在小鼠骨髓损伤模型中通过膜内骨化研究产后成骨的改进方法

摘要

小鼠骨髓损伤模型是通过膜内骨化研究产后成骨的有用工具。这种简化的手术方案描述了骨髓消融手术，用于下游评估损伤后新骨形成和细胞反应。

摘要

长骨损伤通过软骨内或膜内骨形成途径愈合。与需要软骨模板的软骨内通路不同，膜内骨化过程涉及骨骼干细胞和祖细胞 （SSPC） 直接转化为成骨成骨细胞。 在实验小鼠中模拟这一过程的手术方法有限。在这里，我们改进了小鼠骨髓损伤模型，以促进通过膜内骨化进行骨修复的研究，并评估成骨的出生后调节因子。这种方法具有高度可重复性和用户友好性，它允许使用显微计算机断层扫描 （μCT） 和冰冻切片组织学在短时间内（受伤后 3-7 天）对新骨形成进行时间评估。此外，使用荧光报告小鼠和这种膜内骨髓损伤模型的组合可以很容易地评估 SSPC 和成熟成骨细胞的贡献。在临床环境中，膜内骨形成与愈合临界尺寸缺损、稳定骨折、皮质缺损、肿瘤切除创伤和关节置换有关。

引言

长骨损伤通过软骨内或膜内骨形成途径愈合。与需要软骨前体步骤的软骨内通路不同，通过膜内骨化进行的骨修复涉及骨骼干和祖细胞 （SSPCS） 直接转化为成骨成骨细胞¹。在临床上，这个过程与各种情况下的骨愈合有关，包括临界尺寸缺损、稳定骨折、皮质缺损、牵张成骨、肿瘤切除创伤和关节置换植入物的骨整合 ^2,3。有趣的是，在对长骨骨折患者的研究中，66%-82% 的患者有移位性骨折，这需要固定装置来稳定骨骼 ^4,5。这些刚性稳定的骨骼主要通过膜内骨化愈合，因为骨折的骨头末端彼此直接接触 ^6,7。然而，与通过软骨内途径形成骨相比，膜内骨再生的机制调节仍然相对研究不足。美国食品药品监督管理局 （FDA） 批准的促进骨愈合的疗法受到临床疗效有限和高成本的阻碍，并且与显着的不良反应相关⁸。

机械骨髓消融术为研究膜内骨形成提供了一个有价值的模型。这种简单的损伤模型允许在不破坏皮质骨的情况下研究骨髓中的骨再生。BM 消融术后，愈合过程涉及不同但重叠的阶段。初始阶段发生在最初的 1 到 5 天，涉及凝块形成和炎症，炎症细胞和细胞因子开始愈合。从第 3 天到第 14 天，第二阶段以再生为特征，包括新生血管形成、间充质干细胞 （MSC） 迁移和增殖、成骨细胞分化和编织骨形成。最后的重塑阶段在手术后约 10 天开始，骨组织经历成熟和重组，直到骨髓在第 56 天完全恢复⁹。这种快速愈合时间表使 BM 消融模型成为研究早期骨修复反应的理想选择，尤其是在炎症、祖细胞募集和成骨细胞分化的关键时期。使用组织学、流式细胞术和定量 μCT 分析等技术，可以评估早期修复阶段的细胞反应和骨形成。使用上述技术，BM 消融模型可以深入了解膜内骨再生的机制，并有助于确定增强骨愈合的关键治疗靶点。

方案

以下程序经康涅狄格大学健康中心机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 批准执行。所有手术均在美国国立卫生研究院 （NIH） 指南概述的无菌条件下进行。使用适当的镇痛药和防腐剂控制疼痛和感染风险，以确保成功的结果。

1. 手术区域和器械的准备

1. 使用临床级消毒清洁剂对工作表面进行消毒，为手术室做好准备。
   注意:外科医生应穿戴适当的个人防护装备 （PPE），包括无菌一次性手套、发帽、长袍和口罩。
2. 准备一个覆盖有无菌手术垫的加热垫。收集和整理所有无菌器械和试剂（材料表），方便取用。

