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方法文章

利用 CRISPR-Cas9 对埃及伊蚊 Aedes aegypti 进行基因组编辑

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DOI：

10.3791/67732

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2025年3月21日

 ,  ,  ,  , 
1School of Biological Sciences, Section of Cell and Developmental Biology, University of California, San Diego, 2School of Biological Sciences, Department of Ecology, Behavior, and Evolution, University of California, San Diego

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种利用CRISPR-Cas9技术通过胚胎显微注射对蚊子A. aegypti进行基因组编辑的详细实验方案。

摘要

成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）-Cas9 技术的出现彻底改变了基因工程领域，为包括非模式生物在内的多种物种实现精确基因组编辑打开了大门。在埃及伊蚊（Aedes aegypti）中，已利用该技术成功实现了基因功能缺失突变和 DNA 插入。本文详细描述了一种利用 CRISPR-Cas9 技术在埃及伊蚊（A. aegypti）中通过胚胎显微注射进行基因组编辑的实验方案，重点聚焦于基因敲除和基因敲入品系的建立。在本方案中，石英玻璃针头被注入包含向导 RNA、重组 Cas9 蛋白以及一段编码荧光标记基因的 DNA 片段的质粒（如需实现基因敲入）的混合物。将处于囊胚前阶段的胚胎排列在载玻片上双面胶带的一条带上，随后将盖玻片固定于载玻片上。借助显微注射仪，将针头轻柔地插入胚胎后端，并注入少量 CRISPR 混合物。胚胎孵化后，幼虫在荧光显微镜下进行检测，蛹期个体按性别分选并置于不同饲养笼中。成虫羽化后，将其与野生型个体进行正反交配，饲血后用于产卵。待所产卵孵化后，收集到的荧光阳性幼虫即为 DNA 片段稳定整合至基因组中的个体。这些幼虫继续培养至成虫阶段，再次与野生型个体杂交，并通过分子生物学技术进一步验证 DNA 片段是否精确插入蚊子基因组的预期位点。通过所提供的杂交策略和分子筛选流程，还可获得纯合品系。

引言

随着CRISPR-Cas分子剪刀技术的建立，精确的基因组编辑已变得不仅可行，而且更为简便1。这些技术利用了原核生物免疫系统用于抵御噬菌体感染的一种机制2。在这些系统中，成簇规律间隔的短回文重复序列（CRISPR）与Cas9核酸酶通常依赖于20个碱基对长度的RNA，即向导RNA（gRNA），其序列与靶向DNA同源，并紧随一个NGG型原间隔序列邻近基序（PAM）序列3。gRNA与Cas9结合后，可将核酸酶精确引导至基因组中的特定靶位点，从而引发DNA双链断裂3。

DNA双链断裂会诱导修复机制来修补双螺旋结构4。尽管所有DNA修复通常都应精确进行，但也存在一些准确性较低的DNA修复机制，可能留下序列疤痕，进而导致功能缺失突变4。在这些易错的DNA修复机制中，非同源末端连接（Non-Homologous End-Joining, NHEJ）可引起移码突变，包括小片段缺失、插入以及核苷酸改变（SNPs），从而导致功能缺失突变。而同源定向修复（Homology Directed Repair, HDR）机制则依赖同源染色体作为模板，复制未受损等位基因的精确序列，实现对靶向DNA序列的完美修复4。

基于这一原理，CRISPR-Cas9 技术已被开发用于精确编辑基因组，理论上可在任何包含 PAM 位点的序列上进行编辑3。在蚊子中，通过向胚胎显微注射 Cas9 与 gRNA 的混合物，利用非同源末端连接（NHEJ）修复机制，CRISPR-Cas9 技术已被用于敲除多种基因5,6。类似地，将 gRNA 与 Cas9 的混合物注射到成年雌蚊的血淋巴中，也可实现生殖系突变7。该技术被称为 ReMOT 控制（ReMOT Control），其依赖于一种经过改造的 Cas9 蛋白，该蛋白被添加了一段肽标签，可在卵黄发生（vitellogenesis）过程中通过内吞作用被卵巢摄取7。将特定基因表达盒插入基因组的操作仅能通过胚胎显微注射实现，即共注射 gRNA 与 Cas9（或表达这些分子的质粒）以及携带目标 DNA 表达盒的质粒8。利用同源定向修复（HDR）机制，将含有目标 DNA 表达盒的质粒作为修复模板，该表达盒两侧带有同源序列（上游和下游各 500–1,000 bp）9,10，用于修复双链断裂，并将 DNA 表达盒一并复制到目标序列中9。

