Typha latifolia 主要通过根状茎进行无性繁殖，由于其根系发达，采集存在困难。本文介绍了一种从种子培育 T. latifolia 的方法，便于实验室培养，并可实现无菌植株生长以及早期微生物生物强化。
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摘要
摘要
Typha latifolia，更常被称为宽叶香蒲或普通芦蒲，分布范围遍及全球，在北美的湿地生态系统中占据主导地位。尽管不同种类的香蒲在北美通常被视为入侵物种，但T. latifolia被认为是该地区的本土物种，并在整个北美大陆广泛分布，是占主导地位的Typha物种。历史上，Typha属植物曾具有多种用途，从食物来源到建筑材料均有应用。近年来，T. latifolia逐渐成为促进生物修复的重要物种。随着人们对构建人工湿地处理系统（CWTS）以去除污染物的兴趣日益增加，在实验室环境中可重复地培养香蒲的技术变得尤为必要。本文所开展的研究考察并测试了从种子成功培育T. latifolia的多种生长参数。研究表明，Typha属植物种子的成功萌发需要进行破皮处理（即破坏种皮），本研究采用机械方法实现了大规模生产中的这一过程。早期种子定植阶段最适宜在低营养条件下生长一周，随后在后续几周中施加肥料，以提高移栽后的成活率。在对植物系统进行微生物生物强化时，实验结果表明，将种子浸泡于接种物中可促进微生物对根部组织的更广泛定植，并实现细菌的长期存留。本研究采用了一种优化的种子灭菌技术，结合次氯酸钠和洗涤剂处理，以提高外源微生物的定植成功率。本研究所设计的培养容器（包括无菌和非无菌条件）均支持T. latifolia在多种环境条件下的长期生长。
引言
作为一种成本低廉且节能的技术，人工湿地处理系统（CWTS）在环境污染物修复方面已获得广泛应用1,2,3. 人工湿地处理系统（CWTS）利用物理、化学和生物过程来去除、转化或稳定污染物。尽管自人工湿地处理系统诞生以来，其中涉及的物理和化学转化过程已得到充分表征，但植被的影响在很大程度上仍不明确。2近年来，人们越来越关注植物转化有机和无机污染物的机制研究 废水中潜在的担忧2,4,5然而，此类机制研究依赖于大量培养大型水生植物的能力，并倾向于从种子开始培养，以确保每株植物处于相同的生长和发育阶段。
北美地区的人工湿地通常采用本地自然湿地中的原生植物进行构建，例如Typha、Scirpus、Juncus和Phragmites属物种6,7。植物种类的选择还取决于所采用的人工湿地类型，后者在深度、水流方式、基质来源和水源（是否循环）等方面可能存在差异2。此外，气候也会影响湿地植被的分布，较冷的气候条件下更有利于沉水植物生长，因其具有更强的适应能力8。其中，Typha属植物在深水表面流人工湿地中尤为受到关注，因其能够快速定殖于新环境，并适应多种不同的环境条件9,10。
最近的一项综述结果显示，在已报道的87项利用香蒲属（Typha）植物进行的植物毒性测试中，仅有15项研究从种子开始培养试验植物，而在这些研究中，仅有一项考察了成熟植株的生长情况11。香蒲植物从种子开始的实验研究严重不足，表明目前文献中尚缺乏针对实验室研究中香蒲栽培方法的系统性方案。本文所述方案旨在弥补这一空白，提供一套详细的从种子到成熟植株的宽叶香蒲（Typha latifolia）培养方案，涵盖无菌与非无菌条件下的生长流程。此外，本文还介绍了一种在种子阶段对香蒲属植物进行细菌生物强化的技术，早期接种有助于所引入的根际和内生微生物在植物体内长期定殖。
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方案
1. 种子破皮处理
- 香蒲种子于2023年秋季采自加拿大阿尔伯塔省卡尔加里市的一处湿地（51.11312° N, 114.39381° W）。秋季采集香蒲花序，装入纸袋后避光保存至使用。若种子仍在茎秆上，可在春季采集，但种子回收率会降低。
- 使用园艺剪刀从花序基部向上约2 cm处剪断植株茎秆。将种子从花序上剥离，并放入实验室搅拌机中，直至搅拌机体积约填充至四分之一 。此量约为250 mL未压实的种子。