2. 术前麻醉

1. 手术前称量所有小鼠。根据丁丙诺啡的可用配方计算要使用的镇痛药的体积。
2. 在无菌工作空间内组装动物麻醉装置，其中包括感应室和鼻锥组件。根据小鼠年龄和体重，将氧气输出量设置为 2 L ^min-1 ，将异氟醚设置为 1.5-3% （v/v）。
3. 小鼠镇静后，将动物从诱导室中取出，并将其仰卧放在无菌手术垫上。在双眼涂抹眼用润滑剂。将鼻锥放在头上。轻轻捏住脚趾，检查鼠标是否被充分麻醉。在继续之前，确保没有后肢反射反应。
4. 手术前，将小鼠从鼻锥中短暂取出，通过皮下途径注射全剂量的缓释丁丙诺啡;总剂量为 3.25 mg/kg。

3. 手术程序描述

注意:该外科手术使用 10 周至 24 周龄的 C57BL/6 雄性和雌性小鼠。该程序可以在年仅 6 周至 33 周龄的小鼠和各种近交系上进行，如其他人所示^10,11。年轻的小鼠可能需要较短的针头长度，而年长或较大的小鼠可能需要更长的针头。

1. 在装有 26 G 针头的 3 mL 注射器中加入无菌生理盐水。将此 Piece 放在一边。
2. 去除后肢的毛皮，将使用电动或电池供电的剪刀（#40 刀片）进行手术，并从手术区域去除任何松散的毛皮。使用无菌棉签涂抹器，用碘基磨砂膏（10% 聚维酮碘）处理手术部位，然后用 70% 异丙醇处理。从膝盖中心开始擦洗手术部位，然后向外打圈。让该部位干燥。重复划动步骤 3 次。
3. 将鼠标放在其背上并弯曲手术腿的膝盖。用非惯用手握住鼠标的腿，使膝盖弯曲在中指上，第二根手指放在股骨上，拇指放在胫骨上。
4. 使用手术刀在髌骨正下方做一个小而浅的水平切口。
   注意:此步骤改进了插入部位的可视化。根据经验，可以跳过此步骤。
5. 通过将针头水平穿过弯曲的膝盖并感觉股骨和胫骨之间的空间来定位关节空间。使用这个解剖部位进行引导，取一根 25 G 的针头，从膝盖向近端手动钻孔（通过扭转针头并同时对针头施加适度的压力）到股骨远端。将针头穿过髌骨或围绕髌骨插入。
6. 对鼠标进行 X 光检查，以确保针头已适当放置在髓腔中，尽可能靠近中心（图 1）。
7. 取出 25 G 针头，并立即将 26 G 针头插入骨髓腔内的同一孔中。以圆周运动铰孔髓腔的侧面至少 5 次，直到感觉光滑。保持每个鼠标之间的铰孔动作数一致。
   注意: 如果处理不当，步骤 3.5 和 3.7 可能会对外科医生造成针刺伤。
8. 取下 26 G 针头，然后更换连接到生理盐水注射器的 26 G 针头。冲洗型腔，直到回流畅通。这通常需要 1.5-2 mL 生理盐水。取出注射器和针头，并将其安全地丢弃在锋利的容器中。
   注意: 推动流体时不应有阻力。如果是这样，请重新插入针头以确保它在腔内。可能需要将针头拉出一半。
9. 使用局部粘合缝合线闭合皮肤伤口。

4. 术后护理

1. 手术后，立即使用步骤 2.4 中的剂量施用剩余的半剂量缓释丁丙诺啡。
   注意:缓释丁丙诺啡可缓解疼痛长达 72 小时。
2. 监测加热垫上的动物是否有正常、畅通的呼吸迹象，直到它们从手术中醒来。一旦可以走动，将小鼠放回笼子里。
3. 手术后 3 天继续每天监测小鼠一次，以确保它们正常愈合并具有完全活动能力，观察疼痛迹象。

