我们提供一种在循环测试平台上于心室辅助装置(VAD)中诱导血栓形成的台式实验方案。该方法可用于识别血流路径中的血栓高发区域,有助于在开展动物模型的临床前测试之前提升装置的抗血栓性能。
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我们提供一种在循环测试平台上于心室辅助装置(VAD)中诱导血栓形成的台式实验方案。该方法可用于识别血流路径中的血栓高发区域,有助于在开展动物模型的临床前测试之前提升装置的抗血栓性能。
血栓形成的风险在心室辅助装置(VAD)的研发和临床应用中仍然是一个重大问题。传统的VAD血栓形成性评估主要依赖动物实验,这类方法成本高、耗时长,存在伦理问题,且最终可能无法准确反映人类的临床结果。为克服这些局限性,我们开发了一种强化的 体外 旨在诱发血栓形成并识别血流路径中潜在高风险区域的检测方案。该方案受Maruyama等人研究工作的启发,采用改良的抗凝策略,并利用易于获取的组件,使其适用于大多数开展相关研究的实验室 体外 通过VAD的血液检测,我们通过迭代测试和优化一种微型磁悬浮小儿心室辅助装置(PediaFlow PF5)验证了该方法的实用性。该方法已有效识别出早期VAD原型因设计和制造缺陷导致的血栓形成热点区域,从而在进入动物实验前实现针对性改进。尽管存在缺乏脉动血流以及供体血液特性影响等局限性,该方案仍可作为VAD早期研发阶段的风险评估与控制的实用工具。
心室辅助装置(VAD)已成为治疗晚期心力衰竭患者的标准手段,然而血栓形成和卒中的风险仍然是一个重大挑战1,2。VAD内的血栓形成通常在临床前动物实验中进行评估,尽管这类研究具有重要价值,但仍存在显著的成本和后勤挑战。这些研究耗费大量资源、耗时较长,且单个缺陷可能导致整个试验失败,从而需要额外的试验。这不仅增加了经济负担,也因需重复进行动物实验而引发伦理方面的担忧。
尽管目前已存在许多用于预测血小板沉积和血栓形成的数值模型3,4,5,6,但其中仅有少数适用于模拟心室辅助装置(VAD)等宏观尺度设备中的血栓形成过程7,8,9。此外,现有模型不可避免地假设了理想化的表面和简化的"密闭"几何结构,无法准确反映真实泵体组件的复杂性与缺陷。当考虑血小板与表面相互作用时,这些宏观尺度模型通常采用统一设定的材料属性(通常在表面通量边界条件中以系数形式建模)10,11,12。因此,数值模型尚无法完全替代血液实验测试。
材料选择和表面光洁度在VAD表面血小板黏附过程中均起着关键作用13,14,15,16,17。表面粗糙区域或不规则等缺陷可能促进血小板黏附及血栓形成。此外,流路中部件之间的缝隙可成为血栓形成的起始点,为血凝块的形成和生长提供受保护的环境18,19。在装配过程中使用润滑脂、润滑剂或密封剂也可能带来风险,因为这些物质可能渗入流路并与血液相互作用,进一步增加并发症风险。
因此,有必要建立一个明确定义的 体外 一种可在动物实验或临床应用前可靠评估心室辅助装置(VAD)抗血栓性能的测试方案。尽管目前已有广泛采用的ASTM标准用于溶血评估20,目前尚无针对心室辅助装置(VAD)在临床相关运行条件下进行血栓形成性测试的统一标准21尽管三十年前的开创性研究已证明其可行性 体外 血泵血栓检测22,23,24,25迄今为止,动物实验仍然是评估血栓形成的实际常规做法26. 阻碍更广泛应用的因素 体外 方法的复杂性可能源于凝血过程本身的复杂性,以及众多可能影响检测结果的混杂因素,这使得区分内在泵的血栓形成倾向与因方法学局限性和操作误差引起的人工假象变得极具挑战性。
这促使我们分享一份详细的实验方案,以指导研究人员避免常见问题,从而促进该方法的应用 体外 测试并减轻对动物实验的依赖。本文所述方案源自 Maruyama 等人。27在5的设计过程中进行了优化和验证th 第五代 PediaFlow(PF5)儿科心室辅助装置28,29该检测方法在动物实验前系统性地识别和解决VAD原型中潜在的血栓形成风险方面发挥了关键作用。
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本研究中使用的绵羊全血购自商业供应商,因此无需康奈尔大学机构动物护理和使用委员会进行审查。
1. 测试流动回路的构建
注意:有关本实验方案中使用的环路组件及其他所有材料的详细列表,请参见材料表。
2. 氯化钙(CaCl2)溶液的配制
3. 血液的制备
注意:本研究中使用的绵羊血液来自 材料表 中列出的商业供应商。采血时使用14号针头,动物保持标准的农业站立姿势进行固定。从针头插入到采血完成共耗时10–12分钟。血液采用CPD抗凝,比例为每86份血液加入14份CPD(CPD配方:26.3 g/L 柠檬酸钠、25.2 g 葡萄糖、3 g/L 柠檬酸和2.2 g/L 磷酸钠溶于去离子水[DI水]中)。血袋置于带冰袋的保温容器中隔夜运输,并在采血后24小时内用于实验。