- 向搅拌机中加入500 mL自来水，搅拌机内需保留约10 cm的顶部空间。以中低速搅拌20秒，随后立即转移至一个洁净的1 L大烧杯中。所得溶液应呈黏稠状。
- 将约100 mL上述种子-水混合物重新倒入搅拌机，再加入400–600 mL新鲜自来水。以中高速搅拌20秒，随后立即转移至另一个洁净的1 L烧杯中。
- 向烧杯中加自来水至总体积达800 mL，静置至少60秒。经划痕处理且具活力的香蒲种子会沉至烧杯底部，而种毛和喙部结构（见图1中对香蒲种子结构的说明）则会浮至液面。用工具捞除液面漂浮物，并缓慢倾倒出上清液，注意勿扰动底部种子。将底部种子转移至一个100 mL烧杯中。
- 对步骤1.5中剩余的香蒲混合物重复上述搅拌处理过程。
- 将盛有种子的烧杯置于搅拌器上，以中等速度持续搅拌1小时。1小时后，捞除液面上漂浮的植物残渣。
- 将种子倒入带有滤纸的布氏漏斗中，连接真空泵抽滤，过夜干燥。干燥后的种子可保存于-20 °C环境中，置于15 mL锥形聚丙烯管中。
2. 使用非无菌技术进行萌发
- 制备含1%植物琼脂的半强度Murashige和Skoog（MS）培养基平板12。
- 将约1 mL干燥种子放入15 mL圆锥形聚丙烯管中，加入10 mL自来水。在旋转摇床上以低速振荡24小时，以诱导种子萌发。
- 去除多余水分，使15 mL圆锥形聚丙烯管中剩余3 mL液体。
- 剪切1000 µL塑料移液枪头的尖端以增大孔径，用力吹吸种子溶液，使种子充分悬浮于枪头内。
- 将种子和水滴加到半强度MS琼脂平板上，轻轻旋转平板使种子均匀分布。
- 用实验室密封膜包裹平板，置于培养室中，在23 °C、70%湿度条件下进行16小时光照/8小时黑暗的光周期培养。培养1周（最长可达2周），以诱导种子萌发。
3. 使用无菌技术进行萌发
注意：已测试并比较了不同的种子灭菌方案。此处所述方法是在先前方案13基础上改进而来的，该方法在获得最高萌发率的同时可实现种子的完全灭菌。
- 制备含1%植物琼脂的半强度MS培养基平板12。
- 取约1 mL种子放入15 mL圆锥形聚丙烯管中，加入10 mL无菌ddH2O。置于摇床，中高速振荡10分钟。
- 弃去上清液，向15 mL圆锥形聚丙烯管中加入5 mL含0.1%吐温20的溶液（用无菌ddH2O配制）。置于摇床，中高速振荡10分钟。
- 弃去溶液，向15 mL圆锥形聚丙烯管中加入5 mL含30%商用漂白剂和0.025%吐温20的溶液（用无菌ddH2O配制）。中高速振荡30分钟。
- 弃去溶液，替换为无菌ddH2O。中高速振荡5分钟。重复此步骤，共进行3次水洗。
- 用无菌ddH2O充满15 mL圆锥形聚丙烯管，并以低速旋转24小时以诱导萌发。24小时后，去除多余液体，保留3 mL于塑料管中。
- 无菌条件下剪切1000 µL塑料移液枪头的尖端，用力吹打使种子悬浮于枪头内。
- 将种子和液体接种至半强度MS琼脂平板上。轻轻旋转平板以均匀分布种子。
- 用实验室密封膜包裹平板，置于培养室中，设置光照周期为16小时光照/8小时黑暗，温度23 °C，湿度70%。培养1周（最长可达2周），以促进种子萌发。
4. 用选定的细菌对种子进行接种
- 接种香蒲种子时，首先按照上述无菌种子萌发方案进行操作，直至步骤3.6，以获得无菌种子。按照上述步骤3.6所述，从15 mL圆锥形聚丙烯管中移除最后一次水洗液。
- 使用从单一分离株或微生物群落接种并过夜培养的微生物培养物，测定其OD600，并通过培养基稀释将其归一化至1.0的吸光度值。如果未达到OD600为1.0，则延长培养时间。
注意：此处的培养物来源于加拿大阿尔伯塔省北部植物根部分离的Luteimonas sp.，并经接合转化表达DsRed荧光蛋白，以便显微观察。 - 取1 mL培养物在9300 × g 条件下离心2分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于1 mL 1×磷酸盐缓冲液中，再次在9300 × g 条件下离心2分钟。
