层蛋白病常导致核膜发生改变，进而引起核出芽和泄漏。本研究介绍了一种免疫荧光方法，用于同时可视化核纤层和双链DNA（dsDNA），从而评估哺乳动物细胞的核结构与完整性。
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本文内容
摘要
摘要
核纤层是位于核膜下方的纤维网络结构，由核纤层蛋白（lamins）和核纤层相关蛋白组成。它在核结构维持、核孔定位、基因表达调控、染色质组织、DNA复制以及DNA修复等过程中发挥关键作用。参与核纤层蛋白表达或翻译后加工的基因发生突变，会导致一类称为核纤层蛋白病（laminopathies）的遗传性疾病。具体而言，LMNA 或 ZMPSTE24 基因的突变可导致前体核纤层蛋白A（lamin A）未能完全加工，从而保留了法尼基（farnesyl）和甲基（methyl）基团，而这些基团在完全加工成熟的核纤层蛋白A中是不存在的。这些未完全加工的核纤层蛋白A会定位于内层核膜，而非成熟核纤层蛋白A所在的核纤层区域。错位定位的核纤层蛋白会严重破坏细胞核的功能与结构，常导致核出芽（nuclear blebbing）。在严重情况下，可能发生核破裂，造成核内外区室化丧失，基因组DNA泄漏至细胞质中。异常的核结构及区室化丧失可通过固定细胞的间接免疫荧光（IF）技术进行识别。本研究概述了该方法，采用特异性针对核纤层蛋白和双链DNA（dsDNA）的抗体，同时可视化核膜和DNA，从而实现对核结构完整性的快速评估，并检测核DNA是否可能泄漏至细胞质中。
引言
核纤层是一种位于核膜下方的纤维网络，由称为核纤层蛋白（lamins）的蛋白质组成。核纤层在细胞核结构、核孔定位、基因表达调控、染色质组织、DNA复制以及DNA修复中发挥着重要作用1,2,3。参与核纤层蛋白表达的基因发生突变会导致一类称为核纤层蛋白病（laminopathies）的遗传性疾病3。
限制性皮肤症（RD）是一种严重的核纤层蛋白病，主要由ZMPSTE24基因中的复合杂合突变引起，这些突变在基因中产生提前终止密码子4，导致金属蛋白酶ZMPSTE24缺失。该核纤层蛋白病的特征包括宫内生长迟缓、皮肤紧绷僵硬、小口、毛发稀疏以及骨矿化缺陷1。由于肺功能不全，RD患者通常无法存活超过出生后第一周1。另外两种核纤层蛋白病——非典型Hutchinson-Gilford早衰综合征（AT-HGPS）和B型下颌骨发育不良（MAD-B）——与ZMPSTE24表达降低有关，表现为寿命缩短，并具有早衰样表型特征5。这些核纤层蛋白病所影响的ZMPSTE24蛋白酶在核纤层蛋白A的翻译后修饰过程中起关键作用，而核纤层蛋白A是核纤层的重要组成成分。ZMPSTE24缺乏会导致一种未完全加工的法尼基化核纤层蛋白A前体（称为前体核纤层蛋白A）在细胞内积聚2。
图1正常情况下的核纤层蛋白A加工 与RD 细胞 正常细胞中的核纤层蛋白A加工通路（左）与限制性皮病（RD）或ZMPSTE24缺陷细胞中异常的核纤层蛋白A加工（右）。图中显示了法呢基（Fa）和甲基（Me）基团。 请点击此处以查看此图的放大版本。
如图1所示，在正常的核纤层蛋白A（lamin A）加工过程中，法尼基（一种脂质）基团会连接到靠近C末端的一个半胱氨酸残基上，随后通过蛋白水解作用切除C末端的三个氨基酸3,6。接着，该半胱氨酸残基被甲基化。这两个修饰使前体核纤层蛋白A（prelamin A）能够靶向定位于核内膜2。随后，ZMPSTE24酶执行一次切割反应，将最后15个C末端氨基酸以及法尼基和甲基基团一并去除，从而生成成熟的核纤层蛋白A，并将其运送至核纤层结构6,7,8。