利用 CRISPR-Cas9 对埃及伊蚊 Aedes aegypti 进行基因组编辑

摘要

本文介绍了一种利用CRISPR-Cas9技术通过胚胎显微注射对蚊子A. aegypti进行基因组编辑的详细实验方案。

摘要

成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）-Cas9 技术的出现彻底改变了基因工程领域，为包括非模式生物在内的多种物种实现精确基因组编辑打开了大门。在埃及伊蚊（Aedes aegypti）中，已利用该技术成功实现了基因功能缺失突变和 DNA 插入。本文详细描述了一种利用 CRISPR-Cas9 技术在埃及伊蚊（A. aegypti）中通过胚胎显微注射进行基因组编辑的实验方案，重点聚焦于基因敲除和基因敲入品系的建立。在本方案中，石英玻璃针头被注入包含向导 RNA、重组 Cas9 蛋白以及一段编码荧光标记基因的 DNA 片段的质粒（如需实现基因敲入）的混合物。将处于囊胚前阶段的胚胎排列在载玻片上双面胶带的一条带上，随后将盖玻片固定于载玻片上。借助显微注射仪，将针头轻柔地插入胚胎后端，并注入少量 CRISPR 混合物。胚胎孵化后，幼虫在荧光显微镜下进行检测，蛹期个体按性别分选并置于不同饲养笼中。成虫羽化后，将其与野生型个体进行正反交配，饲血后用于产卵。待所产卵孵化后，收集到的荧光阳性幼虫即为 DNA 片段稳定整合至基因组中的个体。这些幼虫继续培养至成虫阶段，再次与野生型个体杂交，并通过分子生物学技术进一步验证 DNA 片段是否精确插入蚊子基因组的预期位点。通过所提供的杂交策略和分子筛选流程，还可获得纯合品系。

引言

随着CRISPR-Cas分子剪刀技术的建立，精确的基因组编辑已变得不仅可行，而且更为简便¹。这些技术利用了原核生物免疫系统用于抵御噬菌体感染的一种机制²。在这些系统中，成簇规律间隔的短回文重复序列（CRISPR）与Cas9核酸酶通常依赖于20个碱基对长度的RNA，即向导RNA（gRNA），其序列与靶向DNA同源，并紧随一个NGG型原间隔序列邻近基序（PAM）序列³。gRNA与Cas9结合后，可将核酸酶精确引导至基因组中的特定靶位点，从而引发DNA双链断裂³。

DNA双链断裂会诱导修复机制来修补双螺旋结构⁴。尽管所有DNA修复通常都应精确进行，但也存在一些准确性较低的DNA修复机制，可能留下序列疤痕，进而导致功能缺失突变⁴。在这些易错的DNA修复机制中，非同源末端连接（Non-Homologous End-Joining, NHEJ）可引起移码突变，包括小片段缺失、插入以及核苷酸改变（SNPs），从而导致功能缺失突变。而同源定向修复（Homology Directed Repair, HDR）机制则依赖同源染色体作为模板，复制未受损等位基因的精确序列，实现对靶向DNA序列的完美修复

方案

本方案所用仪器和试剂的详细信息列于材料表中。所有动物实验均按照美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）推荐的《实验动物护理与使用指南》进行操作。实验程序已获得加州大学圣地亚哥分校（UCSD）机构动物护理与使用委员会（IACUC，动物使用协议编号 #S17187）和加州大学圣地亚哥分校生物使用授权（BUA #R2401）的批准。

1. gRNA 与供体质粒设计

1. 构建基因敲除突变体时，设计两个间隔约 20–100 bp 的 gRNA（图 1A）。
   1. 使用在线工具（如 CHOPCHOP（ https://chopchop.cbu.uib.no/）¹⁷、Benchling（benchling.com）或 CRISPOR（http://crispor.gi.ucsc.edu/）¹⁸）设计长度为 20 bp 的 CRISPR-Cas9 gRNA，注意排除 PAM 序列（NGG）（图 1A）。根据在线工具的建议，选择特异性最高且脱靶风险最低的 gRNA 用于实验。
   2. 确保在两个 gRN....

