方法文章

利用网络药理学和实验性大鼠模型评估红景天苷作为血管钙化治疗剂的潜力

DOI：

10.3791/67728

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2025年1月31日

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1Department of Encephalopathy, The Affiliated Hospital of Changchun University of Chinese Medicine, 2Research Center of Traditional Chinese Medicine, The Affiliated Hospital to Changchun University of Chinese Medicine, 3Department of Nephrology, The Affiliated Hospital to Changchun University of Chinese Medicine, 4Scientific Research Office, The Affiliated Hospital to Changchun University of Chinese Medicine, 5Rehabilitation Department, The Affiliated hospital to Changchun University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究建立了一种由高脂饮食（HFD）联合维生素D3（VD3）诱导的大鼠血管钙化模型。该模型用于评估红景天苷在预防和治疗血管钙化方面的治疗效果，并通过网络药理学和体内实验探讨其潜在的作用机制。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

血管钙化（VC）是一种与高发病率和高死亡率密切相关的重要病理状态。本研究采用网络药理学与分子生物学相结合的方法，阐明红景天苷（SAL）——一种源自植物的活性化合物——的治疗机制 红景天，与VC对比。通过数据库挖掘和网络分析，鉴定出388个SAL靶点与2871个VC相关靶点的交集，得到208个共同靶点。构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络 通过 String数据库结合Cytoscape 3.9.1的拓扑学分析确定了10个关键靶点，包括IL6、TNF、TP53、IL1B、HIF1A、CASP3和STAT3等。这些鉴定出的基因主要集中于脂质与动脉粥样硬化通路，提示SAL对VC的改善作用可能通过调控脂质及炎症因子的异常表达实现。研究还发现，SAL可抑制炎症因子的异常表达，从而激活JAK2/STAT3通路，干预VC的进展。JAK2/STAT3通路是SAL防止VC进一步恶化的关键分子机制。功能富集分析显示，这些靶点参与了炎症反应和脂质代谢过程，而这两者正是VC中的核心通路。 在体 在大鼠中的研究表明，红景天苷（SAL）可有效缓解血脂异常和血管炎症，改善血清脂质谱，并减少血管钙沉积。基于Western blot分析的机制探索表明，红景天苷能够调控JAK2/STAT3信号通路，凸显其在此关键分子机制中的调节潜力，为血管钙化（VC）提供了潜在的治疗靶点。本研究的优势在于方法学的严谨性，将计算预测与实验验证相结合 体内 验证。这种综合方法为探索天然化合物在对抗血管钙化（VC）中的治疗机制建立了坚实的框架。

引言

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血管钙化（VC）是指钙盐在血管壁内的异常沉积，可导致动脉僵硬度增加和弹性降低，最终损害血管功能。传统上，血管钙化分为两种类型：与脂质积聚相关的内膜钙化和中膜钙化。前者与炎症细胞浸润密切相关，可触发血管壁的成骨样转化，其特征是血管平滑肌细胞（VSMCs）迁移、增殖并分化为成骨细胞样细胞1。

血管平滑肌细胞（VSMCs）发生成骨分化的潜能受衰老、遗传以及糖尿病和慢性肾病等环境因素的影响，是年龄相关性血管钙化（VC）的主要促成因素。这种成骨细胞样转化会加剧动脉钙化和退变1。

血管钙化（VC）是一种多因素疾病，由退行性改变、代谢失衡以及多种全身性疾病共同驱动。约80%的血管损伤和90%的冠状动脉疾病病例中均出现VC，显著增加了严重心血管事件的风险1,2。因此，迫切需要发现能够有效减轻或逆转该病症的药理学治疗方法。

目前，血管钙化（VC）的治疗策略涉及多种药理学干预措施，但尚无专门为此设计的药物。对于轻度钙化的患者，通常会处方他汀类药物以稳定斑块。然而，尽管他汀类药物可能通过降低脂质水平来减轻冠状动脉狭窄，但其对钙化的影响有限2。

