斑 旸 （香蒲）的栽培和微生物生物增强的优化方法

Summary

斑柞主要通过根茎无性繁殖，由于其广泛的根系，给收集带来了挑战。本文提出了一种从种子中种植 T. latifolia 的方法，促进了更容易的实验室培养，并提供了植物不育生长和早期微生物生物增强的潜力。

Abstract

斑桟病，通常被称为阔叶香蒲或普通芦苇，分布范围遍及全球，在北美的湿地生态系统中占据主导地位。虽然不同种类的香蒲在北美通常被认为是入侵的，但 T. latifolia 被认为是该地区的本地物种，并且作为主要的斑疹伤寒物种遍布整个大陆。从历史上看，斑疹伤寒具有多种功能，从食物来源到建筑材料。最近，T. latifolia 已成为帮助生物修复工作的重要物种。随着人们对开发用于污染物修复的人工湿地处理系统 （CWTS） 的兴趣日益浓厚，在实验室环境中种植香蒲的可重复技术是必要的。这里介绍的工作检查和测试了从种子成功培养 T. latifolia 的各种生长参数。斑疹伤寒物种的成功发芽涉及疤痕（种皮破裂），这是使用机械技术实现的大规模生产。早期种子建立被证明有利于第一周的低养分生长条件，随后在随后的几周内引入肥料以提高移植后存活率。对于植物系统的微生物生物增强，结果表明，将种子浸泡在接种物中会导致根系组织更广泛的定植和细菌的长期持久性。使用漂白剂和洗涤剂组合的优化种子灭菌技术来提高微生物定植成功率。本研究设计的无菌和非无菌生长血管支持白叶枴虫在各种条件下的长期生长。

Introduction

人工湿地处理系统（CWTS）作为一种具有成本效益和节能的技术，在环境污染物的修复中广受欢迎^1,2,3。CWTS 使用物理、化学和生物过程来去除、转化或稳定污染物。虽然自CWTS诞生以来，化学周转所涉及的物理和化学过程已经得到了很好的表征，但植被的影响在很大程度上仍然是个谜^2。近年来，人们越来越关注了解植物转化废水中潜在关注的有机和无机污染物的机制 ^2,4,5。然而，诸如此类的机制研究依赖于培养大量大型植物的能力，并有利于从种子开始生长，以确保每株植物都处于同一生长发育阶段。

北美的 CWTS 经常使用该地区天然湿地原生的植被建立，例如斑疹伤寒、Scirpus、Juncus 和芦苇物种 ^6,7。植被的选择还取决于所使用的人工湿地，其深度、水流、基质来源和水源（有或没有再^{循环）可能会}有所不同2。最后，气候也会影响湿地植被，凉爽的气候有利于水下植物，因为它们的适应性增强⁸。斑疹伤寒物种在深层地表流人工湿地中特别感兴趣，因为它们能够快速定居环境并适应不同的环境条件 ^9,10。

最近的一项结果回顾报告称，在使用 Typha 物种的 87 项植物毒性测试中，只有 15 项研究从种子开始测试植物，其中只有一项研究检查了成熟植物的生长¹¹。种子香蒲实验的代表性不足表明，有关旨在描述用于实验室研究的香蒲种植方案的文献存在空白。这里概述的协议旨在通过提供在无菌和非无菌条件下将 斑柞 从种子生长到成熟植物的深入协议来弥合这一差距。此外，本文还讨论了一种在种子期对香蒲物种进行细菌生物增强的技术，其中早期接种有助于维持引入的根茎和内生微生物的长期持久性。