CRISPR-Cas9 技术已被用于敲除蚊子中主要参与感觉系统的多个基因 埃及伊蚊11，还包含与雄性生育力和雌性存活率相关的基因（PgSIT），用于种群控制12通过将编码荧光标记物的基因敲入特定基因的编码序列，也已实现对目标基因的敲除。13,14该策略的优势不仅在于能够诱导移码突变，还可利用荧光信号对新敲除品系的个体进行分选。13,14。该 埃及伊蚊 基因组还使用了二元表达系统（如 Q 系统（QF-QUAS））的序列进行编辑11将编码QF转录激活因子的基因敲入特定基因启动子的下游，可确保该转录激活因子具有明确的时空表达模式15,16一旦表达QF的蚊子品系与另一个含有QF结合位点（QUAS）的蚊子品系杂交，QF便会结合到QUAS序列上，并启动位于QUAS序列下游的基因表达。15,16该系统总体上可实现效应基因在特定组织和特定时间的表达，这些效应基因可以是用于细胞定位或神经元活性检测的荧光标记，也可以是用于在特定组织中敲除基因的Cas9核酸酶（即体细胞敲除）。11.

鉴于目前已有大量关于埃及伊蚊（A. aegypti）遗传转化的信息，本文提供了一套详细的实验方案，逐步指导如何通过胚胎显微注射利用CRISPR-Cas9系统进行基因组编辑。文中讨论了通过非同源末端连接（NHEJ）介导的移码突变和缺失实现基因敲除，以及通过同源定向修复（HDR）介导的基因盒插入构建基因敲入品系的策略。

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方案

本方案所用仪器和试剂的详细信息列于材料表中。所有动物实验均按照美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）推荐的《实验动物护理与使用指南》进行操作。实验程序已获得加州大学圣地亚哥分校（UCSD）机构动物护理与使用委员会（IACUC，动物使用协议编号 #S17187）和加州大学圣地亚哥分校生物使用授权（BUA #R2401）的批准。

1. gRNA 与供体质粒设计

  1. 构建基因敲除突变体时，设计两个间隔约 20–100 bp 的 gRNA（图 1A）。
    1. 使用在线工具（如 CHOPCHOP（ https://chopchop.cbu.uib.no/）17、Benchling（benchling.com）或 CRISPOR（http://crispor.gi.ucsc.edu/）18）设计长度为 20 bp 的 CRISPR-Cas9 gRNA，注意排除 PAM 序列（NGG）（图 1A）。根据在线工具的建议，选择特异性最高且脱靶风险最低的 gRNA 用于实验。
    2. 确保在两个 gRNA 切割位点之间的序列中包含一个高效的限制性内切酶识别位点（图 1A）。在 gRNA 切割位点之间引入一个限制性内切酶位点，以便快速通过凝胶电泳直观确认编辑是否成功。
      注意：当发生缺失时，该限制性酶切位点会被删除，因此酶无法切割该序列，在凝胶上将出现单一未切割条带，从而确认缺失成功。
  2. 对于通过 HDR 介导的基因盒插入，使用上述用于构建基因敲除突变体的工具设计多个 gRNA，并在后续评估后选择最有效的 gRNA。
  3. 设计用于同源定向修复（HDR）的供体质粒，包含靶位点上下游同源臂、目的 DNA 序列（cargo DNA）、荧光标记基因、复制起点以及抗生素抗性基因（图 1B）。
    1. 从靶位点的上游和下游区域选择同源臂，每段长度为 500–1,000 bp10（图 1B）。
    2. 选择目的序列（cargo sequence），可包括荧光标记基因、目的基因或调控元件（例如 QF2）。
    3. 选择荧光标记基因。常用于埃及伊蚊（A. aegypti）的荧光标记通常包含在一个 DNA 盒中，该盒包括启动子、编码荧光蛋白的基因以及 3' UTR 序列。详见讨论部分。