鉴于动脉粥样硬化的复杂性，许多患者表现出血小板活化增强，因此需要使用阿司匹林或氯吡格雷等抗血小板药物来抑制血小板聚集，降低血栓形成风险。然而，阿司匹林治疗仅对冠状动脉钙化评分较高且出血风险较低的个体有益3。

此外，针对维生素K等补充剂的研究表明，其在预防血管钙化（VC）进展方面具有潜在作用4。在严重情况下，可考虑采取侵入性干预措施，但这些方法通常不适用于广泛存在的血管钙化5。对于尚未发生血管钙化的个体，控制血压、血脂水平及生活方式等危险因素仍然至关重要6。

Rhodiola crenulata 是景天科的一种多年生草本植物，传统上被用于中医药。其主要生物活性成分红景天苷因其显著的生物学活性而受到广泛关注。红景天苷以其抑制细胞凋亡、具有强效抗氧化作用以及抗炎特性而著称7,8。这些特性有助于改善血管功能、延缓血管老化，并保护血管内皮。作为一种治疗血管钙化（VC）的潜在治疗剂，红景天苷具有重要的研究价值。然而，红景天苷改善VC的具体机制尚未完全阐明，仍需进一步研究以充分挖掘其在VC治疗中的治疗潜力。

为了探究这些机制，本研究采用了网络药理学这一创新性方法。网络药理学结合药理学、生物信息学和计算机科学，用于分析生物系统并阐明药物作用机制。与传统的单靶点药物研究相比，网络药理学通过分析药物对多个生物靶点和信号通路的影响，提供了更为全面的研究视角。作为现代药物研发的关键工具，它构建药物、靶点和通路之间的网络关系，以揭示药物作用的内在机制9,10。尽管网络药理学已广泛应用于治疗机制的探索，但从生物信息学和网络药理学角度研究红景天苷与维生素C之间相互作用机制的研究仍较为有限。

本研究通过广泛挖掘数据库，鉴定并分析关键靶点，构建红景天苷对血管钙化（VC）潜在作用的分子网络图谱。生成蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，并通过拓扑学分析揭示钙化过程中的关键节点。

为验证计算预测结果，通过给予大鼠高脂饮食联合维生素D3（VD3）建立血管钙化（VC）动物模型。该模型可复制人类血管钙化的病理特征。通过组织学技术评估血管损伤，检测血清脂质谱和炎症标志物以探讨红景天苷的全身作用，并采用蛋白质印迹法测定红景天苷抗血管钙化相关蛋白的表达水平，从而研究红景天苷对实验性诱导血管钙化的影响。本研究旨在为该化合物作为对抗血管钙化治疗策略的潜力提供有价值的科学依据。

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方案

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该方案已获长春中医药大学实验动物伦理委员会批准（批准号：2023091）。本研究遵循国际指南，包括欧洲共同体指南和1986年欧洲经济共同体指令，确保实验过程中对动物的伦理对待。实验选用雄性Wistar大鼠（8–10周龄，体重200–220 g）。所用试剂与设备的详细信息列于下文 材料表.

1. 基于网络药理学预测潜在 红景天苷-VC 靶点

注意：网络药理学利用计算方法和大规模数据分析，研究药物分子与生物靶点（如生物通路、基因和蛋白质）在生物体内复杂的相互作用11,12。该方法有助于解析所研究实体的生物学功能及其相互关系。该方法包括数据库的使用、化学信息的处理、生物活性数据的获取、蛋白质数据的检索、基因表达谱的分析、相互作用网络的构建以及通路富集分析11。图1展示了红景天苷与血管钙化核心靶点之间的相互作用网络。