5. 处理用于 μCT 扫描和分析的骨骼

1. 根据 IACUC 或其他适用机构政策规定和批准的人道安乐死方法对小鼠实施安乐死。在这里，使用了吸入 CO₂ 的主要安乐死方法，然后是宫颈脱位的次要方法。
2. 通过剥去后肢周围的皮肤并去除髋关节处的整个肢体来收获股骨。
3. 将每个肢体夹在包埋盒中的两个海绵之间。考虑到小鼠的年龄和大小，将其盒中的骨头转移到 10% 福尔马林溶液中，并在 4 °C 下固定 5-7 天。
   注意:过度固定和固定不足都会导致骨髓分辨率差。
4. 固定后，用磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 洗涤盒 5 分钟 3 次。
5. 从盒中取出四肢，并根据需要使用手术刀修剪肌肉。
   注意:根据下游应用，粗暴处理可能会破坏骨膜层。
6. 使用小手术剪刀或手术刀小心地切开韧带，将膝盖处的股骨分开。
   注意:胫骨可用于其他应用或丢弃。
7. 将股骨转移到 1.7 mL 或 15 mL 锥形管中，加入 70% 乙醇溶液中。骨骼可以在 4 °C 下保留在 70% 乙醇中，直到准备好进行 μCT 扫描。
8. 扫描和评估股骨的小梁参数，产生定性和定量数据。

6. 处理用于冰冻切片和组织学的骨骼

注意:在进行 μCT 扫描后，可以处理骨骼以进行冷冻切片和组织学。扫描不会影响荧光标记或后续的抗体染色。

1. 将骨头从 70% 乙醇转移到 PBS 中并洗涤 3 次，每次洗涤 5 分钟。
2. 在 4°C 的 PBS 中，在 10%、20% 至 30% 的一系列蔗糖溶液中孵育过夜。将骨骼在 30% 蔗糖中在 4 °C 下储存长达 5 天，或在 -20 °C 的此溶液中储存 6-12 个月，直到准备好包埋。
   注:使用蔗糖梯度可产生更好的组织渗透。在步骤 6.1 之后，可以将骨骼直接放入 30% 蔗糖溶液中过夜。
3. 使用冷冻包埋模具将骨骼嵌入最佳切割温度 （OCT） 化合物中。储存在 -80 °C 直至准备切片。
4. 使用冷冻膜胶带方法切片嵌入的骨骼，低温恒温器温度设置在 -24 °C 和 -26 °C 之间。
5. 使用光学胶粘剂将冷冻膜上的切片粘附到载玻片上，并使用紫外线 （UV） 交联剂将其固化直至硬化。

7. 流式细胞术的处理

注:该方案与多种抗体兼容。为了表征骨骼干细胞和祖细胞，建议将 3-4 块骨头汇集在一起，因为这些是骨髓中的稀有细胞群。

1. 准备荧光激活细胞分选 （FACS） 染色培养基 （FSM）。要制备 1000 mL FSM 溶液，请混合:100 mL 汉克斯平衡盐溶液 （HBSS）、10 mL 4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙磺酸 （HEPES）、20 mL 胎牛血清 （FBS）、870 mL dd H 2 O。将 FSM 溶液通过 0.2 μm 过滤器。
2. 在收获组织之前，用 4-5 mL 不含钙和镁的无菌 PBS 填充培养皿。
3. 准备消化培养基
   1. 对于每 4-6 个股骨，在 10 mL 含有 0.005 g 胶原酶 P 和 0.02 g 透明质酸酶的 PBS 中制备消化混合物。通过轻轻涡旋混合，并将混合物通过 0.22 μm 过滤器。
4. 如步骤 5.2 所述，在手术后第 3 天收获骨骼。用手术刀刀片去除所有肌肉和结缔组织。
5. 用 5 mL 消化培养基填充培养皿。将 4-6 块骨头放入消化培养基中。将每根骨头切碎，纵向和横向进行第一次切割。
6. 将组织转移到 14 mL 圆底管中，并用封口膜密封。用铝箔盖住管子。
7. 将试管水平放在摇床上，在 37 °C 下摇动 20 分钟。
8. 从摇床上取下试管。细胞将在底部聚集。轻轻收集消化的材料，不要干扰底部的细胞，并将消化物通过 70 μm 过滤器。将滤液收集在含有 10 mL 冷 FSM 的新 50 mL 试管中，并将其保存在冰上。
9. 向细胞中加入剩余的 5 mL 消化混合物。再次用封口膜密封并用铝箔覆盖。如上所述摇动试管。重复步骤 7.7-7.8。
10. 在 37 °C 下孵育 20 分钟后，将消化物转移到包含步骤 7.8 中消化物的同一管中，用另外 10 mL FSM 通过 70 μm 过滤器。
11. 在 4 °C 下以 274 x g 离心悬浮液。 吸出上清液并收集细胞沉淀。轻轻敲击管子，使沉淀脱落。
    注意:离心力 （g） 基于 170 mm 的转子半径。请检查转子半径并相应地调整速度。
12. 要进行红细胞裂解，请添加 1 mL 氯化铵钾 （ACK） 裂解缓冲液。将所有试剂和细胞置于冰上。
13. 在 RT 下将细胞在 ACK 中孵育约 5 分钟。不要超过 5 分钟，以避免过度裂解细胞。
14. 加入 9 mL FSM。在 4 °C 下以 274 x g 离心 5 分钟。
15. 吸出上清液。通过在试管架上轻轻耙试管来打碎细胞沉淀。
16. 加入 10 mL FSM（4 块骨头的体积，可根据组合的骨头数量进行调整）并重悬。
17. 取每个样品的等分试样，并按照制造商的说明添加碘化丙啶 （PI）。用细胞计数仪计数活细胞和总细胞。
18. 使用流式细胞术分析所需的标记物对样品进行抗体染色 12,13,14。