在限制性皮病（RD）、典型早老综合征（AT-HGPS）和代谢性异常早老综合征B型（MAD-B）中，由于ZMPSTE24金属蛋白酶缺失或功能不全，导致该加工过程的最后一步无法有效完成8,9。这导致前体核纤层蛋白A积累，并持续保持法尼基化和甲基化状态9。这些修饰基团使得前体核纤层蛋白A滞留在核内膜上，而非正常地定位于核纤层——即成熟核纤层蛋白A应有的归宿位置，如图1所示。因此，ZMPSTE24缺乏会对核结构及多种核功能产生深远影响10,11,12,13,14,15。这些核结构的改变可能包括核出芽（核膜凸起）甚至核破裂，进而导致DNA泄漏至胞质溶胶中，同时胞质溶胶成分也可能侵入细胞核内。异常形态的细胞核确实是核纤层蛋白病的典型特征，此外还有多种由前体核纤层蛋白A加工缺陷引起的表型变化16,17。核纤层结构的缺陷会引发一系列有害后果，包括核蛋白质量控制机制相关蛋白和DNA修复蛋白在核质中的错误定位，进而导致多种核功能障碍18。因此，建立一种简便的技术手段来识别和监测核纤层蛋白病的这些标志性特征，对于推动针对改善核纤层蛋白病表型的治疗策略研究具有重要意义。在核纤层蛋白病小鼠模型中已证实，核出芽现象的消除与整体疾病表型的广泛缓解密切相关16。若能建立一种可在人类细胞中监测核完整性的技术，将有助于深入研究潜在治疗方法，以期消除或显著改善疾病的表型表现。
间接免疫荧光（IF）是一种灵敏且广泛应用的技术，该技术使用一种未标记的一抗和一种可识别一抗的荧光素标记二抗，以检测目标分子19。IF 方法能够有效可视化特定的细胞内组分和结构。此外，多个二抗分子可能与同一一抗结合，从而实现信号放大19。间接免疫荧光是一种多功能技术，仅需少量二抗即可检测多种不同的一抗，因为二抗是针对一抗的 Fc 区域产生的，而该区域在同一种属内具有高度保守性19。
本文介绍了一种间接免疫荧光（IF）方法，用于评估ZMPSTE24缺陷细胞中的核出芽和DNA泄漏现象，该方法使用针对双链DNA（dsDNA）和lamin B1的抗体分别检测DNA和核纤层。为验证该方法的有效性，将其应用于ZMPSTE24基因敲除的HeLa细胞系以及表达ZMPSTE24的HeLa细胞系，并对两种细胞系的实验结果进行了比较。
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方案
所用试剂和设备的详细信息见材料表。
1. 材料准备
- 在将细胞接种到盖玻片上之前，预先对至少十个 22 mm × 22 mm 的方形玻璃盖玻片和镊子进行高压灭菌。
2. 溶液的配制
- 完全培养基：取500 mL杜氏改良伊格尔培养基（DMEM），添加10%胎牛血清（FBS）、100 单位/mL 青霉素和100 µg/mL 链霉素，混匀。
- 抗体稀释缓冲液（ADB）：将2 g牛血清白蛋白（BSA）和1 g鱼明胶溶于80 mL 1×磷酸盐缓冲液（PBS）中，待BSA和鱼明胶完全溶解后，用PBS定容至100 mL。
- 1×含吐温磷酸盐缓冲液（PBS-T）：取500 mL PBS和0.5 mL吐温，置于37 °C水浴中，直至吐温能充分混入溶液。
3. 培养目标细胞
注意：本方案中，HeLa 细胞在 T75 培养瓶中培养至完全汇合。
- 用70%乙醇喷洒六片盖玻片，并将其放置在无绒布上自然晾干。使用镊子将盖玻片放入无菌的6孔板中，每孔一片。
- 向6孔板的每个孔中加入2 mL含补充物的DMEM培养基。
- 吸去细胞中的培养基，向培养瓶中加入15 mL PBS，轻轻晃动以洗涤细胞。随后吸去PBS，并加入2 mL胰蛋白酶-EDTA（胰蛋白酶）。
- 使胰蛋白酶充分覆盖细胞，然后将培养瓶放回37 °C、5% CO2的湿化培养箱中孵育2分钟，以使细胞从瓶壁脱落。
- 向培养瓶中加入8 mL含补充物的DMEM以收集已消化的细胞。反复吹打数次以分散成团的细胞。将收集的细胞悬液转移至15 mL聚苯乙烯离心管中。