  1. 构建 "成分" 目标数据库
    1. 使用 "红景天苷" 作为搜索数据库的成分关键词13 （参见 补充表1），例如 HERB、TCMSP、PubChem、SwissTargetPrediction、CTD、PharmMapper、SEA 和 STITCH。
    2. 查阅相关文献，确定与红景天苷相关的靶点，物种设定为 智人去除重复项后，使用 UniProt 对目标蛋白进行标准化（参见 补充表1并建立全面的红景天苷靶点数据库14.
  2. 构建 "疾病" 目标数据库
    1. 使用 "血管钙化" 作为关键词搜索数据库15 （参见 补充表1），包括 GeneCards、OMIM、PharmGkb 和 DrugBank，物种设定为 Homo sapiens去重后，建立血管钙化靶标数据库。
  3. 潜在治疗靶点的预测
    1. 输入红景天苷和血管钙化的靶点（参见 补充表1) 以确定共同靶点。绘制韦恩图以可视化红景天苷治疗血管钙化的潜在治疗靶点。
  4. 构建 "红景天苷-血管钙化" 蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络
    1. 将潜在靶点汇编为多蛋白列表，并使用 STRING 进行分析（参见 补充表1），将生物体设定为 Homo sapiens 且相互作用评分设为中等置信度（>0.4)16以 TSV 格式提取蛋白质相互作用（PPI）数据，用于进一步分析。
      注意：由于大鼠有85%的基因与人类基因同源并执行相似的生物学功能，因此选择大鼠作为实验对象，以验证红景天苷对血管钙化的影响。17.
  5. 关键靶点的筛选与网络构建
    1. 将PPI网络数据导入Cytoscape 3.9.1（参见 补充表1) 使用 CytoNCA 插件进行分析，以评估介数中心性（BC）、接近中心性（CC）、度中心性（DC）、特征向量中心性（EC）、局部平均连接性（LAC）和网络中心性（NC）等参数。筛选具有关键作用的靶点 CC=1 构建“SAL-VC”的核心靶点作用谱图。
    2. 使用 CytoHubba 插件基于最大团中心性（Maximal Clique Centrality, MCC）、最大邻域组分（Maximum Neighborhood Component, MNC）和度值（Degree）计算，鉴定出前 10 个枢纽基因，并生成枢纽基因谱图。
  6. GO与KEGG通路富集分析
    1. 使用 DAVID 进行基因 ID 转换（参见 补充表1），选择 ENSEMBL 基因 ID 使用基因类型-9606获取物种信息。利用Omicshare分析转换后的基因列表（参见 补充表1GO功能和KEGG通路富集分析的显著性水平设定为 P 值 < 0.0518.
      注：GO功能分析包括分子功能（MF）、生物过程（BP）和细胞组分（CC）；KEGG通路分析包括通路富集分析和通路分类富集分析19富集分析结果如图所示 图2.

2. 动物实验

  1. 适应性驯化
    1. 在中国台湾，将Wistar大鼠置于特定无病原体（SPF）环境中进行适应性饲养，保持12小时光照/12小时黑暗循环。确保其自由获取 随意摄取 实验开始前，应保证动物自由获取食物和水以维持其健康状态。进行为期1周的适应性喂养。
  2. 模型建立
    1. 将大鼠适应环境条件后，随机分为五组：对照组（Ctrl，ND + 车辆剂）、模型组（Model，HFD + 车辆剂）、SAL低剂量组（SAL-L，HFD + SAL 5mg/kg）、SAL高剂量组（SAL-H，HFD + SAL 10mg/kg）和辛伐他汀组（SIM，HFD + SIM 5mg/kg）。
    2. 对照组（Ctrl组）在整个实验期间给予正常饮食（ND），其余组给予高脂饮食（HFD）。在开始给予HFD的第一天，除Ctrl组外，其余各组均皮下注射一次维生素D3（VD3），剂量为600,000 IU/kg。20,21随后每周皮下注射 100,000 IU/kg VD3，持续 8 周（图3).
    3. 每天监测动物的健康状况和存活情况。在第九周开始实验干预。
    4. 在研究结束时，按照机构批准的方案对动物实施安乐死。采集血清样本，静置30分钟，离心分离血清（参照先前已发表的文献报道）。20,21)。解剖血管组织（腹主动脉），并用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗以去除血液。
    5. 将一部分组织置于4%多聚甲醛中固定，用于组织学检查，另一部分组织储存于液氮中，用于分子分析。
      注意：使用前用温水稀释红景天苷。

