在生理管腔压力下对小肺静脉中的 Ca2+ 信号进行成像

摘要

在本实验方案中，我们介绍了一种在生理管腔压力下记录和分析肺内静脉（小肺静脉或PVs）中Ca²⁺信号的新技术。该技术包括分离小肺静脉、用Ca²⁺指示剂孵育、导管插管并加压、Ca²⁺信号的共聚焦成像以及数据分析。

摘要

肺静脉（PVs）将富含氧气的血液从肺部输送回左心，因此在向重要器官输送富氧血液方面发挥着重要作用。然而，大多数关于肺血管系统的研究都集中在正常和疾病状态下的肺动脉和毛细血管。Ca²⁺信号是血管功能的关键调节因子。尽管肺静脉具有重要的生理功能，但在生理条件下，尚无对小肺内静脉中Ca²⁺信号的记录报道。本文中，我们描述了一种技术，用于记录从小鼠分离、套管化并加压至5 mmHg的肺静脉中的Ca²⁺信号活动。通过使用Ca²⁺指示剂，我们可在生理条件下利用高速旋转盘共聚焦成像技术，研究小肺静脉肌细胞层中的Ca²⁺信号。我们的代表性数据表明，小肺静脉肌细胞中的Ca²⁺信号由兰尼碱受体离子通道的开放所介导。该方法将对肺血管生理学及肺血管疾病领域的研究人员具有重要意义。

引言

肺血管系统在气体交换、向血液中添加氧气以及清除二氧化碳方面发挥着重要作用^1,2。肺动脉（PAs）接收来自右心的低氧血液。气体交换发生在毛细血管（肺泡毛细血管）水平，富含氧气的血液则由肺静脉（PVs）输送至左心。与其他输送低氧血液的静脉不同，肺静脉具有重要的功能，即将富氧血液输送至左心，进而输送至全身的重要器官。然而，在正常和疾病状态下调控肺静脉功能的信号机制仍不清楚。

关于肺血管系统的研究主要集中在肺动脉（PAs）和肺毛细血管。近期研究表明，内皮细胞和血管平滑肌细胞层中的 Ca²⁺ 信号在调控肺动脉功能中起关键作用^3,4,5。此外，异常的 Ca²⁺ 信号传导机制可导致疾病状态下肺动脉和肺毛细血管功能受损^6,7,8,9,10。然而，关于肺内静脉（小PVs）的研究仍较为匮乏。已有研究提出，靠近左心的大肺静脉（心脏PVs）存在异位电活动，可能是人类心房颤动的来源之一^11,12，并且在大肺静脉中也观察到自发性搏动¹³以及 Ca²⁺ 信号^12,14,15。小肺静脉将富氧血液输送至大肺静脉。然而，在生理性的管腔压力条件下，小肺静脉中的 Ca²⁺ 信号传导机制尚未被研究。

在本研究中，我们介绍了一种新方法，用于分离、套管插管并加压小型肺静脉（PV），同时利用高速旋转盘共聚焦显微镜对肺静脉心肌细胞中的Ca²⁺信号进行成像。该方法的总体目标是在生理管腔压力条件下记录小型肺静脉心肌细胞中的自发性和诱导性Ca²⁺信号。管腔内压力在调控心肌细胞Ca²⁺信号中起着关键作用¹⁶。通常，肺静脉所承受的生理性管腔内压力范围为4至10 mm Hg^17,18。在整个心动周期中，管腔内压力的变化可能影响肺静脉心肌细胞的Ca²⁺信号。因此，采用一种能够在生理条件下研究这些信号，并探究不同管腔内压力如何影响它们的技术至关重要。此外，以往大多数关于肺静脉的研究集中于较大的心脏部位肺静脉，而本技术则聚焦于深藏于肺组织内的小型肺静脉，这对于理解健康与疾病状态下肺功能的调控可能更具相关性。