- 使用血细胞计数板对细胞进行计数。
- 将50万个细胞逐滴直接接种到6孔板中的每片盖玻片上。将细胞置于37 °C、5% CO2的湿化培养箱中培养过夜。
4. 细胞固定与通透化
- 使用前新鲜配制4%甲醛溶液：将2 mL 37.5%甲醛溶液加入18 mL PBS中，充分混匀。
- 使用前新鲜配制通透化溶液：将100 µL Triton-X加入20 mL PBS中，置于37 °C水浴中孵育数分钟，直至Triton-X完全溶解，充分混匀。
- 吸除培养板各孔中的培养基，每孔用2 mL PBS洗涤一次，吸净各孔中的PBS。
- 每孔加入2 mL 4%甲醛溶液，室温（RT）静置10分钟，完全吸除各孔中的4%甲醛溶液。
- 用2 mL PBS洗涤细胞3次，每次洗涤后彻底吸除孔内PBS。
- 每孔加入2 mL通透化溶液，室温（RT）静置10分钟，完全吸除通透化溶液。
- 用2 mL PBS洗涤细胞3次，前两次洗涤后完全吸除PBS，第三次洗涤后保留孔内PBS。
注意：此步骤后细胞可在含最后一次PBS洗涤液的条件下于4 °C保存数周，需用封口膜密封培养板以防止液体蒸发。若实验可继续进行，此步骤可省略。
5. 免疫荧光染色
- 从孔中移除所有 PBS。每孔加入 2 mL ADB 封闭细胞，在室温下振荡孵育 30 分钟。
- 在 30 分钟封闭即将结束时，将一抗按 1:1,000 稀释比例溶于 ADB 中（Lamin B1 和 dsDNA 抗体均为此稀释比，表 1）。每个盖玻片需要 75 µL，因此六个盖玻片应混合 600 µL ADB、0.6 µL Lamin B 一抗和 0.6 µL dsDNA 抗体。充分涡旋混匀。
- 移除孔中的 ADB。在平坦表面上，用胶带固定一张面积足够大的石蜡膜，用于放置所有待处理的盖玻片。
- 对每个盖玻片，将 75 µL 一抗稀释液滴加到石蜡膜上，确保移液时 ADB 中无气泡。然后用镊子将盖玻片细胞面朝下放置于 ADB 液滴上。
- 用培养板盖子盖住正在孵育的盖玻片，在室温下孵育 1 小时。
- 用镊子将盖玻片从石蜡膜上取下，并放回 6 孔板中，细胞面朝上。
- 用 2 mL PBS-T 洗涤盖玻片 3 次，每次振荡 3–5 分钟。每次洗涤后彻底移除孔中的 PBS-T。
- 在最后一次洗涤期间，配制二抗稀释液（两种相应的二抗均为 1:1,000 稀释，表 1）。每个盖玻片需要 75 µL，因此六个盖玻片应混合 600 µL ADB 和每种 Alexa Fluor 标记的二抗各 0.6 µL。充分涡旋混匀。尽量避免二抗稀释液暴露于光照下。
| 抗体 | 来源 | 公司 | 货号 | ||
| dsDNA 标记抗体 (HYB331-01) | 小鼠单克隆 | Santa Cruz | sc-58749 | ||
| 山羊抗小鼠 IgG (H+L) 高度交叉吸附二抗，Alexa Fluor Plus 488 | 山羊 | ThermoFisher | A32723 | ||
| 山羊抗小鼠 IgG (H+L) 高度交叉吸附二抗，Alexa Fluor Plus 405 | 山羊 | Invitrogen | A31553 | ||
| Lamin B1 多克隆抗体 | 兔 | Proteintech | 12987-1-AP | ||
| 山羊抗兔 IgG (H+L) 高度交叉吸附二抗，Alexa Fluor 594 | 山羊 | Invitrogen | A11037 | ||
表1：抗体。 本方案中使用的所有抗体列表。