结果

X 射线成像验证了机械骨髓 （BM） 消融手术的成功，同时将 26G 针插入髓腔（图2A）。当 X 射线成像表明针头以不正确的角度插入或穿透骨骼时，以适当的角度重新插入针头并重新成像以确认准确放置。当无法获得成功的位置时，该动物被排除在分析之外。虽然放射学二维 （2D） 成像可以确认针头是否插入 BM 腔内，但需要三维 （3D） 成像来确认精确的针路。通过股骨的定性 μCT 分析在组织收获时进一步评估损伤程度和位置（图 2B）。受伤后 7 天，骨小梁迅速而有力地再生，骨体积分数增加 7 倍和小梁数量增加一倍（图 2C-E），以及小梁厚度增加和小梁间距减少（图 2F-G）。

生长板和骨髓腔的一般结构由完整和受损骨骼...

讨论

目标是建立一种可靠且可重复的方法来研究控制骨修复的分子和细胞过程，重点是骨骼干和祖细胞 （SSPC） 在骨髓空间/腔中直接转化为骨沉积成骨细胞。此处描述的机械骨髓消融方法是一种经过优化和验证的机械损伤骨髓消融方案，可用于研究膜内骨形成。该协议中的几个步骤对于确保受伤后健壮的骨形成和技术的可重复性至关重要。首先是将针头精确插入股骨髓腔。此步骤中的错位会导致不完全的骨髓损伤和周围组织的损伤，从而导致结果可变性。为确保针头放置正确，在扩孔骨髓腔之前，必须使用 X 射线成像来观察针头的位置。另一个关键步骤是用生理盐水冲洗骨髓腔，以去除 BM 残留物并解开骨髓，为随后的新骨形成创造空间。根据具体的研究问题、小鼠品系、基因型或小鼠年龄和体重，可能需要对该方案进行修改¹¹。 例如，为了评估骨再生潜力，可以在消融后第 7 天采集骨骼。然而，为了探索炎症反应如何促进骨形成，应在消融损伤后第 3 天左右采集股骨，此时炎症达到高峰¹⁵。针头的大小和生理盐水冲洗的量可以根据动物...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10% 福尔马林溶液	Sigma-Aldrich	HT501128
25 G 0.625 英寸 Air-tite EZ Flo 皮下注射针	Ait Tite/ Fisher Scientific	14-817-239;参考 #NEZ25058
26 G 1/2" 一次性皮下注射针	Exel International/ Fisher Scientific	14-840-83;参考 #26402	任何 26 G 针都可以替换，必须可从注射器上拆下
3 mL 无菌注射器	Fisherbrand/ Fisher Scientific	14-955-457
AB 无菌垫	McKesson/ Fisher Scientific	NC0593755	或者可以使用可高压灭菌的吸收剂垫
醋酸、冰硅		Sigma AX0073	需要稀释至 1%
氯化铵钾 （ACK） 裂解缓冲液	Gibco/ Thermo Fisher Scientific	A1049201	用于红细胞裂解，为流式细胞术做准备
麻醉诱导室 2 L	VetEquip	941444
Betadine （Providone-Iodine） 溶液	Penn Veterinary Supply Inc/ Fisher Scientific	NC0158124
盐酸丁丙诺啡注射液0.3 mg/mL	通用/ Covetrus	59122	必须获得州和联邦DEA许可证才能购买受控物质
钙黄绿素-AM	Sigma Aldrich	206700-1MG
胶原酶P	罗氏	11249002001	用于消化骨
头棉签和涂抹器	Fisherbrand/ Fisher Scientific	22-363-172
II 型 C（10） 型冷冻胶片，3.5 cm	切片实验室，日本	CFS 105
DAPI 染色液	Abcam	ab228549
克秤	Toprime/ 亚马逊	B06X6LW4V9	可以使用任何品牌的秤来称量小鼠
解剖钳	Fisherbrand/ Fisher Scientific	08-953E; 08-953F
解剖剪刀	Fisherbrand/ Fisher Scientific	08-940
Endure 低矮型低温恒温器/切片机刀片	Tanner Scientific	TNR315LP