Protocol

1.种子松土

1. 香蒲种子于 2023 年秋季来自加拿大艾伯塔省卡尔加里的湿地（北纬 51.11312°，西经 114.39381°）。秋季收集香蒲花序，存放在纸袋中避光使用。如果还在茎上，请在春季收集花序，但种子恢复会减少。
2. 使用园艺剪，将植物茎从花序基部 ~2 厘米处剪下。将种子从花序上拉下，放入实验室搅拌机中，直到搅拌机的体积大约四分之一满。这是大约 250 mL 未压实的种子。
3. 用 500 mL 自来水填充搅拌机。在搅拌机中保持 10 厘米的顶部空间。以中低速搅拌 20 秒，然后立即转移到一个大的 1 L 烧杯中。所得溶液应该是粘性的。
4. 将大约 100 mL 的种子水污泥转移回搅拌机中，并在搅拌机中装满 400-600 mL 新鲜自来水。以中高速搅拌 20 秒，然后立即转移到新鲜的 1 L 烧杯中。
5. 用自来水将烧杯装满至800 mL，静置至少60秒。瘢痕化且有活力的香蒲种子将沉入烧杯底部，羽流和喙（香蒲种子结构的描述见 图 1 ）将漂浮到顶部。舀掉烧杯顶部的污泥，慢慢倒出烧杯中的水，不要打扰底部的种子。将种子转移到 100 mL 烧杯中。
6. 对步骤 1.5 中的香蒲污泥的剩余部分重复混合过程。
7. 将装有种子的烧杯放在搅拌板上，以中速旋转1小时。1 小时后，舀掉漂浮在烧杯顶部的任何植物材料。
8. 将种子倒入带有滤纸的 Büchner 漏斗中，将滤纸连接到真空中，以将种子干燥过夜。干燥种子可以在-20°C下储存在15mL锥形聚丙烯管中。

2. 使用非无菌技术发芽

1. 用1%植物琼脂¹²制备半强度的Murashige和Skoog（MS）培养基板。
2. 将大约 1 mL 干种子放入 15 mL 锥形聚丙烯管中，并装满 10 mL 自来水。在轨道振荡器上低速旋转24小时以诱导发芽。
3. 除去多余的水，使 3 mL 留在 15 mL 锥形聚丙烯管中。
4. 切割 1000 μL 塑料移液器吸头的尖端以增加孔径，并用力移液种子溶液以将种子悬浮在移液器吸头内。
5. 将种子和水放在半强度的MS琼脂平板上。旋转盘子以均匀分布种子。
6. 将板包裹在实验室密封膜中，并将它们放入生长室中，在23°C和70%湿度下进行16小时/ 8小时的明暗循环。将板孵育1周（最多2周）以诱导种子发芽。

3. 使用无菌技术发芽

注意：测试和比较了不同的种子灭菌方案。在生产完全灭菌种子时产生最高发芽率的技术是从先前的方案¹³ 修改而来的，这里对此进行了描述。

1. 用 1% 植物琼脂¹² 制备半强度 MS 培养基板。
2. 将大约 1 mL 的种子放入 15 mL 锥形聚丙烯管中，并填充 10 mL 无菌 ddH₂O。以中高速置于轨道振荡器上 10 分钟。
3. 除去水，将 5 mL 0.1% 聚山梨醇酯 20 溶液（在无菌 ddH₂O 中制备）加入 15 mL 锥形聚丙烯管中。以中高速置于轨道振荡器上10分钟。
4. 取出溶液，将 5 mL 的 30% 商业漂白剂和 0.025% 聚山梨醇酯 20 溶液（在无菌 ddH₂O 中制备）加入 15 mL 锥形聚丙烯管中。以中高速摇晃30分钟。
5. 取出溶液并用无菌ddH₂O代替。以中高速摇动5分钟。重复总共 3 次水冲洗。
6. 用无菌ddH₂O填充15mL锥形聚丙烯管，并低速旋转24小时以诱导发芽。24小时后，除去多余的水，使塑料管中残留3mL。
7. 无菌切割 1000 μL 塑料移液器吸头的尖端，并用力移液以将种子悬浮在吸头内。
8. 将种子和液体接种在半强度的MS琼脂平板上。旋转盘子以均匀分布种子。
9. 将板包裹在实验室密封膜中，并在 23 °C 和 70% 湿度下以 16 小时/8 小时的明暗循环放入生长室中。将板放置 1 周（最多 2 周）以允许发芽。

