盂呈现为一小片白色区域并清晰可见。
    5. 首先使用直型微血管夹夹闭输尿管，再使用弯型微血管夹同时夹闭肾动脉和肾静脉。
      注意：肾脏颜色变为深红色，表明肾血流进出已成功阻断（图 1B）。
    6. 使用弯头镊将连接输液泵的 30 G 针头插入肾盂腔约 3 mm 深处，并启动输液泵，以 50 µL/min 的流速在 1 分钟内注入 50 µL AAV 载体溶液（图 1C）。
    7. 保持针头和血管夹位置 5 分钟，以延长 AAV 载体在注射肾脏中的暴露时间。
      注意：合适的留置时间可能因 AAV 衣壳类型而异。研究表明，5 分钟的留置时间足以实现 AAV-KP1 或 AAV-KP3 载体的有效转导。
    8. 5 分钟孵育结束后，移除血管夹。
      注意：肾脏颜色立即由深红色恢复为鲜红色，表明肾脏血流已恢复。
    9. 小心缓慢地拔出注射针头，同时用带棉签的棉签轻压注射部位。确认注射部位无出血。无需使用止血贴。
    10. 轻柔地将肾脏复位至腹膜腔内。
    11. 使用 6-0 可吸收缝线缝合肌肉层，使用 5-0 单股缝线缝合皮肤。
    12. 为支持体液平衡，向小鼠背部皮下注射 1 mL 生理盐水。
    13. 更换已使用的 30 G 针尖为新制备的针尖，根据机构关于危险化学品废弃物管理的指南丢弃使用过的 30 G 针头，并使用输液泵向注射器中加载 50 µL AAV 载体溶液，用于下一只小鼠的注射。
    14. 对组内除最后一只外的所有小鼠重复步骤 6.2.12–6.2.13，最后一只小鼠无需执行步骤 6.2.13。
    15. 完成所有计划中的注射后，根据机构关于危险化学品废弃物管理的指南丢弃被污染的针头和导管。
  3. 术后监测与护理
    1. 在肾盂注射后 24 小时和 48 小时，向小鼠背部皮下注射美洛昔康（5 mg/kg），以提供术后镇痛。
    2. 在肾盂注射后 24 小时，向小鼠背部皮下注射 1 mL 生理盐水，以支持体液平衡。
    3. 术后每天监测注射小鼠的体重和一般状态，持续 1 周。若出现体重下降超过 10% 的情况，则每周三次、连续一周向小鼠背部皮下注射 1 mL 生理盐水。若未见改善，应对受影响小鼠实施安乐死。