Ethiqa XR 丁丙诺啡缓释 1.3 mg/mL	Ethiqa XR/ Cevetrus	72117	必须获得州和联邦 DEA 许可证才能购买受控物质
Fast Green， 0.2%	Electron Miscroscopy Sciences EMS	50-319-57
胎牛血清热灭活	Gibco/ Thermo Fisher Scientific	A5256801	用于制作 FACS 染色介质 （FSM）
Fluoromount-G 封片剂	南方生物科技	0100-01
GLUSEAL 外用皮肤胶粘剂	AD 外科	GLU-550
山羊抗兔 Alexa 647	Thermo Fisher	A21244	1：300 稀释
Hanks' 平衡盐溶液 （HBSS）	Gibco/ Thermo Fisher Scientific	14065056	用于制作 FACS 染色介质 （FSM）
加热垫（大）	Boncare/ Amazon	B0CLHSWXSX	可以使用任何品牌的加热垫，取下布套
苏木精	MilliporeSigma/ Fisher Scientific	M1051740500
透明质酸酶	MilliporeSigma	HX0514	用于消化骨
异氟烷动物麻醉系统	VetEquip	901810
KUBTEC 参数 2D 柜 X 射线系统	OncoMed 解决方案	N/A	任何 X 射线柜成像系统都可以使用
微量离心机管	Corning/ Thomas Scientific	8600A52
显微镜盖玻片，18 mm x 18 mm，# 1 厚度	Globe Scientific	1414-10
N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸 HEPES （1M）	Gibco/ Thermo Fisher Scientific	156300-80	用于制作 FACS 染色介质 （FSM）
Norland 光学胶粘剂 NO61	Edmund Optical	37-322	用于将冷冻胶片切片粘附到载玻片上
Osterix 兔单克隆抗体	Abcam	ab209484	1：500 稀释
Peroxigard 即用一步消毒剂	Virox Technologies	29101	可以用任何其他临床/实验室级消毒剂碘
化丙啶 （PI） 替代	Invitrogen/ Thermo Fisher Scientific	P1304MP	用于检测死细胞的活性计数的核荧光染色
充电式电动修剪器	Wahl/ Amazon	B001FWXKUE	任何剪刀都可以使用，较小尺寸的修剪器将更容易剃须较小的动物
啮齿动物鼻锥	VetEquip	921609
Safranin O，纯度为 85%，经认证的	Fisher Scientific	AC419211000
Seal'N Freeze Cryotray Square Molds	电子显微镜科学 EMS	62642-01	用于嵌入，其他嵌入模具也可使用。这个特定的模型有一个更深的模具，以及一个盖子来密封块
硝酸银	Sigma Aldrich	S6506	用于 von Kossa 染色的硝酸银
无菌磷酸盐缓冲盐水 （PBS）	Gibco/ Thermo Fisher Scientific	10010023	或者，可以使用新鲜制备的经过过滤和高压灭菌的 PBS
无菌标准手术刀	Integra Miltex/ Fisher Scientific	12-460-455
无菌标准手术刀	Integra Miltex/ Fisher Scientific	12-460-455
糖粉1公斤	Thermo Fisher Scientific	036508-A1
Superfrost Plus美窥镜载玻片	Fisherbrand/ Fisher Scientific	1255015	粘性载玻片
Sure-Tek 组织处理/包埋盒	Fisherbrand Histosette/ Fisher Scientific	22-048-141
组织加最佳切割温度 O.C.T 化合物	Fisher Scientific	23-730-571
组织海绵	Epredia/ Fisher Scientific	84-53	组织海绵保护组织免于过度加工
甲苯胺蓝	费舍尔科学	AC348600050