4. 种子接种选定的细菌

1. 要接种香蒲种子，首先按照上述不育种子发芽方案，直到步骤3.6以产生不育种子。如上述步骤 3.6 所述，从 15 mL 锥形聚丙烯管中取出最终的水冲洗液。
2. 使用从单个分离株或群落接种的过夜生长微生物培养物，测量OD600，并通过在培养基中稀释归一化至1.0吸光度值。如果未达到 1.0 的 OD600，则将培养物孵育更长的时间。
   注意：在这里，培养物是从艾伯塔省北部的植物根中分离出来的 Luteimonas sp. 建立的，并偶联以表达 DsRed 荧光蛋白，以进行显微可视化。
3. 以 9300 x g 旋转 1 mL 培养物 2 分钟。除去上清液并将沉淀重悬于 1 mL 1x 磷酸盐缓冲盐水中。以 9300 x g 旋转 2 分钟。
4. 除去上清液并将细菌沉淀重悬于 1 mL 无菌 ddH2O 中。
5. 在15mL锥形聚丙烯管中，用0.025%有机硅表面活性剂以1：10稀释的制备接种物中以低速摇动约1mL种子24小时。
6. 从步骤3.8开始，遵循无菌种子发芽方案的其余部分。

5. 非无菌香蒲在土壤上生长

1. 用选择的低有机物土壤填充花盆，从花盆顶部留出 1 厘米的空间。用自来水预先润湿土壤，并在土壤中戳 1 厘米的孔。
2. 使用镊子，轻轻地从上述步骤 3 中所述生长的 MS 琼脂平板中取出发芽 1 周的幼苗，注意不要损坏根部。轻轻地将幼苗放入土壤的每个孔中，并用土壤覆盖。
3. 将花盆放入托盘中，用自来水填充至土壤水平。每 10 盆添加 100 mL 0.5% 20/20/20 NPK 肥料。
4. 每套十个花盆，按如下方式添加肥料：第 2 周 - 100 毫升 0.5% 肥料，第 3 周 - 100 毫升 1.0% 肥料，第 4 周 - 100 毫升 1.0% 肥料。
5. 4周后，停止每周施肥，每月仅施肥一次，施100毫升1.0%肥料溶液。如果需要，在 4 周时，移植到更大的盆中。此时植物对土壤类型不太敏感，因此请使用任何混合物。
6. 当香蒲长大到超出容器时，继续移植香蒲。用剪刀去除枯叶。每月给香蒲施肥一次。
7. 对于实验，将幼苗移植到一个小盆中，当放入空移液器吸头盒的底部时，该盆被盒子的侧面固定。这允许土壤适当地淹没，从而模仿湿地条件。如果对较旧的香蒲进行实验，请进行类似的修改，以便花盆几乎完全浸没在水中。

6.不育幼苗生长

1. 幼苗生长室设计
   注意：每个幼苗生长室单元的组装需要两个培养盒，一个带鲁尔锁头的注射器，一个一次性的0.2μm无菌过滤器和耐热硅胶。有关腔室设置的可视化表示，请参见 图 2 。
   1. 从培养盒上取下盖子，并使用手持钻头在盖子中央打出直径 3.5 厘米的孔。使用耐热硅胶将两个盖子的顶部粘在一起。
   2. 在其中一个培养盒的底角钻一个注射器尖端大小（直径~1厘米）的孔。从注射器上切下尖端并丢弃注射器的主体。
   3. 使用耐热硅胶将注射器的尖端固定到培养盒中，盒子外侧的鲁尔锁螺纹。
   4. 使用前让硅胶固化至少 24 小时。
2. 土壤中的不育生长
   1. 按照步骤3中描述的无菌种子发芽方案获得无菌种子。
   2. 用自来水润湿的土壤填充无菌生长室单元。
   3. 在液体上高压灭菌 20 分钟循环，用铝箔覆盖诱饵锁头。24小时后，在液体20分钟循环中再次高压灭菌系统。在层流罩中执行所有后续步骤。
   4. 将 0.2 μm 过滤单元连接到生长室上的鲁尔锁附件（图 2）。打开生长室，向土壤中加入500μL过滤灭菌的1%20/20/20肥料。用无菌抹刀混合土壤。混合土壤时，添加无菌 ddH₂O 以确保其充分水合而不会过度饱和。
   5. 使用无菌剃须刀片将MS琼脂从含有1周龄幼苗的板中切成四等份。使用无菌抹刀将琼脂片放在土壤上。
   6. 将生长室单元在23°C和70%湿度下以16小时/ 8小时昼夜循环放入植物生长培养箱中。
3. 在水培溶液中无菌生长
   1. 按照步骤3中描述的无菌发芽方案获得无菌种子。
   2. 将移液器吸头盒和半强度MS琼脂在液体20分钟循环上高压灭菌。在层流罩中，用无菌实验室密封膜包裹吸头插入物的底部。用琼脂填充每个移液器吸头开口，几乎到顶部。
   3. 将吸头插入物重新添加到吸头盒中，用半强度的霍格兰水培生长溶液（0.5 mM NH₄H₂PO_4,3 mM KNO_3,2 mM Ca（NO₃）2,1mM MgSO 4,0.023 mM H₃BO_3,0.005 mM MnCl₂·4H₂O，0.0004 mM ZnSO₄·7H₂O， 0.0002 mM CuSO₄·5H₂O、0.00007 mM H₂MoO₄·1H₂O 和 0.045 mM FeSO₄·7H₂O，调整至 pH 7.0）。
   4. 小心地从MS琼脂板中取出幼苗，并将它们放在MS琼脂顶部的吸头盒插入物中的移液器开口中。
   5. 关闭吸头盒盖，在23°C和70%湿度下以16小时/ 8小时昼夜循环置于生长室中。
   6. 当植物对于尖端盒来说太大时，将它们移植到步骤5.1中描述的培养生长室中。要转移，请取出带有植物的整个琼脂塞，并将其移入带有径向切割的泡沫塞中。泡沫塞可以放在两个培养箱之间，底部培养箱可以装满半强度的霍格兰。