方案

所有动物实验方案均经弗吉尼亚大学动物护理与使用委员会批准（方案编号 4100 和 4120）。采用戊巴比妥钠（90 mg/kg，腹腔注射）处死 10–12 周龄的 C57BL6/J 小鼠，随后行颈椎脱位以获取肺组织^3,4,19,20。

1. 小型PV的分离

1. 用100%乙醇清洁解剖工具和器皿，随后用去离子水冲洗。
2. 使用剪刀打开胸腔。用镊子小心地从胸腔中取出心脏和肺，尽量减少对肺的触碰。
3. 将组织置于涂有Sylgard的培养皿中，皿内盛有冷（4–10 °C）HEPES缓冲生理盐溶液（HEPES-PSS，单位为 mM：10 HEPES，134 NaCl，6 KCl，1 MgCl₂ 六水合物，2 CaCl₂二水合物，以及7 dextrose，用1 M NaOH调节pH至7.4）^3,4,19。使用解剖针固定心脏和肺，使大肺静脉（PVs）和肺动脉（PAs）清晰可见，并轻微拉伸肺的左叶，如图1所示。
4. 以大肺静脉（PVs）为参考点，用精细剪刀小心去除小肺内静脉（小PVs，直径约50–100 μm，如图1中虚线矩形所示）周围的组织。注意避免直接接触小PVs。轻柔地将小PVs从周围组织中分离出来。
5. 分离长约1–2 mm的小PVs节段。将小PVs置于4–10 °C的HEPES-PSS中。

2. 使用 Ca²⁺ 指示剂装载小型 PVs

注意：应小心操作小静脉（PVs），确保镊子仅接触小静脉的末端。本方法是对先前所述技术的改进^3,7,20,21。

1. 使用DMSO配制2.5 mM Fluo-4 AM储备液^3,4。用上述储备液配制含10 μM Fluo-4 AM和0.04% Pluronic酸的HEPES-PSS工作液。
2. 将小型PVs放入1.5 mL离心管中，加入染色液（含10 μM Fluo-4 AM和0.04% Pluronic酸的HEPES-PSS溶液）^3,4。用铝箔纸包裹管子，置于37 °C水浴中孵育1小时。
3. 孵育结束后，小心移除染色液，替换为4–10 °C的HEPES-PSS溶液，冰上放置30分钟，以进行洗涤步骤。

3. 小静脉插管

注意：本方法是对先前所述技术的改进^3,20,21。

1. 使用两个玻璃套管（每侧一个）准备压力肌动描记室。用10 mL注射器将PSS（119 mM NaCl、4.7 mM KCl、1.2 mM KH₂PO₄、1.2 mM MgCl₂六水合物、2.5 mM CaCl₂二水合物^3,4,21,22、7 mM葡萄糖和24 mM NaHCO₃）注入套管中，并通过向溶液中通入21% O₂和5% CO₂维持pH值为7.4。
2. 从小血管清洗液中取出一段小门静脉（PV），并将其放入压力肌动描记室中。使用尖头镊子小心地将小门静脉的一端套入其中一个套管上。然后，使用尼龙丝制成的微丝，在套管化的小门静脉末端与套管尖端周围打结固定。
3. 轻轻推动套管中的PSS，以清除门静脉内部的血液。使用尼龙丝和微丝将另一端与玻璃套管结扎封闭，如图1所示。

4. 小静脉血管的加压与Ca²⁺成像

注意：本方法是对先前所述技术的改进^3,21。

1. 使用连接至含有PSS管路的伺服压力控制器，从一端以5 mm Hg的压力对小静脉（PV）加压。通过连接进液口和出液口的蠕动泵对PSS进行灌流，并将灌流液温度维持在37 °C。
2. 平衡期结束后，使用40倍水浸物镜（NA 0.8）和转盘共聚焦成像系统，以每秒30帧的速率采集1000帧Ca²⁺图像。采用488 nm固态激光激发Fluo-4，并通过525/36 nm带通滤光片收集发射荧光。
3. 向灌流液中加入兰诺定受体（RyR）拮抗剂兰诺定（5 μM）^21,23，孵育5分钟。随后按照上述方法重新采集Ca²⁺图像，以每秒30帧的速率再记录1000帧。