结果

gRNA介导的HDR同源重组基因靶向设计与验证
为确保准确靶向目标基因，我们建议选择若干gRNA，并将5'和3'同源臂定位在HDR介导的同源重组切割位点附近（图1A）。例如，我们设计了两个gRNA，分别靶向目的基因起始密码子的两侧，并使用QF2-Hsp70-OpIE2-ECFP-SV40片段作为标记，通过HDR机制利用1 kb的同源臂将其插入目标基因中（图1B）。双链断裂将导致gRNA切割位点之间的短DNA片段被删除（图1A）。

通过检测gRNAs对目标基因的切割效率及其切割能力来验证 体外 Cas9 切割实验。来自靶基因的 PCR 片段被装载了 gRNA 的 Cas9 切割成两个片段（

讨论

CRISPR-Cas 技术通过促进染色体上特定位点的靶向改变，彻底改变了基因组编辑的格局¹。尽管转座元件在首批转基因蚊子的构建中发挥了关键作用，但其插入位点具有一定的随机性，且由于基因组位置效应（即插入位点）的影响，所携带构建体（启动子 + 基因）的表达模式可能与目标基因的实际表达谱不一致，通常会导致异位表达²¹。在 CRISPR-Cas9 分子剪刀技术出现之前，已有技术通过特定蛋白结构域与 FokI 限制性内切酶融合，利用这些结构域的 DNA 结合特性，在特定位点诱导 DNA 双链断裂，例如 TALEN²² 和锌指核酸酶（Zinc Finger）²³。尽管后者已成功应用于蚊子的遗传改造^24,25，但由于设计此类结构域成本高昂，且存在脱靶切割的风险，这类技术已逐渐被淘汰。自此以后，CRISPR-Cas9 技术已成为首选的分子剪刀工具.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10x Cas9 反应缓冲液	PNA Bio	CB01
Benchling 软件	Benchling	N/A	www.benchling.com
Cas9 稀释缓冲液	PNA Bio	CB03
Cas9 蛋白	PNA Bio	CP01-50
DH5α E. coli 感受态细胞	New England Biolabs	C2987
双面胶带	Scotch Permanent	3136
果蝇培养管	Genesee Scientific	32-109
滤纸	GE Healthcare Life Science	1450-042
鱼食	Tetra	B00025Z6YI	金鱼薄片饲料
果蝇培养瓶	Genesee Scientific	AS273
荧光显微镜	Leica Microsystems	M165 FC
基因片段	Integrated DNA Technologies	N/A
gRNA	Synthego	N/A
卤代烃油 700	Sigma-Aldrich	H8898
显微注射显微镜	Leica Microsystems	DM2000
JM109  E. coli 感受态细胞	Zymo Research	T3005
显微注射仪	Eppendorf		FemtoJet 4x
填充 Femtotips 用 Microloader 吸头	Eppendorf	E5242956003
显微操作器	Eppendorf		TransferMan 4r
微量移液器拉制仪	Sutter Instrument	P-2000
显微镜盖玻片	Fisherbrand	12-542-B
显微镜载玻片	Eisco	12-550-A3
小鼠血液（用于喂食的活体小鼠）	加州大学	IACUC，动物使用方案 #S17187	用于蚊虫血液喂养；详细信息符合动物伦理协议
NEB Q5 高保真 DNA 聚合酶	New England Biolabs	M0491S
PCR 纯化试剂盒	Qiagen	28004
质粒小提试剂盒	Zymo Research	D4036
石英丝	Sutter Instruments	QF100-70-10
体外转录纯化试剂盒	Fisher Scientific	AM1908
超纯水	Life Technologies	10977-023