7. 组织采集与冷冻切片

  1. 固定与冷冻保护溶液的配制
    1. 0.2 M 磷酸盐缓冲液（共 1 L）
      1. 在1 L玻璃烧杯中加入800 mL超纯水。
      2. 加入 6.4 g 磷酸二氢钠（NaH₂PO₄）2PO4) 和 21.8 克磷酸氢二钠（Na2HPO4) 加入溶液中。
      3. 用盐酸调节 pH 至 7.4。
      4. 用超纯水定容至 1 L。
      5. 4 °C 保存，直至使用。
    2. 4% 多聚甲醛（PFA）溶液（共 40 mL）
      1. 将10 mL 16% PFA、20 mL 步骤7.1.1中制备的0.2 M磷酸盐缓冲液和10 mL超纯水混合。
      2. 等分试样 10 mL 加入15 mL聚丙烯管中。
        注意：灌注固定前应现配4% PFA溶液。
    3. 30% 蔗糖溶液（共 40 mL）。
      1. 将30 mL PBS与12 g蔗糖混合。
      2. 完全溶解后，用 PBS 定容至 40 mL。
  2. 灌注固定与组织采集
    注意：灌注固定应在通风橱中进行，因为4% PFA溶液若被吸入，是一种强效有害化学物质。
    1. 使用异氟烷麻醉小鼠，将其置于仰卧位，并通过轻轻夹捏四肢确认其完全无反应。
      注意：根据机构指南，小鼠在诱导室中通过异氟烷深度麻醉。对于终末灌注，将动物转移至仰卧位的鼻罩，持续给予吸入性麻醉剂以维持麻醉状态。在开胸前，通过轻捏四肢完全无反应来确认麻醉深度足够。吸入性麻醉持续维持，直至灌注完成并确保动物死亡。
    2. 小鼠麻醉后，使用手术剪从腹部尾侧向剑突处做一正中切口。随后沿胸骨两侧分别做两个侧向切口，将胸壁向前牵开，以暴露心脏和主要血管。
    3. 打开右心房 通过 锐性解剖以减压循环系统。将25 G蝶形针插入左心室，以约10 mL/min的速度灌注50 mL PBS，引导液体流向升主动脉。
      注意：灌注脱血对于获得高质量的免疫荧光（IF）图像至关重要，因为血液具有自发荧光。为确保血液完全清除，本研究中使用了50 mL PBS，尽管通常使用20–30 mL。
    4. 以相同流速灌注20 mL在步骤7.1.2中配制的4% PFA溶液，确保更换溶液过程中不引入空气。
    5. 收获组织后，将其置于含有4%多聚甲醛溶液的15 mL聚丙烯管中，4 °C过夜保存，以进行后固定。若采集的组织中表达荧光蛋白，需用铝箔包裹管子以避光。
  3. 冷冻包埋
    1. 将组织转移至一个装有步骤7.1.3中配制的30%蔗糖溶液的15 mL聚丙烯管中，用于冷冻保护。
    2. 4 °C 下孵育，直至组织完全沉降至管底。
    3. 使用标准纹路镊子将组织转移至塑料冷冻模具中。
    4. 将OCT包埋剂覆盖于组织上，同时确保组织方向正确，并与冷冻模具底部齐平。
    5. 用OCT包埋剂填满模具顶部，用移液器吸头去除所有气泡。
    6. 将塑料冷冻模具置于含有2-甲基丁烷的低温浴中，该低温浴使用碎干冰在冰桶中冷却，直至OCT包埋剂完全冻结（OCT包埋剂会变为白色）。
    7. 将组织块保存在 -80 °C 下，直至使用。
  4. 冷冻切片
    1. 将冷冻组织块转移至 -20 °C 的冷冻切片机中，切片前使组织块温度达到平衡。
    2. 使用冷冻切片机将每个冷冻组织块切成所需厚度（通常为5 µm）。将组织切片置于显微镜载玻片上，用于免疫荧光染色。
    3. 切片可于 -80 °C 保存，以备后续使用。

8. 免疫荧光染色

  1. 将冷冻切片在室温下干燥 30 分钟。
  2. 用液体阻断笔圈定组织区域，并在室温下干燥 5 分钟。
  3. 每张切片加入 150 µL PBS 溶液，孵育 10 分钟以进行复水。
  4. 将切片置于水平台面上，每张切片加入 150 µL 用 PBS 稀释的 1% 牛血清白蛋白（BSA）溶液，室温孵育 45 分钟进行封闭。
  5. 每张切片加入 150 µL 一抗溶液（抗 Wilms 肿瘤 1（WT1）抗体，用 1% BSA 稀释至 1:100；抗 Na-K-2Cl 共转运蛋白 2（NKCC2）抗体，用 1% BSA 稀释至 1:100；或抗水通道蛋白 2（AQP2）抗体，用 1% BSA 稀释至 1:100），在湿盒中 4 °C 过夜孵育。
  6. 用 PBS 在室温下洗涤切片，每次 5 分钟，共洗涤 3 次。
  7. 每张切片加入 150 µL 二抗溶液（抗兔 IgG Alexa Fluor 647 抗体，用 1% BSA 稀释至 1:500）和 Lotus tetragonolobus 凝集素（LTL）-荧光素（用 1% BSA 稀释至 1:200），室温避光孵育 60 分钟。
  8. 用 PBS 在室温下洗涤切片 5 分钟。
  9. 将切片置于水平台面上，每张切片加入 150 µL Hoechst 33342 溶液（用 PBS 稀释至 1:10,000）进行细胞核染色，室温避光孵育 10 分钟。
  10. 用 PBS 在室温下洗涤切片 5 分钟。
  11. 每张切片加入 20 µL 封片剂，盖上盖玻片，将切片置于 4 °C 避光保存，直至进行成像分析。