4. 测试前准备步骤
注意:本节所述所有步骤均适用于第5和第6节。在使用牛血清白蛋白(BSA)或血液循环运行泵之前,请执行以下步骤。通过重力引流方式在容器之间转移血液,以尽量减少机械应力。避免使用注射器活塞推动血液,以免产生过高压力。此外,避免使血液通过狭窄开口节流,以防对细胞成分造成损伤。
5. 封闭血液接触表面
6. 血栓形成检测
7. 清洁程序
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成功实施本方案可识别出血小板沉积的局部区域,揭示泵体流路中的问题部位。持续应用该方案可通过解决这些已识别的“热点”问题,实现逐步改进。
例如,在开发 PediaFlow PF5 VAD 的过程中,由于部件尺寸微小,我们在手动抛光定子叶片压力面时遇到了挑战。体外血栓形成试验凸显了这一问题,因为血小板沉积始终出现在叶片根部,如图2A所示。随后在一项急性动物实验中也证实了类似的沉积模式,该实验将泵体外连接至绵羊循环系统并运行3小时(本论文未详细描述)。为解决此问题,我们采用电化学抛光技术,使这些钛合金部件表面达到镜面光洁度,从而成功消除了这些区域的血栓形成(图2B)。该泵随后被用于绵羊的为期7天的体内研究,结果同样显示无血栓形成。
我们在泵的原型中发现的另一个问题特征是前部和后部壳体组件之间的连接处。该连接处若对接不严密,可能形成缝隙,导致血液渗入并发生凝固,正如在
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首次人体试验新型泵具始终是一项高风险的尝试,因为临床前研究无法可靠预测心室辅助装置在人体内的血栓形成倾向26值得注意的是,一些在动物试验中表现出无血栓形成特性的VAD,在临床应用中 later 出现了显著的血栓形成倾向36一种侵袭性的 体外 专门设计用于诱发血栓形成的测试方案,为在研发早期识别潜在的设计或制造缺陷提供了宝贵机会。尽管该方案无法对未来情况做出确切预测 体内 通过评估VAD在促凝条件下的性能,这种主动方法可揭示可能出现的潜在血栓形成热点。
现有 体外 VAD血栓形成的研究方法在测试时长和抗凝策略上存在显著差异。Hastings等人使用高度肝素化的猪血进行了为期48小时的测试,成功复现了临床上在ECMO泵中观察到的血栓形成模式37相比之下,Schima 等人的开创性研究使用鱼精蛋白将肝素化血液的活化凝血时间(ACT)降低至其基线值的3倍作为实验起始点,并在ACT降至基线值的1....
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S.E.O. 目前担任 Magenta Medical 的顾问,曾担任 Boston Scientific 的顾问。其他作者均无相关财务披露或利益冲突需要报告。
本工作得到了美国国立卫生研究院资助项目R01HL089456以及美国陆军医学研究采购活动项目编号W81XWH2010387的支持。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 14 mL 试管 | Falcon | 352059 | 带 snap-cap 盖的圆底聚丙烯试管 |
| 单向止流阀 | Qosina | 99759 | 雌性鲁尔锁,带旋转锁的雄性鲁尔 |
| 三通旋塞阀 | Qosina | 99771 | 2 个雌性鲁尔锁接头,旋转式雄性鲁尔锁接头 |
| 用于Hemochron的ACT+比色皿 | Werfen | 000JACT+ | 45/盒 |
| 通用清洁剂/除油剂 | 简单绿 | 2710200613005 | 简易绿色清洁剂和去污剂。使用1%溶液。 |
| 带倒刺接头 | Qosina | 73311 | 材料:聚碳酸酯 ¼” x ¼” 直连器 |
| 带鲁尔锁的鱼骨型接头 | Qosina | 73316 | 材料:聚碳酸酯 ¼” x ¼” 带鲁尔锁的直型接头 |
| 牛血清白蛋白(BSA) | 赛默飞世尔科技化学品 | AAJ6465522 | 或同等产品 |
| 氯化钙,CaCl2 | 赛默飞世尔科技化学品 | AA89866-30 | 无水的, ≥96.0% ACS |
| 解剖显微镜(推荐) | Olympus | https://www.olympus-lifescience.com/zh/技术/博物馆/显微镜/1984/ | 奥林巴斯 SZH10(连续变倍放大倍数 7x - 70x)或类似型号 |
| 不含钙和镁的DPBS | Gibco | 14200075 | 杜氏磷酸盐缓冲液,不含钙、镁,10倍浓缩液(使用前需稀释至1倍浓度) |