5. Ca²⁺成像分析

注意：本方法是对先前所述技术^21,22,24的改进。PV肌细胞中Ca²⁺信号活性的变化可为静脉瓣（PV）兴奋-收缩耦联的抑制或增强提供重要见解。

1. 使用由 Adrian Bonev 博士开发的定制软件（https://github.com/vesselman/SparkAn）分析 Ca²⁺ 图像。
2. 使用 5 × 5 箱形滤波器和 5 × 5 中值滤波器对图像进行平滑处理。选择一个围绕 PV 平坦区域且包含多个细胞的框架，用于事件自动检测。
3. 点击 View 和 Event Autodetection。设置如下参数：事件阈值为 1.3 F/F₀ 振幅， 容差为 20%，扫描框为 7 × 7 像素，运行平均为 7 幅图像。从第一幅图像开始，每 10 幅图像自动生成一次平均图像。
4. 点击 Start Search（眼睛图标）。在“文件”菜单下找到保存为 Mark File 的事件表。为计算每 µm² 的事件数，将检测到的 Ca²⁺ 信号数量除以所选框架的面积。

结果

图2A 显示在5 mm Hg管腔压力下一个小PV的视野。+符号表示自动检测到的Ca²⁺ 选定帧内的信号（视频 1），由绿色轮廓标示。每只小鼠记录一个PV视野，且每只小鼠仅使用一个PV。一个小型PV被视为n=1。Ca²⁺²⁺ 信号每 μm² 每分钟的比较在添加兰尼碱受体抑制剂ryanodine之前和之后5分钟进行5 μM)²³ 在配对实验中，采用配对t检验进行统计学比较，以检测显著性差异。自发性Ca²⁺ 信号为0.73 ± 0.2 个事件每分钟每 μm² (图2B，C) 在上述条件下。雷诺丁处理几乎完全抑制了 Ca²⁺ 小PV中的信号（图2C, 视频 2)，表现为每分钟每单位事件数急剧减少 μm²这些数据表明，Ca²⁺的自发活动²⁺ 心肌细胞层中来自加压的小静脉的信号代表了ryanodine受体（RyRs）的开放。这些结果提供了钙活动的证据²⁺ 可在生理管腔压力下对小PVs中的信号进行研究。该方法将有助于未来研究管腔内压力及神经体液介质对Ca的影响²⁺ 小PV心肌细胞中的信号传导，可能为PV功能的调控提供有价值的见解。尽管本研究目前主要关注RyR Ca的数量²⁺ 信号，还可以分析这些信号的动力学特性，包括持续时间、振幅、空间扩散范围和上升时间。理解生理和病理刺激如何影响RyR Ca²⁺信号的动力学特性²⁺ 信号可能为健康和疾病状态下PV功能的调控提供重要信息。

图 1：肺静脉的制备与 Ca²⁺ 成像。 连续图像显示小肺静脉的识别与分离、Fluo-4AM 孵育、插管与加压（5 mm Hg）、高速转盘共聚焦成像以及图像分析过程。左侧图像中的虚线矩形代表本研究所用的肺静脉。缩写：PA = 肺动脉；RA = 右心房；PV = 肺静脉；LA = 左心房。 请点击此处查看此图的放大版本。