9. 从组织中提取DNA

  1. 使用市售试剂盒从组织中提取 DNA（参见材料表）。
    1. 将组织转移至陶瓷珠管中，并加入 400 µL DNA 提取缓冲液（100 mM NaCl、20 mM EDTA、1% SDS 和 50 mM Tris-HCl，pH 8.0）。
    2. 使用匀浆器以 5 m/s 的速度匀浆 3 个循环，每个循环 20 秒。
    3. 在室温下以 2,000 × g 离心 2 分钟。
    4. 使用 P200 移液器收集 200 µL 上清液，并加入 10 µL 蛋白酶 K 溶液（终浓度为 1 mg/mL）。
    5. 涡旋振荡 15 秒混匀，然后在 55 °C 下孵育 1 小时。
    6. 加入 DNA 提取试剂盒中的裂解缓冲液 200 µL。
    7. 涡旋振荡 15 秒混匀，然后在 55 °C 下孵育 15 分钟。
    8. 加入 250 µL 100% 乙醇。
    9. 涡旋振荡 15 秒混匀，在室温下孵育 5 分钟。
    10. 将裂解液转移至 DNA 提取离心柱中。
    11. 在室温下以 6,000 × g 离心 1 分钟。
    12. 将离心柱放入新的 2 mL 收集管中，加入 500 µL DNA 提取试剂盒中的第一种洗涤缓冲液。
    13. 在室温下以 6,000 × g 离心 1 分钟。
    14. 将离心柱放入新的收集管中，加入 500 µL DNA 提取试剂盒中的第二种洗涤缓冲液。
    15. 在室温下以 6,000 × g 离心 1 分钟。
    16. 将离心柱放入新的 2 mL 收集管中，加入 500 µL 100% 乙醇。
    17. 在室温下以 6,000 × g 离心 1 分钟。
    18. 将离心柱放入新的 2 mL 收集管中，在室温下以 20,000 × g 离心 3 分钟。
      注：此步骤可确保离心柱膜完全干燥，避免乙醇残留进入洗脱液，从而干扰后续实验。
    19. 将离心柱放入新的 1.5 mL 微量离心管中，向离心柱中加入 35 µL DNA 提取试剂盒中的洗脱缓冲液。
      注：回收的洗脱液体积通常比初始加入的洗脱缓冲液体积少约 5 µL。
    20. 在室温下孵育 5 分钟。
    21. 在室温下以 20,000 × g 离心 1 分钟。
    22. 测定 DNA 浓度。
  2. 通过定量 PCR（qPCR）测定载体基因组拷贝数
    1. 用分子级水将步骤 9.1 中提取的 DNA 稀释至 25 ng/µL 的浓度。
    2. 设计用于载体基因组定量的 qPCR 引物对（本研究使用 tdTomato）以及用于定量提取 DNA 样品中二倍体基因组的小鼠参考基因 qPCR 引物对（本研究使用小鼠 agouti 基因）。
      注：本研究使用的引物序列如下：
      tdTomato 正向引物：5'-TATGAACGGAGCGAGGGGAG-3'
      tdTomato 反向引物：5'-TTCCACTAGACCCTGAGCCG-3'
      小鼠 agouti 正向引物：5'-GGCGTGGTCAGTGGTTGTG-3'
      ​小鼠 agouti 反向引物：5'-TTTAGCTTCCACTAGGTTTCCTAGAAA-3'
    3. 对于 25 µL 的 qPCR 反应体系，混合 4 µL 步骤 9.2.1 中稀释的 DNA 样品（在 25 µL 反应体系中总 DNA 量为 100 ng）、12.5 µL 2× qPCR 反应缓冲液、0.5 µL 步骤 9.2.2 中配制的 20 µM 正向和反向引物（每种引物终浓度为 400 nM）以及 7.5 µL 分子级水。
    4. 对用于 qPCR 的质粒标准品进行四次 DNA 浓度测定，并计算 DNA 浓度的平均值。
      注：本研究中，分别使用超螺旋环状 pAAV-CAG-tdTomato 质粒和含有源自小鼠 agouti 基因 PCR 目标序列的超螺旋环状质粒作为载体基因组定量和归一化的标准品。
    5. 制备覆盖 106 动态范围的质粒 DNA 标准品系列 1:10 梯度稀释液。
      注：每个样品和标准品应至少进行两次重复检测。
    6. 使用以下热循环条件进行 qPCR：95 °C 激活 10 分钟，随后进行 35 个循环，每个循环包括 95 °C 变性 15 秒，60 °C 退火/延伸 30 秒。
    7. 完成 qPCR 反应并获得样品中载体基因组和小鼠参考基因的双链（ds）拷贝数后，基于载体基因和参考基因已知浓度生成的标准曲线，将各样品中双链载体基因组拷贝数归一化至参考基因拷贝数，计算每二倍体基因组当量中的双链载体基因组拷贝数（ds-vg/dge）。
      注：可根据以下近似值确定 ds-vg/dge：100 ng 小鼠基因组 DNA 相当于 16,900 个二倍体（2N）小鼠细胞（即每个二倍体小鼠细胞含 5.92 pg DNA）。