- 移除最后一次洗涤中的全部 PBS-T。将盖玻片置于石蜡膜上，按步骤 5 的方法加入二抗稀释液，室温孵育 30 分钟。此步骤及后续所有步骤均需避光操作，可使用小盒子遮挡光线。在向孔中添加或移除溶液时，应迅速操作。
- 用镊子将盖玻片从石蜡膜上取下，放回 6 孔板中，细胞面朝上。
- 用 2 mL PBS-T 洗涤盖玻片 3 次，每次洗涤后彻底移除孔中的 PBS-T。
- 用梯度乙醇（70%、90%、100%）对盖玻片进行脱水处理。首先向每孔加入 2 mL 70% 乙醇，静置 1–2 分钟后吸除全部乙醇，再依次用其余浓度的乙醇重复此步骤。
- 用镊子将盖玻片从孔中取出，置于无绒擦拭纸上，避光自然晾干。
- 每张盖玻片滴加 20 µL 封片剂，细胞面朝下封固于玻璃载玻片上，避光静置过夜使其完全干燥。
6. 图像采集
- 成像前，用一层薄薄的透明指甲油（任何品牌或类型均可）涂抹盖玻片边缘。置于避光处自然晾干。
注意：使用显微镜进行成像的具体操作步骤因所用显微镜型号而异。本实验所用显微镜的相机分辨率为 1280 x 960 像素，类似或更高的分辨率均可满足要求。 - 将载玻片放置于显微镜载物台前，必须先调整文件保存设置。打开显微镜并插入 U 盘。在显微镜设置中调整保存选项，确保所有通道（GFP 和 RFP）将被分别保存，并确认图像保存至 U 盘的正确位置。
注意：建议在 U 盘中创建一个文件夹，并为每张盖玻片命名，以便后续识别。 - 成像前，将 70% 乙醇喷洒在无尘擦拭纸上，轻轻擦拭载玻片背面。随后小心清洁载玻片正面，确保施加的压力极小。
- 将洁净的载玻片放置于显微镜上，盖玻片朝下。盖上遮光盒。
- 使用 40 倍物镜，选择合适的通道（本实验中 lamin B1 抗体对应 RFP 通道），在显微镜屏幕上定位细胞核。初始光强调节至约 50%。
- 为检查是否存在过饱和区域，请选择“Color Off”（关闭颜色）选项，并确认在黑白模式下盖玻片上无任何区域出现红色信号。若存在明显红色信号，应降低光强，直至红色信号最小化。
注意：红色信号表示信号过饱和。若细胞核几乎不可见，可每次增加 10% 光强，逐步调节至合适亮度，同时避免过饱和。 - 使用相同光强检查其余所有盖玻片，确保均无过饱和现象。使用相同流程（本实验中 dsDNA 抗体对应 GFP 通道）检查另一通道下的所有盖玻片。
- 记录每个通道的光强设置。在整个成像过程中，确保各通道的光强保持恒定。
- 逐个对每张盖玻片进行成像。首先选择第一个通道，调焦至细胞核清晰，然后采集图像。
- 小心切换通道，重新对细胞进行调焦。聚焦清晰后，采集图像。
- 在所需通道（GFP 和 RFP）完成成像后，选择 Overlay（叠加）功能观察合并图像，确认成像过程中载玻片未发生移动。若通道图像未对齐，需重新采集相应通道图像，直至图像完全重合。
- 点击 flash drive（U 盘）图标保存图像。移动至盖玻片的另一区域继续成像。
注意：每次成像应选择盖玻片的不同区域，避免重复采集同一区域。建议从盖玻片的左上角开始，按 "S" 形路径移动，以确保全面覆盖且无重复。
7. 数据分析
- 通过该方法获得的数据为可视化图像。请检查图像中是否存在DNA泄漏或细胞核出泡现象。出泡和泄漏的示例如代表性结果部分所示。
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结果
本研究介绍了一种用于可视化核纤层与双链DNA（dsDNA）的免疫荧光（IF）方法。完成免疫荧光染色后，可对所获取的图像进行分析，以观察核出泡和DNA泄漏的迹象。
图2：HeLa对照（CT）和 ZMPSTE24基因敲除（KO）细胞中的核出芽现象。 用于确定核出芽数量频率的两种细胞系的代表性图像。（A）使用红色（Alexa Fluor 594标记的...