图 2：Ca²⁺ 成像分析。（A）在加压（5 mm Hg）条件下，负载 fluo-4 的小静脉（PV）在无（左）或有雷尼丁（5 µM；RyR 抑制剂，右）存在时的视野图像。绿色矩形表示用于自动检测 Ca²⁺ 信号的选定区域。+ 号表示帧内自动检测到的事件。红色符号表示面积小于 3000 µm² 的信号，而蓝色符号表示面积大于 3000 µm² 的信号。每个 + 号代表一个 Ca²⁺ 事件或信号。（B）来自 A 图中选定区域检测到事件的 F/F0 轨迹，显示在基础条件下（左）及添加雷尼丁后（右）加压小静脉中肌细胞层 Ca²⁺ 信号的活动情况。（C）小静脉中每分钟每 µm² 的 Ca²⁺ 信号事件数量在添加雷尼丁前后的定量分析（每只小鼠 1 条静脉；n=6 只小鼠；**p < 0.01 vs 基础值；配对 t 检验）。请点击此处查看该图的放大版本。

视频 1：在给予雷尼丁处理前，以 5 mm Hg 压力灌注的小段 PV 中的 Ca²⁺ 信号。视野范围对应于 图 2 中以绿色显示的选定帧。请点击此处下载该视频。

视频 2：经雷尼丁（5 μM）处理后，在 5 mm Hg 压力下的小段 PV 中的 Ca²⁺ 信号。视野显示的是选中的帧，该帧在 图 2 中以绿色标示。请点击此处下载该视频。

讨论

平滑肌细胞中的 Ca²⁺ 信号在调控血管功能中起着关键作用²⁵。肺静脉（PVs）是重要的血管床，负责将富含氧气的血液输送至左心，但其研究相对不足²⁶。然而，小肺静脉中 Ca²⁺ 信号转导机制及其对生理功能的影响尚不清楚。本论文的目的是介绍一种新方法，用于分离、套管插管并加压小肺静脉，以记录肌细胞层中的 Ca²⁺ 信号，并对这些 Ca²⁺ 信号进行分析。能够可视化小肺静脉中的 Ca²⁺ 信号，有助于增进我们对这些信号在正常和疾病状态下作用机制的理解。尽管在完整肺组织内研究肺静脉中的 Ca²⁺ 信号可提供更具生理相关性的数据，但小肺静脉在完整肺中并不清晰可见，这可能在加载 Ca²⁺ 荧光染料和共聚焦成像时带来技术挑战。分离并加压小肺静脉提供了一种替代方法，可在生理性的管腔内压力、温度和离子溶液条件下观察 Ca²⁺ 信号。

本文所述的肺静脉（PV）Ca²⁺成像基于我们已建立完善的体动脉Ca²⁺成像实验方法^21,22,27。实验数据表明，小肺静脉肌细胞中大多数Ca²⁺信号来源于兰尼碱受体（RyR）离子通道的开放。因此，本文所描述的实验方案将有助于未来在正常条件及疾病状态下对RyR调控机制及其对肺静脉功能影响的研究。RyR2活性对心肌细胞的收缩至关重要²⁸，而在动脉平滑肌细胞中，RyR活性则与舒张过程相关²⁹。然而，RyR活性对小肺静脉收缩的确切作用仍不清楚。压力血管描记术（pressure myography）是一种常用于监测小血管收缩变化的技术，因此，加压肺静脉制备方法也可能适用于监测小肺静脉的收缩活动。

雷尼丁碱对雷尼丁受体（RyR）活性具有浓度依赖性效应，在亚微摩尔浓度下增强其活性，而在微摩尔浓度下则抑制其活性²³。雷尼丁碱还可能对小肺静脉（PVs）中其他钙离子（Ca²⁺）信号产生间接抑制作用，但这一可能性尚未得到验证。在本研究所使用的浓度下，我们未观察到肺静脉中Ca²⁺信号出现代偿性增加。离体且加压状态下的肺静脉中Ca²⁺信号的调控机制可能与完整肺组织内的肺静脉存在差异，但该可能性仍有待探索。然而，在麻醉小鼠的完整肺组织中记录小肺静脉的Ca²⁺信号面临显著技术挑战，这主要源于肺位于胸腔内的解剖位置，以及在麻醉小鼠中难以将Ca²⁺指示剂特异性地加载至肺静脉细胞中。