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结果

最近一项研究发现，与尾静脉注射AAV9相比，有一小部分AAV衣壳在经肾动脉注射后表现出显著增强的肾脏转导能力38。该小部分包括AAV-KP3，这是一种通过DNA改组技术生成的嵌合型AAV衣壳41。因此，本研究选择AAV-KP3进行肾动脉注射，并以AAV9作为对照基准。AAV9-CAG-tdTomato载体（AAV9）和AAV-KP3-CAG-tdTomato载体（KP3）均在HEK293细胞中通过无腺病毒的质粒转染法生产，并采用CsCl密度梯度超速离心法（CsCl AAV）或使用100 kDa截留分子量滤膜的离心超滤法（CU AAV）进行纯化。CsCl AAV的制备流程已有文献报道47。

简而言之，含有细胞沉淀的5天培养基在-80 °C冷冻（步骤1.3.11）后被解冻，并进行聚乙二醇（PEG）沉淀、Sarkosyl重悬、粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）核酸酶处理以及两轮氯化铯（CsCl）密度梯度超速离心。通过折射率和D...

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讨论

本报告详细阐述了腺相关病毒（AAV）载体经肾盂逆行缓慢注射作为基因递送至小鼠肾脏的局部给药方法。安全实施肾盂注射的关键步骤之一是调节AAV载体的注射速率，以避免对注射侧肾脏实质造成损伤。在先前关于水动力肾盂注射的报告中，100 µL质粒DNA溶液在仅3秒内被注入小鼠肾脏24快速注射对于提高细胞膜的瞬时通透性以实现有效的DNA转染至关重要，但可能导致组织损伤24为降低此风险，应缓慢注射载体 通过 使用注射泵以50 µL/min的受控速率进行RP注射。该操作可有效防止RP注射侧肾脏的组织损伤。

另一个关键步骤是在注射时完全阻断肾动脉和肾静脉，这可以增加肾脏对注射的腺相关病毒（AAV）载体的暴露，从而提高其转导效率。先前的研究表明，在小鼠中，若经肾实质注射（RP注射）时未阻断肾血流，会导致肾脏转导效率降低38。为确认肾动脉和肾静脉已正确夹闭，肾脏迅速变暗可作为有用的视觉提示。此外，已有研究证实，在注射AAV-KP1载体时，阻断肾...

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披露

H.N. 获得由 Takara Bio Inc. 和 Capsigen Inc. 授权的 AAV 相关技术的特许权使用费，担任生物技术公司的顾问，并是 Capsigen Inc. 的联合创始人，同时持有 Capsigen Inc. 和 Sphere Gene Therapeutics 的股份。