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讨论
本方案包含多个关键步骤，其中最重要的步骤是对固定后的细胞进行一抗和二抗处理。使用高质量的一抗针对目标分子，并选用与所用显微镜荧光检测范围相匹配的合适荧光标记二抗，将获得最佳结果19。抗体质量会显著影响该技术的结果，因为不合格的抗体可能与非特异性靶点结合，或无法识别目标分子19,20。此外，若信号过弱或无信号，应调整一抗和二抗的稀释比例，以确保信号强度高于背景水平，同时注意避免信号过度饱和19,20。优化封闭条件有助于减少成像伪影20。对于免疫荧光实验，抗体的最佳稀释比例通常需要根据不同实验体系进行调整，但成功的稀释比例一般位于生产商推荐的范围内。除稀释比例外，还应严格遵循实验步骤的时间安排。细胞在溶液和抗体处理过程中若时间过长或不足，均可能导致成像伪影或细胞损伤19
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究工作获得了美国国家衰老研究所资助项目R03AG064525（资助对象：ASW）的支持。我们感谢Jason A. Stewart博士在技术指导方面的帮助，以及Hui Chen实验室提供本研究所使用的显微镜。同时，我们还要感谢Fabio Martinon提供了本实验所用的HeLa细胞系。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 22 mm 方形玻璃盖玻片 | Propper Manufacturing Company | M8710 | 只要能够固定在标准显微镜载玻片上，任何尺寸或形状均可使用。 |
| 36.5% 甲醛 | Sigma Aldrich | F8775 | 固定剂 |
| 75 cm² 培养瓶 | 康宁 | 430725U | 用于细胞培养。 |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Fisher Scientific | 9048-46-8 | 抗体稀释缓冲液 |
| 含1 g/L葡萄糖和L-谷氨酰胺的DMEM培养基 && 毒性丙酮酸钠 | 康宁 | 10-014-CV | 用于细胞培养。 |
| 乙醇（200 证明） | Decon Laboratories | 2701 | 在封片前对样品进行脱水处理，并稀释以制备多种浓度。 |
| EVOS FL 数字倒置荧光显微镜 | Fisher Scientific | 12-563-460 | 成像。 |
| 鱼明胶 | Sigma Aldrich | G7041 | 抗体稀释缓冲液 |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | 防止光漂白的封片剂。 |
| Parafilm（4 英寸） | Fisher Scientific | 13-374-12 | 只要所使用的盖玻片能够容纳，任何尺寸均可替换。 |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15-140-122 | 用于细胞培养。 |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | N/A | N/A | 在实验室中制备并灭菌，用于组织培养和溶液配制。 |
| 优质胎牛血清（FBS） | Atlanta Biologicals | S11150 | 用于细胞培养。 |
| Superfrost Premium 显微镜载玻片 | Fisher Scientific | 12-544-7 | 可使用任何标准显微镜载玻片。 |
| 组织培养处理的6孔平底板 | Falcon | 353046 | 用于细胞培养。 |
| TritonX-100 | 赛默飞世尔科技 | A16046.AP | 用于洗涤。 |
| 胰蛋白酶-EDTA（0.5%） | Gibco | 15-400-054 | 用于细胞培养。 |
| Tween 20 | Fisher Scientific | 9005-64-5 | 细胞渗透试剂 |
参考文献
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