3. 使用HE、VK、EVG染色评估血管组织损伤

注意：将血管组织（腹主动脉）在4%多聚甲醛中固定，在48小时后经乙醇脱水，并包埋于石蜡中。将包埋的石蜡块切成5 µm切片，用于苏木精-伊红（HE）、弹力纤维-范吉森（EVG）和冯科萨（VK）染色，并在光学显微镜下观察组织学形态。HE染色用于评估组织形态学变化。在血管组织中，该染色可突出显示血管壁的结构改变，包括平滑肌细胞增殖、细胞排列紊乱以及炎症反应。EVG染色用于显示弹力纤维和胶原纤维，对于评估血管组织中弹力纤维的损伤或重塑至关重要，有助于理解钙化对血管弹性的影​​响。VK染色可检测钙盐沉积，这是血管钙化（VC）的关键特征，因此在评估血管组织中钙化的程度与分布方面具有重要意义22,23。

  1. HE染色法检测血管组织损伤
    1. 脱蜡与复水
      1. 将切片置于两缸二甲苯中脱蜡，每缸8分钟；然后通过梯度乙醇（100%、95%、85%、75%）逐级复水，每步3分钟，最后用流动自来水冲洗2分钟。
    2. 苏木精染色
      1. 用苏木精染色5–10分钟，洗去多余染液，再用流动自来水冲洗。
        ​注意：建议轻染5分钟，以避免染色过深影响胞质着色。
    3. 分化
      1. 将切片置于分化液中分化30秒，随后用自来水冲洗两次，每次3分钟。
    4. 伊红复染
      1. 将切片置于伊红染液中染色1分钟。去除多余染液后，立即进行快速脱水。
    5. 脱水、透明与封片
      1. 快速脱水：将切片依次浸入75%、85%、95%和100%乙醇中，每级3秒，最后在100%乙醇 中浸泡1分钟。
        注意：建议采用快速脱水，以防止伊红在水和乙醇梯度中褪色。
  2. VK染色法检测钙沉积
    1. 脱蜡与复水
      1. 此步骤参照第3.1.1步操作。
    2. 硝酸银反应
      1. 将切片吸干，用细毛笔勾画轮廓，然后用Von Kossa染液（见材料表）染色。将切片置于紫外光下照射4小时，随后用流动自来水充分冲洗。
    3. 苏木精复染
      1. 用苏木精染色5分钟，流动自来水冲洗，分化，再次冲洗，最后再用流动自来水冲洗一次。
    4. 伊红复染
      1. 将切片通过梯度乙醇（85%和95%）脱水，每级5分钟，然后用伊红染色5分钟。
    5. 脱水与封片
      1. 将切片依次浸入三缸100%乙醇（乙醇I、II、III）中脱水，每缸5分钟；再置于两缸二甲苯（二甲苯I、II）中透明，每缸5分钟。最后用中性树胶封片。
    6. 显微镜观察与图像采集
      1. 在光学显微镜下观察染色切片，并采集图像用于分析。
        注意：钙沉积应呈棕黑色至深黑色，细胞核呈蓝色，背景呈红色。硝酸银溶液需在VK染色前新鲜配制并立即使用。
  3. EVG染色法检测弹力纤维与胶原纤维
    1. 脱蜡与复水
      1. 将石蜡切片加热50分钟，然后浸入二甲苯中20分钟以去除石蜡。接着将切片依次通过梯度乙醇（100%、95%、85%、75%）复水，每级5分钟，最后用流动自来水冲洗5分钟。
    2. EVG染色
      1. 加入EVG染色液（见材料表）染色10分钟，随后用流动自来水短暂冲洗5秒以去除多余染液。
      2. 接着加入Verhoeff工作液（见材料表）染色5分钟，再用流动自来水短暂冲洗5秒。加入Verhoeff分化液5秒，直至弹力纤维清晰可见，然后再次用流动自来水冲洗5秒。
        注意：使用前将商品化试剂盒中的A、B、C组分按5:2:2比例混合配制Verhoeff工作液。该溶液需在2小时内使用完毕，并在染色过程中根据需要及时补充，防止切片干燥。
    3. 脱水与封片
      1. 将切片通过梯度乙醇（75%、85%、95%、100%）脱水，每级5秒，随后在两缸二甲苯中各透明1分钟。短暂晾干后，用中性树胶封片。
    4. 显微镜观察与图像分析
      1. 在光学显微镜下观察染色切片，观察弹力纤维与胶原纤维，并采集图像用于后续分析。

