小鼠骨髓损伤模型是研究出生后通过膜内成骨进行骨形成的有效工具。该简化的手术方案描述了骨髓消融操作，可用于后续评估损伤后新骨形成及细胞反应。
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摘要
摘要
长骨损伤通过软骨内成骨或膜内成骨两种途径愈合。与需要软骨模板的软骨内成骨途径不同，膜内成骨过程涉及骨骼干细胞和祖细胞（SSPCs）直接转化为成骨细胞。目前可用于在实验小鼠中模拟该过程的外科方法十分有限。本文中，我们改进了一种小鼠骨髓损伤模型，以促进通过膜内成骨研究骨修复过程，并评估成骨的出生后调控因子。该方法具有高度可重复性和良好的操作性，可在短时间内（损伤后3-7天）利用微型计算机断层扫描（µCT）和冷冻切片组织学对新骨形成进行时间动态评估。此外，结合荧光报告小鼠与该膜内成骨骨髓损伤模型，可方便地评估SSPCs和成熟成骨细胞的贡献。在临床背景下，膜内成骨与大段骨缺损修复、稳定骨折愈合、皮质骨缺损、肿瘤切除后的创伤修复以及关节置换密切相关。
引言
长 骨损伤通过软骨内成骨或膜内成骨途径愈合。与需要软骨前体阶段的软骨内成骨途径不同，膜内骨化介导的骨修复涉及骨骼干细胞和祖细胞（SSPCs）直接转化为成骨细胞1。 在临床上，该过程与多种情况下的骨愈合相关，包括临界尺寸缺损、稳定骨折、皮质骨缺损、牵张成骨、肿瘤切除后的创伤以及关节置换假体的骨整合2,3。有趣的是，在对长骨骨折患者的研究中，66%–82%的患者存在移位性骨折，需要使用固定装置来稳定骨骼4,5。这些被刚性固定的骨骼主要通过膜内骨化实现愈合，因为骨折端直接接触彼此6,7。然而，相较于通过软骨内成骨途径的骨形成，膜内骨再生的机制调控研究仍相对不足。目前美国食品药品监督管理局（FDA）批准的促进骨愈合疗法由于临床疗效有限、成本高昂，并伴随显著的不良反应，其应用受到限制8。
机械性骨髓消融为研究膜内成骨提供了一个有价值的模型。这种简单的损伤模型可在不破坏皮质骨的情况下，用于研究骨髓内的骨再生过程。在骨髓消融后，....
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方案
以下操作均获得康涅狄格大学健康中心机构动物照护与使用委员会（IACUC）的批准。所有手术均按照美国国立卫生研究院（NIH）指南所述的无菌条件进行。通过使用适当的镇痛剂和防腐剂控制疼痛和感染风险，以确保手术成功。
1. 手术区域和器械的准备
- 使用临床级消毒清洁剂对操作台面进行消毒，准备手术操作室。
注意：手术人员应穿戴适当的个人防护装备（PPE），包括无菌一次性手套、头帽、手术衣和口罩。 - 准备覆盖有无菌手术垫的加热垫。收集并摆放所有无菌器械和试剂（材料表），确保取用方便。
2. 术前麻醉
- 手术前称量所有小鼠的体重。根据所用的丁丙诺啡镇痛剂剂型，计算所需镇痛剂的使用剂量。
- 在无菌工作区域内组装动物麻醉装置，包括诱导室和鼻罩组件。将氧气输出量设置为 2 L min-1 异氟烷浓度根据小鼠年龄和体重调整至1.5–3%（v/v）。
- 小鼠麻醉后，将其从诱导室中取出，置于无菌手术垫上，保持仰卧位。在双眼涂抹眼用润滑剂。将鼻罩罩住头部。轻轻捏压脚趾以检查小鼠是否已充分麻醉，确认无后肢反射反应后方可继续操作。
- 手术前，短暂地将小鼠从鼻罩中取出 通过皮下途....
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结果
通过X射线成像验证了机械性骨髓（BM）消融手术的成功，此时将26G针头插入髓腔（图2A）。当X射线成像显示针头插入角度不当或穿透骨组织时，需调整针头至正确角度后重新插入，并再次成像以确认其准确位置。若无法达到成功的位置，则将该实验动物排除在分析之外。尽管放射学二维（2D）成像可确认针头已插入骨髓腔内，但仍需三维（3D）成像来确认针头路径的精确轨迹。损伤的范围和位置在组织收获后通过股骨的定性µCT分析进一步评估（图2B）。损伤后7天，小梁骨出现快速而显著的再生，表现为骨体积分数增加七倍、小梁数目增加一倍（图2C-E），同时小梁厚度增加、小梁间距减小（图2F-G）。
通过甲苯胺蓝染色显示了完整和受损骨骼的生长板和骨髓.......