2. 注射混合液的制备

  1. 用Cas9稀释缓冲液将Cas9蛋白稀释至1 µg/µL。
    注意：Cas9 蛋白冻融次数不得超过两次。建议将 Cas9 蛋白分装成小份保存。
  2. 购买gRNA或在实验室内部制备。
    注意：对于内部生产，应采用标准的RNA去污染操作和无RNase的材料。
    1. 设计4-6个gRNA，并选择其中最佳的两个用于显微注射（参见 体外 切割实验如下所述）。
    2. 设计一条正向引物，在gRNA序列的上游包含T7启动子序列。在非模板PCR反应中使用通用gRNA反向引物，如下所述。重叠序列与通用反向引物中的对应序列（加粗并带下划线）碱基配对，从而为DNA聚合酶提供模板以扩增其序列。
      注意：在这些PCR反应中，上游引物应包含T7启动子（加粗），其后是两个鸟嘌呤（对T7 RNA聚合酶介导的转录起始至关重要），接着是gRNA的20个核苷酸序列（N20；不含PAM序列），以及引物重叠序列（下划线标出）。
      引物 正向: 5'- GAAATTAATACGACTCACTATAGGN20 GTTTTAGAGCTAGAAATAGC- 3'
      引物 反转：5''-AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTT CAAGTTGATAACGGACTAGC
      CTTATT TTAACTT GCTATTTCTAGCTCTAAAAC - 3'
    3. 通过非模板PCR合成DNA模板。设置多个反应（每个反应包含12.5 µL的2x预混液、1.25 µL的10 µM正向引物溶液、1.25 µL的10 µM反向引物溶液以及10 µL超纯水），以确保获得足够的PCR产物（300 ng）用于后续实验 体外 转录反应。采用以下PCR条件：98 °C预变性30 s；35个循环的扩增反应，包括98 °C变性10 s、62 °C退火10 s、72 °C延伸10 s；72 °C终延伸2 min；4 °C保存。
    4. 在2%琼脂糖凝胶上确认单一DNA片段（122个碱基对）的扩增。
    5. 使用PCR纯化试剂盒，按照制造商的建议纯化PCR模板。
    6. 执行 体外 使用T7转录试剂盒进行转录反应。将2 µL 10×反应缓冲液、每种核苷酸（ATP、CTP、UTP和GTP）各2 µL、2 µL T7 RNA聚合酶、3 µL模板DNA（100 ng/µL）以及5 µL超纯水混合。在37 °C孵育混合物至少2小时（不超过16小时），或过夜（12小时）。
      注意：在此反应中，T7 RNA 聚合酶结合引物正向序列中包含的 T7 启动子，从而启动 gRNA 的转录。 
    7. 加入1 µL DNase处理转录反应（充分混匀），37 °C孵育 15分钟。
    8. 使用转录纯化试剂盒，按照制造商的说明纯化合成的sgRNA。
    9. 执行 体外 切割效率检测实验，用于评估所选gRNAs的切割效率（图1C).
      1. 设计引物以扩增gRNA切割位点侧翼的DNA片段（500-1,000 bp）。
      2. PCR反应体系设置如下：12.5 µL 2x 超纯混合液，1.25 µL 10 µM 正向引物溶液，1.25 µL 10 µM 反向引物溶液，9 µL 超纯水，以及 1 µL 5 ng/µL 模板DNA。
      3. 使用以下PCR反应条件：98 °C预变性30 s；35个循环的扩增反应，包括98 °C变性10 s，X °C退火15-30 s（引物的最佳退火温度），72 °C延伸35 s；72 °C最终延伸2 min；最后于4 °C长期保存。
      4. 参考生产商提供的指南，选择最佳扩增温度和时间。至少合并五个反应，或按比例增加试剂体积，以确保在PCR产物纯化（单一条带）或琼脂糖凝胶PCR条带回收后，获得足够量的PCR产物（1.5–2 µg）。
      5. 将以下混合物在37 °C孵育1小时，以重组Cas9进行Cas9切割反应：1 µL 10x Cas9反应缓冲液、0.35 µL重组Cas9（1 µg/µL）、1 µL gRNA（100 ng/µL）、6.65 µL超纯水和1 µL 300 ng/µL模板DNA。
      6. 设置一个不含任何gRNA的阴性对照反应。
      7. 通过琼脂糖凝胶（1.5-2.0%）电泳检测切割效率 图1C).