Results

图 1 显示了经过瘢痕化过程的 斑疹伤寒 种子的表示，以及去除喙的未完全瘢痕化种子和未瘢痕化的种子。确保混合时间足以生产主要完全松土的种子。

将种子松土并干燥后，应使用非无菌发芽技术测试种子的活力。在 7 天结束时，至少 20% 的种子应该有带有芽组织的新自由基。较低的发芽率可能表明种子活力差或生长条件不足。种子灭菌往往会产生更高的发芽率（图3）。建议灭菌有助于进一步对种子进行化学松土并促进发芽。

当从板块移动到土壤时，大约 10%-40% 的幼苗应该存活下来。在不育生长条件下，可以预期较低的存活率。移植到土壤中时，移植后1-2周会出现新的枝条组织。香蒲植物的标准营养生命过程如 图 4 所示。

将此处描述的种子灭菌方案与其他五种灭菌方案进行比较：在70%乙醇（EtOH）中浸泡1...

Discussion

此处介绍的协议为从种子中生长香蒲物种提供了详细的指南，用于实验室应用。虽然香蒲可以很容易地从根茎插条中繁殖，但从种子开始种植植物允许样本集中的遗传变异，确保植物处于相同的生长阶段，并为微生物生物增强实验提供早期定植的机会。正确识别正在收集的物种非常重要，因为更具入侵性的香蒲物种的繁殖可能会促进本地物种的迁移¹⁴。此外，入侵杂交物种的生育力通常降低，其根茎活力的增加可能使它们能够在由于异型杂交减少而遗传多样性减少的湿地中占据主导地位¹⁵。香蒲种子可以从在线零售商处获得，但由于它们被列为国际自然保护联盟 （IUCN） 最不受关注的物种，因此它们也可能在未经许可的情况下从公共土地上收获¹⁶。采摘香蒲时，参考当地植物识别键，确保收集到感兴趣的物种。简而言之， T. latifolia 可以与北美的其他香蒲物种区分开来，因为它们的叶子更宽（宽大于 1.2 厘米），并且雄花和雌花紧密并置在植物上

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 & micro;M无菌滤器	VWR	514-4126
3′，5′-二甲氧基-4′-羟基乙苯酮	植物科技实验室	S7777
带盖的培养盒（77毫米&时间;77毫米&时间;97毫米）	米利波尔西格玛	V8505
耐热硅胶密封剂高温	帝国制造集团	KK0205
实验室密封膜	米利波尔西格玛	P7793
村重和Skoog媒体;	植物科技实验室	M401
有机硅界面活性剂	植物科技实验室	S7777
植物拟-nbsp;	金生物技术	P1003
聚山梨酸盐20	罗 氏	11332465001