4. 碱性磷酸酶（ALP）检测

注意：使用碱性磷酸酶（ALP）作为关键指标来评估抗钙化治疗的效果。

  1. 试剂准备
    1. 将显色底物溶解于冰浴预冷的 0.05 M、pH 9.6 碳酸盐缓冲液中，定容至 2.5 mL。
      注意：通过将 1.59 g 碳酸钠和 2.93 g 碳酸氢钠溶解于 1,000 mL 双蒸水中配制该缓冲液。
  2. 底物稀释
    1. 取 10 µL 对硝基苯酚溶液（10 mM），用 0.05 M、pH 9.6 碳酸盐缓冲液稀释至终体积 0.2 mL，得到终浓度为 0.5 mM 的溶液。
  3. 样品准备
    1. 在裂解缓冲液中匀浆腹主动脉组织。将匀浆液在 4 °C 条件下以约 12,000 × g 离心 10 分钟，收集上清液用于碱性磷酸酶（ALP）活性检测。
      注意：确保裂解缓冲液不含磷酸酶抑制剂。待测样品应储存于 -80 °C，避免反复冻融。
  4. 检测用微孔板准备
    1. 准备一块 96 孔板，设置空白孔、标准品孔和样品孔。向标准品孔中加入 50 µL 标准溶液，向样品孔中加入 50 µL 待测样品。将微孔板在 37 °C 孵育 10 分钟。
  5. 反应终止与吸光度测定
    1. 向每孔加入 100 µL 终止液以终止反应。在 405 nm 处测定吸光度，并根据吸光度值计算 ALP 活性（参照试剂盒说明书，见 材料表）。
      注意：含有标准品或具有 ALP 活性的样品孔将呈现不同程度的黄色。颜色在 2 小时内保持稳定。

5. 钙含量测定

注意：钙含量测定对于评估生物组织中矿化程度至关重要。

  1. 组织制备
    1. 将组织切成小块，并在裂解缓冲液中进行匀浆处理。
  2. 样品稀释与离心
    1. 按1:10的比例将组织稀释于裂解缓冲液中。充分匀浆后，在4 °C、12,000 × g 条件下离心5分钟。收集上清液用于分析。
      注意：使用5 mM钙标准溶液（见材料表）配制钙标准品稀释液（0–1.0 mM）。
  3. 酶标板设置与孵育
    1. 向96孔板的每个孔中加入50 µL标准品或待测样品，再加入150 µL检测工作液，充分混匀后，于室温避光孵育10分钟。在575 nm处测定吸光度，并绘制标准曲线。
  4. 钙含量计算
    1. 利用标准曲线计算钙含量，需结合稀释倍数、样品体积以及钙的原子量进行计算。

6. 炎症细胞因子（IL-6、TNF-α、IL-1β）的酶联免疫吸附测定（ELISA）

注意：IL-6、IL-1β 和 TNF-α 是关键的促炎性细胞因子，可指示炎症反应的存在及其严重程度。检测这些细胞因子对于理解炎症过程以及评估抗炎治疗的效果至关重要。