| EDTA | 优质生物材料 | 351-027-721EA | 0.5 M,pH 7.0–8.0(乙二胺四乙酸) |
| 内窥镜/孔探仪/耳镜相机(可选) | Bebird | https://bebird.com/products/earsight-pro-耳垢清除器 | 3–4 mm 探头直径 |
| 酶活性粉状洗涤剂 | Alconox | 1304-1 | Alconox Tergazyme,使用1%溶液。 |
| 延伸线,30" | Qosina | 36218 | 30" 长度, 雌性鲁尔锁扣接头转雄性鲁尔锁扣接头 |
| 延伸线,6" | Qosina | 36212 | 6" 长度 雌性鲁尔锁扣接头转雄性鲁尔锁扣接头 |
| 雌性鲁尔锁,带倒刺 | Qosina | 11548 | 适配1/8英寸内径管路;材质:聚碳酸酯; |
| 流量计 | Transonic | https://www.transonic.com/t402-t403-consoles | Transonic TS410 模块 |
| 止血钳 | Fisherbrand | 13-820-004 | 尖端长度至少为5 cm的锁扣式止血钳 |
| 肝素钠 | 麦克森包装服务 | 949513 | 1000 U/mL 浓度 |
| 霍夫曼钳 | 洪堡 | H8720 | 细螺纹夹 |
| IV袋(合规性血袋) | Qosina | 51494 | 材料:PVC,2 个管路接口,0.258” ID。使用热封器对100 ml袋进行改造 |
| 无尘擦拭布 | Kimberly-Clark Professional | 34120 | Kimtech Science 擦拭巾 |
| 磁力搅拌器 | INTLLAB | MS-500 | 或类似情况 |
| 雄性鲁尔锁,带倒刺 | Qosina | 11549 | 适配1/8英寸内径管路;材质:聚碳酸酯; |
| 数字压力计 | Sper Scientific | 840081 | SPER-840081 或类似物 |
| 尼龙过滤网 | McMaster-Carr | 9318T21 | 100-μ米(0.0039"开口尺寸 |
| 绵羊血液 | Lampire | 7209004 | 经ACD 14:86抗凝的供体全血,隔夜运送 |
| 塑料袋热封机 | Uline | H-190 | Uline H-190 或类似型号(不带切割器) |
| 硅橡胶粘合剂 | Smooth-On | B00IRC1YI0 | Sil-Poxy 或类似产品 |
| 1 mL 带鲁尔锁接头的注射器 | Fisher Scientific | 14-955-646 | Fisherbrand 手动注射器(无针头),用于科研用途 |
| 带鲁尔锁的注射器,3 mL | Fisher Scientific | 14-955-457 | Fisherbrand 手动无针注射器,用于科研用途 |
| 带鲁尔锁的注射器,60 mL | Fisher Scientific | 14-955-461 | Fisherbrand 手动无针注射器,用于科研用途 |
| 输血滤器 | Haemonetics Corporation | SQ40S/SQ40NS | Haemonetics Corporation SQ40S Pall 血液输注过滤器 |
| TRIS缓冲盐水 | 赛默飞世尔科技化学品 | AAJ62938K2 | TBS 10倍浓缩液(使用前须稀释至1×),pH 7.4 |
| 导管 | Tygon | ADF00017 | Tygon ND-100-65 管道(医用级) |
| 超声波流量传感器 | Transonic | https://www.transonic.com/hqxl-flowsensors | 根据所用导管尺寸选择合适的流量传感器型号。ME6PXL 夹持式传感器适用于 3/8” OD 管。传感器由 Transonic 针对测试流体(例如,血液)进行校准 24℃和管路等级(例如 Tygon ND-100-65) |
| 超声波破碎仪(可选) | Branson Ultrasonics | CPX952238R | Branson CPX2800H 或类似型号 |
| VAD 系统 | PediaFlow | PF5 | 待测试的VAD系统;包括泵和控制器 |
| 全血凝血系统 | 沃芬 | https://www.werfen.com/na/zh/即时检测设备/ACT-机器-hemochron-signature-elite | Hemochron Signature Elite 或 Signature Jr |
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