3. 构建供体质粒

  1. 从埃及伊蚊（A. aegypti）的基因组DNA中PCR扩增同源臂。
    1. 引物设计时，请参考克隆试剂盒制造商的指南。可使用在线工具（例如Benchling），该工具支持使用不同的克隆策略（如Gibson、Golden Gate和基于限制性内切酶的克隆）进行质粒设计与组装。
    2. 从埃及伊蚊（A. aegypti）基因组DNA中扩增目的片段，或订购商业合成的基因片段。
    3. 从实验室自有的质粒中扩增荧光标记序列。
  2. 通过Gibson组装法将步骤3.1.1至3.1.3获得的DNA片段连接到现有质粒骨架中。在50 °C孵育1小时，反应体系为：10 µL 2×主混合液、X µL所有DNA片段、10-X µL超纯水。
    注：请参考制造商指南，计算插入片段与质粒骨架的最佳摩尔比。
    1. 计算每个克隆片段的浓度（单位为皮摩尔）：pmols = (质量/ng) × 1,000 / (碱基对 × 650 道尔顿)。
    2. 使用50–100 ng质粒骨架，并为每个插入片段提供2–3倍的摩尔过量。
    3. 若组装2–3个片段，每个片段加入0.02–0.5 pmols；若组装4–6个片段，每个片段加入0.2–1.0 pmols。
  3. 取3–5 µL Gibson组装反应产物转化大肠杆菌（E. coli）感受态细胞JM109。
    注：选择JM109用于Gibson组装，因其具有recA-基因型，可减少不必要的重组事件，并防止细胞收获过程中核酸酶残留，从而保证组装后DNA片段的完整性。
    ​对于大于10 kb的质粒，建议按照制造商推荐方案，采用延长程序转化DH5α感受态细胞。
  4. 扩增转化后的细菌，并使用质粒小提试剂盒纯化质粒。
  5. 为验证质粒是否正确组装，使用纯化的质粒DNA进行诊断性限制性内切酶消化，并通过琼脂糖凝胶电泳观察结果（图1D、E）。
    注：建议使用在线工具筛选若干能在质粒上单次切割的限制性内切酶。Benchling等软件内置虚拟消化工具，可模拟所选限制性内切酶对质粒序列的消化过程，并显示虚拟电泳凝胶上的预期DNA条带模式（图1D）。
    1. 进行质粒限制性内切酶消化反应。在37 °C孵育2小时，反应体系为：1 µL 10×消化缓冲液、0.5 µL限制性内切酶1、0.5 µL限制性内切酶2、1 µL质粒DNA（300 ng/mL）、7 µL超纯水。
    2. 将消化反应产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳。
      注：DNA条带模式（图1E）应与虚拟消化预测的条带模式（图1D）相似。如有条件，也可将质粒送测全质粒序列。
  6. 将质粒克隆接种于150 mL LB培养基中进行培养。
  7. 按照制造商说明书进行质粒大提（maxiprep）。
  8. 将质粒溶于超纯水中。

4. 混合注射构建体

注意：每种构建体的建议终浓度范围见表1。起始转染比例建议为2:1:2（Cas9 质粒: sgRNA 质粒: 供体质粒，单位为ng），可根据需要进行调整以优化同源定向修复（HDR）效率。通过监测结果可确定最有效的组合方案。

  1. 构建基因敲除突变体时，
    1. 使用Cas9稀释缓冲液将Cas9蛋白分装液稀释至所需浓度，并用超纯水稀释gRNA分装液。
    2. 将Cas9蛋白与每条gRNA预先混合，形成核糖核蛋白（RNP）复合物，然后将预混溶液合并。
  2. 进行HDR介导的基因盒插入时，
    1. 按照构建基因敲除突变体的建议方法稀释并混合Cas9蛋白和gRNA。
    2. 用超纯水稀释供体质粒。
    3. 合并所有构建物。

5. 拉制与装载显微注射针

  1. 使用石英丝来拉制注射针（图2）。确保石英丝长度为10 cm，外径为1 mm，内径为0.7 mm。
  2. 使用激光微电极拉制仪，采用以下两个程序之一来拉制针头：
    程序1：加热805，灯丝4，速度50，延迟145，拉力145
    程序2：加热650，灯丝4，速度40，延迟150，拉力156
    注意：程序1产生更细但更长的针尖，适用于低浓度构建物的注射，因为更精细的针尖有助于提高注射精度。程序2产生更短但更粗的针尖，适用于高浓度构建物的注射，因为高浓度构建物黏度更高，需要更坚固的针头。

6. 胚胎采集

  1. 准备电动或手动吸蚊器用于收集蚊子，并使用塑料小瓶进行收集和胚胎采集。
  2. 将白色圆形滤纸润湿后贴在收集器内壁或湿润棉絮表面。
  3. 将5-10只5-10天前已饲血的雌蚊放入收集器中，将收集器置于黑暗环境中45分钟。
  4. 取出滤纸进行胚胎采集。