  1. 样本采集
    1. 从大鼠腹主动脉采集血清。室温下静置凝固2小时。在4 °C条件下以3,000 × g离心10分钟，收集上清液。
  2. 检测用微孔板的准备
    1. 准备一块96孔板，设置用于标准品和待测样本的孔。将不同浓度的标准品（参见材料表）各50 µL加入相应孔中。
  3. 样本准备
    1. 在每个用于待测样本的孔中加入40 µL样本稀释液。再向同一孔中加入10 µL样本，最终实现5倍稀释。
  4. 与酶标试剂孵育
    1. 除空白孔外，向所有孔中加入100 µL针对IL-6、TNF-α或IL-1β的特异性酶标试剂。将微孔板置于37 °C孵育60分钟。
  5. 洗涤
    1. 弃去除空白孔外所有孔中的液体。用1×洗涤液（以蒸馏水20倍稀释配制）洗涤各孔。重复此洗涤步骤五次，并将孔内液体甩干。
  6. 显色与反应终止
    1. 向每孔加入50 µL底物溶液A和B（来自商用试剂盒，参见材料表）。轻轻混匀后，将微孔板置于37 °C避光孵育15分钟。向每孔加入50 µL终止液以终止反应。
  7. 吸光度测定与数据分析
    1. 以空白孔调零，在450 nm波长下使用微孔板读数仪测定吸光度。根据标准品浓度及其对应的OD值绘制标准曲线。通过插值法计算样本浓度，并乘以稀释倍数进行校正。

7. 脂质谱分析

注意：血脂谱检测可发现异常的脂质水平，升高的或失衡的脂质水平可能加速血管钙化的风险。

  1. 总胆固醇和甘油三酯（TC 和 TG）
    1. 收集血清，并在96孔板中设置用于空白、校准和待测样品的指定孔。向每个孔中加入2.5 µL血清、校准标准品或空白溶液。
    2. 向每个孔中加入250 µL工作液。轻轻混匀，将板在37 °C孵育10分钟。使用酶标仪在500 nm处测定吸光度。
  2. 低密度脂蛋白和高密度脂蛋白（LDL-C 和 HDL-C）
    1. 收集血清，并在96孔板中设置用于空白、校准和待测样品的指定孔。向相应孔中加入2.5 µL血清、校准标准品或空白溶液。
    2. 根据检测试剂盒说明书，向每个孔中加入适当的试剂（试剂一为180 μL或试剂二为60 μL，参见材料表）。按照每种试剂推荐的温度（37 °C）和时间（试剂一为5分钟或试剂二为10分钟）进行孵育。
    3. 使用酶标仪在针对LDL-C或HDL-C指定的特定波长（600 nm）处测定吸光度。

8. 蛋白质印迹法

注意：蛋白质印迹（Western blot, WB）在评估关键蛋白质的表达水平方面具有重要作用，可用于检测总蛋白及其磷酸化形式。

  1. 组织制备
    1. 称取 0.05 g 组织，用 PBS 充分冲洗以去除多余碎片。加入含 1× 磷酸酶和蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液 500 µL。将组织在 4 °C 下孵育 10 分钟，并使用组织研磨器进行匀浆。
  2. 蛋白质提取
    1. 将匀浆后的样品静置 1 分钟，然后在 4 °C、12,000 × g 条件下离心 15 分钟。收集上清液用于蛋白质分析。根据制造商说明书使用 BCA 法测定蛋白质浓度（参见 材料表）。使用标准曲线计算浓度。
      注：使用前将离心机预冷至 4 °C。在 562 nm 处测定蛋白质浓度。
  3. 样品制备
    1. 按 4:1 的比例将蛋白质样品与含 β-巯基乙醇和 SDS 的 5× 上样缓冲液混合。将混合物在 100 °C 加热 5 分钟以变性蛋白质。
      ​注：如需 1× 上样缓冲液，可用裂解缓冲液稀释 5× 缓冲液。
  4. SDS-PAGE 凝胶制备
    1. 制备 12% 的 SDS-PAGE 凝胶，并将其放入电泳装置中。按说明加入 1× 电泳缓冲液至半满位置（参见 补充表 2）。
  5. 电泳
    1. 从 -20 °C 取出蛋白质样品。每孔上样 60 µg 蛋白质，运行电泳。
    2. 浓缩胶阶段设置电流为 50 mA，持续 20 分钟；分离胶阶段提高至 100 mA，持续 60 分钟，直至染料前沿到达凝胶底部。
  6. 转膜
    1. 将 PVDF 膜在甲醇中活化 5 分钟。
    2. 按以下顺序组装转膜“三明治”结构：滤纸 → SDS-PAGE 凝胶 → PVDF 膜 → 滤纸。在 300 mA 条件下转移蛋白质 60 分钟。
      ​注：确保 SDS-PAGE 凝胶与 PVDF 膜之间无气泡残留。
  7. 封闭
    1. 将 PVDF 膜在含 5% BSA（用 1× TBST 配制）的溶液中室温轻摇孵育 60 分钟。用 1× TBST 洗涤膜三次，每次 5 分钟。
  8. 一抗孵育
    1. 将膜置于 5 mL 合适的一抗（例如 p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3、p-NF-κB p65、NF-κB p65、IκBα）稀释液（用封闭缓冲液稀释）中，室温孵育 2.5 小时。
  9. 二抗孵育
    1. 一抗孵育后，用 1× TBST 洗涤膜三次，每次 5 分钟。加入合适的二抗，室温孵育 1 小时，再用 1× TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。
  10. 检测
    1. 使用 ECL 化学发光检测法显影蛋白条带24（参见 材料表）。
  11. 密度分析
    1. 使用 ImageJ 软件对蛋白条带进行定量分析。在 ImageJ 中遵循以下操作流程：图像 → 8 位 → 处理 → 减去背景。分析 → 设置测量选项 → 分析 → 设置标尺。编辑 → 反转 → 分析 → 测量 → 结果。文件 → 另存为 → IntDen。
    2. 使用绘图和统计分析软件生成统计图表。
      注：确保重复实验结果一致，以验证发现的可靠性。