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讨论
本研究旨在建立一种可靠且可重复的方法，用于研究调控骨修复的分子与细胞过程，重点关注骨骼干细胞和祖细胞（SSPCs）在骨髓腔内直接转化为成骨细胞并沉积骨组织的过程。本文所述的机械性骨髓清除方法，是一种经过优化和验证的通过机械损伤实现骨髓清除的实验方案，可用于研究膜内成骨过程。该方案中的多个步骤至关重要，以确保损伤后出现显著的骨形成，并保证技术的可重复性。首先是将针头精确插入股骨髓腔。此步骤若发生错位，可能导致骨髓损伤不完全，并损害周围组织，从而引起实验结果的变异性。为确保针头位置正确，必须在扩髓前利用X射线成像观察针头位置。另一个关键步骤是用生理盐水冲洗骨髓腔，以清除骨髓残留物并松解骨髓组织，为后续新骨形成腾出空间。根据具体的研究问题、小鼠品系、基因型或小鼠年龄与体重的不同，可能需要对该方案进行相应调整11。 例如，若要评估骨再生潜力，可在清除术后第7天取材；而若要探究炎症反应如何影响骨形成，则应在术后约第3天（即炎症反应高峰期）取材股骨15。针头尺寸及生理盐水冲洗体积可根据动物体型和年龄进行调整。该手术技术常见的问题包括.......
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披露
作者无任何披露事项需要报告。
致谢
本研究由美国国立卫生研究院/国家牙科与颅面研究所（NIH/NIDCR）R01-DE030716-01 和 NIH/NIAMS R01-DE030716-01S1 项目资助，受资助人为 AS；由美国国立卫生研究院/国家关节炎与肌肉骨骼和皮肤病研究所（NIH/NIAMS）R01AR080131 项目资助，受资助人为 RG；以及由康涅狄格大学研究与教育合作（UConn REP）融合计划资助，受资助人为 RG 和 AS。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 10% 甲醛溶液 | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| 25 G 0.625 英寸 Air-tite EZ Flo 皮下注射针头 | Ait Tite/ Fisher Scientific | 14-817-239; 货号#NEZ25058 | |
| 26 G 1/2" 一次性皮下注射针头 | Exel International/ Fisher Scientific | 14-840-83; 货号#26402 | 可使用任何 26 G 针头，但必须可与注射器分离 |
| 3 mL 无菌注射器 | Fisherbrand/ Fisher Scientific | 14-955-457 | |
| AB 无菌垫 | McKesson/ Fisher Scientific | NC0593755 | 也可使用可高压灭菌的吸水垫 |
| 冰醋酸 | Millipore Sigma | AX0073 | 需稀释至 1% |
| 氯化铵-氯化钾 (ACK) 溶解缓冲液 | Gibco/ Thermo Fisher Scientific | A1049201 | 用于流式细胞术前的红细胞裂解 |
| 2 L 动物麻醉诱导室 | VetEquip | 941444 | |
| 聚维酮碘（碘伏）溶液 | Penn Veterinary Supply Inc/ Fisher Scientific | NC0158124 | |
| 盐酸丁丙诺啡注射液 0.3 mg/mL | Generic/ Covetrus | 59122 | 购买管制药品需取得州和联邦 DEA 许可证 |
| 钙黄绿素-AM | Sigma Aldrich | 206700-1MG | |
| 胶原酶 P | Roche | 11249002001 | 用于骨组织消化 |
| 棉签和涂抹棒 | Fisherbrand/ Fisher Scientific | 22-363-172 | |
| Cryofilm II 型 C(10)，3.5 cm | Section Lab, Japan | CFS 105 | |
| DAPI 染色液 | Abcam | ab228549 | |
| 数字克重天平 | Toprime/ Amazon | B06X6LW4V9 | 可使用任意品牌天平称量小鼠 |
| 解剖镊 | Fisherbrand/ Fisher Scientific | 08-953E; 08-953F | |
| 解剖剪 | Fisherbrand/ Fisher Scientific | 08-940 | |
| Endure 低剖面冷冻切片机/切片刀片 | Tanner Scientific | TNR315LP | |
| Ethiqa XR 缓释盐酸丁丙诺啡 1.3 mg/mL | Ethiqa XR/ Cevetrus | 72117 | 购买管制药品需取得州和联邦 DEA 许可证 |
| 快绿，0.2% | Electron Miscroscopy Sciences EMS | 50-319-57 | |
| 经热灭活的胎牛血清 | Gibco/ Thermo Fisher Scientific | A5256801 | 用于配制 FACS 染色介质 (FSM) |