致谢

我们感谢 Guangping Gao 和 James M. Wilson 提供 AAV9 辅助质粒，感谢 Katja Pekrun 和 Mark A. Kay 提供 AAV-KP3 辅助质粒。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.45 μm PVDF 注射器滤器MilliporeSigmaSLHVR33RS
1.5 mL 微量离心管 Fisher Scientific05-408-129
15 mL 聚丙烯管康宁352097
16% 甲醛电子显微镜科学公司15710
250 mL 离心瓶Fisher Scientific055641S24
2F 硅胶管Sai Infusion TechnologiesSIL-2-50 
25G 蝴蝶针Medex Supply26708
2-甲基丁烷MilliporeSigmaMX0760
2x qPCR反应缓冲液Fisher Scientific43-676-59Power SYBR Green PCR Master Mix
30G针头Becton-Dickinson &和公司305106
50 mL 聚丙烯管康宁430291
5-0 单股缝合线EthiconY463G
5 M NaClLonza51202
6-0 可吸收缝合线EthiconJ489G
7.5% Mini-PROTEAN TGX 预制胶
蛋白凝胶，10孔，30 µL		伯乐（Bio-Rad）4561023
Amersham ImageQuant 800 Western
印迹成像系统（Cytiva）		Cytiva29459405
Amicon 100 kDa 截留分子量，15 mL 离心管Millipore SigmaUFC910024
抗水通道蛋白2（AQP2）抗体Abcamab199975一种集合管细胞的标记物
抗Na-K-2Cl共转运蛋白2
(NKCC2) 抗体		StressMarq BiosciencesSPC-401粗升支的标记物
细胞
抗兔 IgG Alexa Fluor 647
抗体		杰克逊免疫研究实验室111-605-144
抗威尔姆斯瘤1（WT1）抗体Abcamab89901足细胞的标记物
Beckman Coulter OptiSeal 管
聚丙烯，29.9 mL		Fisher ScientificNC9691210
Beckman Coulter OPTISEAL 管Fisher ScientificNC9611575
苯佐那酶Sigma-Aldrich1016970001
牛血清白蛋白（BSA）Sigma-Aldrich5470
离心超滤管MilliporeSigmaUFC9100Amicon 100 kDa MWCO，15 mL
陶瓷珠管Fisher Scientific15-340-154
氯化铯Sigma-AldrichC3032-1KG
施加压力的钳子Fine Science Tools00071-14
闭环加热垫Stryker Medical8002-062-012
棉签Puritan806-WC
盖玻片Fisher Scientific12-541B
冷冻切片机Tanner ScientificTN50
弯头镊子精细科学工具11052-10
弯头型微血管夹Kleinert-Kutz65145肾动脉和肾钳
静脉
透析盒Fisher ScientificPIA52976
DNA提取试剂盒Qiagen57704QIAamp MinElute病毒离心柱试剂盒
D-山梨醇Sigma-AldrichS6021-1KG
杜尔贝科改良伊格尔培养基-
高葡萄糖		康宁15-013-CVDMEM-高糖（4.5 g/L）
EDTAFisher Scientific15-575-020
乙醇Decon Laboratories2716GEA
胎牛血清（FBS）VWR89510-186
气密性玻璃注射器Hamilton1710 TLL
戊二醛溶液Sigma-AldrichG6257
热疗泵Kent ScientificHTP-1500
HEPESSigma AldrichH4034-100G
Hoechst 33342英吉诺H3570
匀浆器Fisher Scientific15-340-163
人胚肾（HEK）293
细胞		安捷伦240073
冰桶Fisher Scientific07-210-104
输注注射泵哈佛仪器70-4507
异氟烷Piramal Critical CareNDC 66794-017-10
L-谷氨酰胺Fisher Scientific25030-081
液体阻隔笔Ted Pella22309
刀豆四棱豆凝集素（LTL）-
荧光素		Vector LaboratoriesFL-1321-2近端小管的标记物
氯化镁（MgCl2)MilliporeSigmaM1028
美洛昔康VetOneNDC 86136-012-10镇痛剂
显微镜玻片Fisher Scientific12-550-15
封片剂SouthernBiotech0100-01
持针器精细科学工具12501-13
OCT 化合物Sakura Finetek4583
眼用软膏Bausch & LombNDC 24208-313-34
PE-10聚乙烯管BD427401内径：0.28 mm
青霉素 && 链霉素混合液Fisher Scientific15140-122
磷酸盐缓冲液（PBS）Fisher Scientific10010-049
塑料冷冻模具Sakura Finetek4566
泊洛沙姆 188 非离子型表面活性剂
(10%)		Fisher Scientific24-040-032
聚乙二醇 8000Fisher ScientificBP233-1
聚乙烯亚胺（PEI）Polysciences23966
聚维酮碘Ricca Chemical Company395516
Power Blotter–半干式转膜
System		Fisher ScientificPB0010
蛋白酶K溶液Fisher Scientific25530049
兔抗腺相关病毒
病毒（AAV），VP1，VP2，VP3		美国研究产品公司03-61084
SarkosylFisher ScientificBP234-500
带螺帽的2 mL离心管康宁 AxygenSCT-200-SS-O-S
银染试剂盒Sigma-AldrichPROTSIL1-1KT
氯化钠（NaCl）Fisher ScientificS271
磷酸氢二钠
(Na2HPO4)		MilliporeSigmaS0876
磷酸二氢钠
(NaH2PO4)		MilliporeSigmaS0751
山梨醇MilliporeSigmaS6021
标准型持针钳精细科学工具11000-12
无菌手术巾SAI Infusion TechnologiesPSS5-1519
直型微血管夹精细科学工具00396-01输尿管夹
蔗糖Fisher ScientificS5
手术剪刀精细科学工具14058-09
T225 培养瓶康宁431082
Technocut 手术刀 #11Myco Medical Supplies Inc.6008T-11
组织镊罗博兹外科手术器械RS-5155

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