- 弃去上清液，将细菌沉淀重悬于1 mL无菌ddH2O中。
- 在15 mL圆锥形聚丙烯管中，将约1 mL种子与10 mL已用0.025%有机硅表面活性剂稀释10倍的制备接种液混合，低速振荡培养24小时。
- 从步骤3.8开始，继续执行后续的无菌种子萌发方案。
5. 土壤中非无菌条件下香蒲的生长
- 选择低有机质含量的土壤装入花盆，距盆口留出1厘米空间。用自来水预先润湿土壤，并在土壤中戳出深1厘米的小孔。
- 使用镊子小心地从上述第3步所述的MS琼脂平板上取出已萌发1周的幼苗，注意避免损伤根部。将每株幼苗轻轻放入土壤小孔中，并用土壤覆盖。
- 将花盆放入托盘中，并用自来水加水至与土壤齐平。每10个花盆加入100 mL的0.5% 20/20/20 NPK肥料。
- 对每组十个花盆按以下方式添加肥料：第2周加入100 mL 0.5%肥料，第3周加入100 mL 1.0%肥料，第4周加入100 mL 1.0%肥料。
- 4周后停止每周施肥，改为每月仅施肥一次，每次施用100 mL 1.0%肥料溶液。在第4周时，如需要可移栽至更大的花盆中。此时植株对土壤类型不敏感，可使用任意混合土壤。
- 随着香蒲生长超出容器容量，继续进行移栽。使用剪刀清除枯死的叶片。每月为香蒲施肥一次。
- 对于实验用途，将幼苗移栽至一个小花盆中，该花盆放入空移液器吸头盒底部时可由盒壁固定，从而实现对土壤的充分淹水，以模拟湿地环境。若对较老的香蒲植株进行实验，也应作类似调整，使花盆几乎可完全浸没于水中。
6. 无菌苗生长
- 幼苗生长培养箱设计
注意：组装每个幼苗生长培养箱单元需要两个培养盒、一个带有鲁尔锁接头的注射器、一个一次性0.2 µm无菌滤器以及耐高温硅胶。培养箱装置的示意图参见图2。- 取下培养盒的盖子，使用手持电钻在盖子中心钻出直径为3.5 cm的孔。使用耐高温硅胶将两个盖子的顶部粘合在一起。
- 在其中一个培养盒的底部角落钻一个与注射器尖端大小相匹配的孔（约1 cm直径）。剪下注射器的尖端，丢弃注射器主体部分。
- 使用耐高温硅胶将注射器尖端固定在培养盒上，确保鲁尔锁螺纹位于培养盒外部。
- 硅胶需至少固化24小时后方可使用。
- 土壤中的无菌培养
- 按照步骤3中描述的无菌种子萌发方案获得无菌种子。
- 用所选土壤填充无菌培养单元，并用自来水润湿土壤。
- 在液体程序下高压灭菌20分钟，用铝箔覆盖鲁尔锁尖端。24小时后，再次对系统进行液体程序高压灭菌20分钟。所有后续操作均应在超净工作台中进行。
- 将一个0.2 µm滤器装置连接至生长培养箱上的鲁尔锁接口（图2）。打开培养箱，向土壤中加入500 µL经滤膜灭菌的1% 20/20/20肥料溶液。使用无菌刮铲混合土壤。在混合过程中加入无菌ddH2O，确保土壤充分湿润但不过度饱和。
- 使用无菌剃刀片将含有1周龄幼苗的MS琼脂平板切成四等份。使用无菌刮铲将琼脂块放置于土壤表面。
- 将培养单元放入植物培养箱中，在23 °C、70%湿度条件下，设置16小时光照/8小时黑暗的光周期。
- 水培溶液中的无菌培养
- 按照步骤3中描述的无菌萌发方案获得无菌种子。
- 将移液器吸头盒和半浓度MS琼脂在液体程序下高压灭菌20分钟。在超净工作台中，用无菌实验室封口膜包裹吸头插入件的底部。将每个移液器吸头孔内填充琼脂至接近顶部。
- 将吸头插入件放回吸头盒中，并在盒底部加入半浓度霍格兰水培营养液（0.5 mM NH4H2PO4、3 mM KNO3、2 mM Ca(NO3)2、1 mM MgSO4、0.023 mM H3BO3、0.005 mM MnCl2·4H2O、0.0004 mM ZnSO4·7H2O、0.0002 mM CuSO4·5H2O、0.00007 mM H2MoO4·1H2O 和 0.045 mM FeSO4·7H2O，调节pH至7.0）。
- 小心地从MS琼脂平板上取出幼苗，并将其放置在吸头盒插入件的移液器吸头孔顶部的MS琼脂上。
- 盖上吸头盒盖子，放入培养箱中，在23 °C、70%湿度条件下，设置16小时光照/8小时黑暗的光周期。