9. 统计分析

  1. 使用 GraphPad Prism 9.0 收集并整理数据。
  2. 根据原始数据计算均值 ± 标准差（SD），并绘制误差线。
  3. 采用单因素方差分析（one-way ANOVA）进行统计分析，随后进行 Tukey 事后检验（Tukey's post-hoc test）以进行多重比较。
  4. 以 P < 0.05 为标准判定统计学显著性，P 值越小表示结果差异越显著。

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

网络药理学分析

利用 HERB、TCMSP、Pubmed、SwissTargetPrediction、CTD、PharmMapper、SEA 和 STITCH 等数据库，共鉴定出红景天苷的 388 个潜在靶基因。此外，从 GeneCards、OMIM、PharmGkb 和 DrugBank 等数据库中检索到与血管钙化（VC）相关的 2871 个潜在靶基因。随后进行交集分析 通过 维恩图显示有208个重叠靶点，被认为是红景天苷干预血管钙化（VC）的关键靶点图1A).

蛋白质相互作用网络分析

采用 STRING 平台分析 208 个关键靶点之间的相互作用，并从中筛选出前 100 个节点。随后将这些节点导入 Cytoscape 3.9.1 软件以构建详细的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络。通过使用 EC、BC、NC、LAC、CC ...

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讨论

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血管钙化（VC）的特征是血管细胞和组织发生退行性改变，血管内出现病理性矿物质沉积，导致血管壁僵硬或形成动脉粥样硬化斑块，进而引发阻塞性血管疾病25。研究表明，约85%的VC斑块可能发展为血栓，从而诱发急性心血管事件。此外，VC是潜在急性心血管事件、脑卒中及外周血管疾病的重要指征26。目前的治疗方法主要集中在抗凝、降脂药物以及血管张力调节，但这些方法往往疗效有限且存在副作用，尤其是在钙化晚期阶段。

红景天苷（Salidroside，SAL）是一种被鉴定为对羟基苯乙基-β-D-吡喃葡萄糖苷的化合物，在影响神经系统、心血管系统和免疫系统的多种血管疾病以及慢性肾病中已显示出显著的治疗潜力27,28。现代研究已证实其具有抗氧化、抗衰老、免疫调节和抗炎作用29,30<...