已知血流剪切应力会改变血管的功能。尽管现有方法能够分离管腔压力对小静脉中Ca²⁺信号的影响，但缺乏血流或剪切应力是一个潜在的局限性。然而，血流或剪切应力可轻松整合到实验中，并结合前述装置与Ca²⁺成像技术联合实施²¹。血流/剪切应力可能会影响小静脉中Ca²⁺信号的活性，这将是未来研究的一个有趣课题。

我们使用fluo-4-AM作为Ca²⁺指示剂来记录小肺静脉（PVs）中的Ca²⁺信号。根据实验需求，也可选用其他可在488 nm（如Calbryte 520 AM）⁷或560 nm（如Calbryte 590 AM）³⁰激发的Ca²⁺指示剂。采用转盘共聚焦成像系统可实现对肺静脉肌细胞中Ca²⁺信号的特异性成像。尽管本研究未涉及内皮细胞层，但未来若聚焦于该层结构，则可记录小肺静脉中的内皮细胞Ca²⁺信号。肺动脉（PAs）与肺静脉在功能上存在差异，并处于不同的微环境之中。因此，比较小肺动脉与小肺静脉中肌细胞及内皮细胞的Ca²⁺信号，可能为理解二者功能差异提供关键线索。

小静脉（PV）中的Ca²⁺信号可能调控富氧血液在静脉中的流动。在每个心动周期中，左心房内的压力从4 mmHg变化至12 mmHg^17,18。由于静脉向左心房供血，静脉内部的压力在心动周期中也可能发生变化。先前的研究表明，小动脉中的兰尼碱受体（RyRs）可被管腔内压力激活¹⁶。因此，测量管腔内压力对静脉Ca²⁺信号的影响，可能为富氧血液从静脉输送至左心提供新的见解。神经刺激和血液中的体液介质也可激活平滑肌的Ca²⁺信号。本方法将有助于未来研究神经体液介质对静脉Ca²⁺信号及静脉功能的影响。

在该实验方案中，有几个关键步骤需要特别注意。肺静脉（PVs）的精细解剖至关重要。必须避免解剖工具接触肺静脉的成像区域，因为这可能对其健康状态产生不利影响，仅可触碰肺静脉的末端。缩短解剖时间有助于提高实验成功率。染料负载不足会导致信噪比降低，并增加事件自动检测过程中出现假阳性的可能性。遵循本方案所述操作步骤，可确保肺静脉心肌细胞获得充分的染料负载。

综上所述，我们介绍了一种记录小肺静脉（PVs）中Ca²⁺信号的方法，该方法可用于研究这一重要但常被忽视的血管床中的Ca²⁺信号传导机制。尤为重要的是，在正常条件下记录小肺静脉中Ca²⁺信号的能力，有助于深入理解包括肺动脉高压、肺损伤以及心力衰竭诱发的肺水肿在内的肺部疾病的病理机制。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
定制设计的 SparkAn 软件	佛蒙特大学		https://github.com/vesselman/SparkAn
Fluo-4, AM	赛默飞世尔科技	F14201
FN1 直立显微镜	尼康
加热器/温度控制器	沃纳仪器公司
成像系统	Andor
iQ 3.x 图像采集软件	Andor
iXon EMCCD 相机	Andor
用于结扎血管的尼龙线	生命系统仪器公司	THR-G
压力肌动描记室	美国佛蒙特大学伯灵顿分校仪器与模型设施
Revolution WD（带 Borealis）高速转盘共聚焦成像系统	Andor
雷诺丁	Bio-Techne	1329
伺服压力控制器	生命系统仪器公司
SS 解剖针，直径 0.2 mm	生命系统仪器公司	PIN-0.2mm
REGLO 蠕动泵	ISMATEC	ISM4212