- 当植株生长过大不再适合吸头盒时，将其移栽至步骤5.1中描述的培养生长箱中。转移时，将带有植株的整个琼脂塞取出，并插入带有径向切口的泡沫塞中。将泡沫塞置于两个培养盒之间，下部培养盒中加入半浓度霍格兰营养液。
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结果
图1 展示了经过划破种皮处理的香蒲（Typha）种子示意图，以及一个未完全划破种皮但已去除喙部的种子和一个未经划破种皮处理的种子。请确保搅拌时间足够长，以主要获得完全划破种皮的种子。
在划破种皮并干燥种子后，应使用非无菌萌发技术检测种子活力。7天结束时，至少应有20%的种子萌发出带有芽组织的初生根。较低的萌发率可能表明种子活力差或生长条件不适宜。种子灭菌通常能提高萌发率（图3）。据推测，灭菌可进一步对种子起到化学划破种皮的作用，从而促进萌发。
从培养皿移栽到土壤中时，大约有10%–40%的幼苗能够存活。在无菌生长条件下，存活率可能更低。移栽至土壤后，1–2周内将长出新的茎叶组织。香蒲植物典型营养生长期如图4所示。
本文所述的种子灭菌方案与其他五种灭菌方案进行了比较：70%乙醇（...
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讨论
本文提供的方案详细介绍了从种子开始培养香蒲属植物以用于实验室应用的方法。虽然香蒲可通过根茎扦插轻松繁殖，但从种子开始培育植株能够保证样本群体内的遗传多样性，确保植株处于相同的生长阶段，并为微生物生物强化实验中的早期定殖提供机会。正确鉴定所采集的物种至关重要，因为更具入侵性的香蒲物种的繁殖可能会导致本地物种被取代14。此外，入侵性杂交种通常育性较低，而其根茎生长更为旺盛，可能因异花授粉减少而导致遗传多样性下降，从而在湿地中占据主导地位15。香蒲种子可从在线零售商处购买，但由于其被列为国际自然保护联盟（IUCN）无危物种，也可在未经许可的情况下从公共土地上采集16。采集香蒲时，应参考当地的植物鉴定检索表，以确保采集到目标物种。简而言之，T. latifolia 可通过较宽的叶片（宽度超过1.2 cm）以及雌雄花序在植株上紧密相邻排列的特征，与北美其他香蒲物种相区分14。
采集花序...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
AZ 获得了加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）CGS-M 研究生奖学金的资助。Muench 实验室关于 CWTS 的研究由基因组加拿大（Genome Canada）通过大规模应用研究项目（LSARP）拨款（#18207）资助，并与基因组阿尔伯塔（Genome Alberta）和基因组魁北克（Genome Quebec）合作支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.2 µm 无菌滤器 | VWR | 514-4126 | |
| 3′,5′-二甲氧基-4′-羟基苯乙酮 | PhytoTech Labs | S7777 | |
| 带盖培养盒（77 mm × 77 mm × 97 mm） | Millipore Sigma | V8505 | |
| 耐高温硅酮密封胶 | Imperial Manufacturing Group | KK0205 | |
| 实验室封口膜 | Millipore Sigma | P7793 | |
| Murashige 和 Skoog 培养基 | PhytoTech Labs | M401 | |
| 有机硅表面活性剂 | PhytoTech Labs | S7777 | |
| Phytoagar | GoldBiotechnology | P1003 | |
| 聚山梨酯 20 | Roche | 11332465001 |
参考文献
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