| Fluoromount-G 封片液 | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| GLUSEAL 外用皮肤粘合剂 | AD Surgical | GLU-550 | |
| 山羊抗兔 Alexa 647 | Thermo Fisher | A21244 | 1:300 稀释 |
| Hanks' 平衡盐溶液 (HBSS) | Gibco/ Thermo Fisher Scientific | 14065056 | 用于配制 FACS 染色介质 (FSM) |
| 加热垫（大号） | Boncare/ Amazon | B0CLHSWXSX | 可使用任意品牌加热垫，需拆除布质外罩 |
| 苏木精 | MilliporeSigma/ Fisher Scientific | M1051740500 | |
| 透明质酸酶 | MilliporeSigma | HX0514 | 用于骨组织消化 |
| 异氟烷动物麻醉系统 | VetEquip | 901810 | |
| KUBTEC Parameter 2D 柜式 X 射线成像系统 | OncoMed Solutions | N/A | 可使用任意柜式 X 射线成像系统 |
| 微量离心管 | Corning/ Thomas Scientific | 8600A52 | |
| 显微镜盖玻片，18 mm × 18 mm，#1 厚度 | Globe Scientific | 1414-10 | |
| N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸 HEPES (1M) | Gibco/ Thermo Fisher Scientific | 156300-80 | 用于配制 FACS 染色介质 (FSM) |
| Norland 光学胶 NO61 | Edmund Optical | 37-322 | 用于将冷冻切片粘附于载玻片 |
| Osterix 兔单克隆抗体 | Abcam | ab209484 | 1:500 稀释 |
| Peroxigard 即用型一步消毒剂 | Virox Technologies | 29101 | 可替换为其他临床/实验室级消毒剂 |
| 碘化丙啶 (PI) | Invitrogen/ Thermo Fisher Scientific | P1304MP | 核荧光染料，用于活率检测中识别死细胞 |
| 可充电电动剃毛器 | Wahl/ Amazon | B001FWXKUE | 可使用任意剃毛器，较小尺寸更便于为小型动物剃毛 |
| 啮齿类动物鼻罩 | VetEquip | 921609 | |
| 固绿 SF，85% 纯度，经认证 | Fisher Scientific | AC419211000 | |
| Seal'N Freeze 冷冻托盘方形模具 | Electron Miscroscopy Sciences EMS | 62642-01 | 用于包埋，也可使用其他包埋模具。此型号模具较深，并配有密封盖 |
| 硝酸银 | Sigma Aldrich | S6506 | 用于 von Kossa 染色 |
| 无菌磷酸盐缓冲液 (PBS) | Gibco/ Thermo Fisher Scientific | 10010023 | 也可使用过滤并高压灭菌的新鲜配制 PBS |
| 无菌标准手术刀 | Integra Miltex/ Fisher Scientific | 12-460-455 | |
| 无菌标准手术刀 | Integra Miltex/ Fisher Scientific | 12-460-455 | |
| 蔗糖粉末 1 kg | Thermo Fisher Scientific | 036508-A1 | |
| Superfrost Plus 显微镜载玻片 | Fisherbrand/ Fisher Scientific | 1255015 | 带粘附性的载玻片 |
| Sure-Tek 组织处理/包埋盒 | Fisherbrand Histosette/ Fisher Scientific | 22-048-141 | |
| 组织冷冻包埋剂（O.C.T. Compound） | Fisher Scientific | 23-730-571 | |
| 组织海绵 | Epredia/ Fisher Scientific | 84-53 | 组织海绵可防止组织过度处理 |
| 甲苯胺蓝 | Fisher Scientific | AC348600050 |
参考文献
- Bahney, C. S., et al. Cellular biology of fracture healing. J Orthop Res. 37 (1), 35-50 (2019).
- Ko, F. C., Sumner, D. R. How faithfully does intramembranous bone regeneration recapitulate embryonic skeletal development. Dev Dyn. 250 (3), 377-392 (202....
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