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披露

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确保所有作者均已披露任何及所有利益冲突。

致谢

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本工作得到吉林省科学技术厅项目（YDZJ202301ZYTS460）和吉林省教育厅项目（JJKH20230991KJ）的经费支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
30% (29:1) 丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液北京索莱宝科技有限公司 &安普科技有限公司，中国A1010
4% 多聚甲醛固定液碧云天生物技术股份有限公司（碧云天），中国P0099
5*上样缓冲液北京索莱宝科技有限公司 &安普科技有限公司，中国P1040
碱性磷酸酶检测试剂盒碧云天生物技术股份有限公司（Beyotime），中国P0321S
AlphaView 软件Proteinsimple 公司，美国AlphaView SA
BCA 蛋白检测试剂盒碧云天生物技术有限公司（Beyotime），中国P0012
蓝染液北京索莱宝科技有限公司 &安普科技有限公司，中国G1866
钙比色法检测试剂盒碧云天生物技术股份有限公司（Beyotime），中国S1063S
胶原纤维与弹性纤维染色试剂盒（EVG-Verhoeff 法）北京索莱宝科技有限公司 &安普科技有限公司，中国G1597
脱水机迪亚帕斯生物科学公司  有限公司，意大利Donatello
嵌入机中国武汉俊杰电子有限公司JB-P5
酶标仪 Biotek Co., Ltd, USA时期
无水乙醇GHTECH  有限公司，中国64-17-5
辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG（H+L）中国博奥生物技术有限公司BS20242-Y
GraphPad Prism 软件GraphPad Software，美国GraphPad Prism 9.0
苏木精-伊红染色试剂盒北京索莱宝科技有限公司 &安普科技有限公司，中国G1120
高密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒中国南京建成生物工程研究院有限公司A112
HRP标记的山羊抗兔IgG（H+L）广州赛国生物科技有限公司A0208
Image J 软件美国国立卫生研究院（NIH）Image J 
我κB Alpha 多克隆抗体Proteintech Group, Inc.A，美国10268-1-AP
JAK2 抗体Affinity Biosciences Co., Ltd，中国AF6022
低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒中国南京建成生物工程研究院有限公司A113
NF-κB p65 抗体Proteintech Group, Inc.A，美国10745-1-AP
病理切片机Leica Biosystems，美国RM2016
磷酸酶抑制剂混合物配方表瑞士罗氏制药有限公司04906845001
磷酸化-JAK2（Tyr931）抗体Affinity Biosciences Co., Ltd，中国AF3024
磷酸化-NF-κB p65(Ser276) 抗体Affinity Biosciences Co., Ltd，中国AF2006
磷酸化-STAT3(S727) 抗体Abways  科学 &安普科技有限公司，中国CY5291
蛋白酶抑制剂混合物 瑞士罗氏制药有限公司11873580001
PVDF膜瑞士罗氏制药有限公司3010040001
大鼠IL-1β ELISA试剂盒碧云天生物技术股份有限公司，中国PI303
大鼠IL-6 ELISA试剂盒碧云天生物技术有限公司（Beyotime），中国PI328
大鼠 TNF-α ELISA试剂盒碧云天生物技术股份有限公司，中国PT516
RIPA裂解缓冲液碧云天生物技术有限公司（Beyotime），中国P0013B
Salisoroside中国上海源叶生物科技有限公司S25475
SDS中国广州赛国生物科技有限公司3250KG001
碳酸钠中国医药集团有限公司，中国1001921933
碳酸氢钠中国医药集团有限公司，中国10018960
硫代硫酸钠中国医药集团有限公司，中国20042518
STAT3 抗体Proteintech Group, Inc.，美国10253-2-AP
TBST（10×)碧云天生物技术有限公司（Beyotime），中国ST673
总胆固醇检测试剂盒中国南京建成生物工程研究院有限公司A111
甘油三酯检测试剂盒中国南京建成生物工程研究院有限公司A110
Tris碱广州赛国生物科技有限公司1115GR500
直立式光学显微镜日本尼康公司Eclipse E100
冯科萨溶液 中国武汉服务生物技术有限公司G1043
Western Blotting Luminol 试剂Santa Cruz Biotechnology, Inc.，美国SC-2048
β-肌动蛋白抗体 Cell Signaling Technology, Inc., 美国E4967

参考文献

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