7. 胚胎排列

  1. 使用野生型菌株（Liverpool） A. aegypti 用于胚胎注射。
  2. 从收集纸上挑选处于前囊胚期的胚胎，尤其是颜色呈浅灰色的胚胎图3).
  3. 用湿润的刷子将少量胚胎转移至盖玻片上方的双面胶带上。在周围环境仍保持湿润时，将胚胎并排排列成平行，确保所有胚胎的后端朝向一致。
  4. 正确放置后，让环境略微干燥，以固定胚胎的位置。
  5. 在胚胎排列过程中加入 Halocarbon oil 700 以防止干燥。
    注意：添加油时，应确保胚胎周围无水分，否则胚胎会在油中漂浮。

8. 胚胎显微注射

注意：注射在室温或 18 °C 下进行。建议采用 18 °C，因为该温度可延缓胚胎发育，具有实际操作优势。

  1. 使用以下参数设置显微注射仪：补偿压力（Pc）300 hPa，注射压力（Pi）500 hPa。根据需要随时调整这些条件。
  2. 使用微量移液吸头将3 µL混合构建物装入注射针中。
  3. 将排列好胚胎的盖玻片放置在显微镜载玻片上（图3）。将盖玻片和载玻片置于显微镜下进行注射。确保胚胎的后端朝向注射针。
  4. 将一根注射针安装到针夹持器中，并与显微操作器连接，将针尖以10°角对准排列好的胚胎后端，并保持固定（图4A）。在显微镜下轻轻打开注射针，并用盖玻片边缘轻触针尖。
    注意：另一种方法是通过轻敲胚胎在针尖上制造一个小孔。但建议针孔稍宽一些，因为Cas9蛋白具有黏性，容易堵塞针头。
  5. 移动载玻片使其靠近注射针，准备注射（图5）。

9. 显微注射后胚胎的护理

  1. 使用无尘一次性擦拭纸清除胚胎周围的油。
  2. 加入去离子水冲洗胚胎，并将胚胎转移至湿润的滤纸上。将湿润的滤纸置于Karat 9 oz杯内的湿纸巾上（图4B 和 图6A、B）。
  3. 在杯子底部放置湿润的棉絮以保持湿度（图6B）。
  4. 将注射后的胚胎保存在湿润的滤纸上。

10. 胚胎孵化与G0代幼虫筛选

  1. 注射后至少4天，将带有胚胎的滤纸转移至约3升去离子水中，使用Sterilite 6夸脱托盘进行孵化。
    注意：卵通常在注射后两周内孵化效率较高。在此期间应确保卵保持湿润，但滤纸不宜过湿，因为过多水分可能导致胚胎过早孵化。虽然较长时间保存可能提高孵化率，但为获得最佳效果，不应超过一个月。使用脱氧水也可能有助于孵化。
  2. 一旦G0代幼虫孵化，向托盘中加入与水混合的鱼食作为食物。
  3. 在第3至第4龄幼虫阶段对G0代幼虫进行荧光标记筛选（图7）。
  4. 根据幼虫的荧光状态分别饲养，将荧光阳性与荧光阴性的幼虫置于不同的托盘中。

11. 蛹的性别分选及与野生型杂交

  1. 当蚊子化蛹时，根据体型和生殖叶的性别特异性结构按性别分离：
    1. 雄性：体型较小，生殖叶更突出且尖锐，尾部桨状结构（蛹尾端的结构）较宽（图8A1，A2）。
    2. 雌性：体型较大，生殖叶较小且不明显，桨状结构较窄（图8B1，B2）。
  2. 将每种性别的荧光阳性或荧光阴性蚊子分别混合。
  3. 将混合后的蚊子与来自利物浦品系的相反性别的蚊子进行杂交。使用野生型与G0代蚊子比例为3:1至5:1。
  4. 让蚊子交配4天。
  5. 交配后为雌蚊提供血餐。

12. G1 期筛选

  1. 吸血后三天，在Karat 9盎司杯的杯壁内侧放置一张纸巾，并加入约3盎司去离子水，提供产卵杯。
  2. 3至4天后，收集并孵化G1代胚胎。在3龄至4龄幼虫阶段筛选带有荧光标记的G1幼虫（图7）。
  3. 收集带有荧光的幼虫，提示发生了HDR插入。当荧光G1个体发育至蛹期时，按性别分离，并将不同性别的个体分别放入不同的笼子中。
  4. 将带有荧光的G1蚊子与利物浦品系的异性个体进行杂交。

13. G1 插入位点确认

  1. 提供血液餐后，通过在单个 Drosophila 试管中放入一小片纸巾并加入 3 mL 去离子水，设置 G1 代雌蝇进行单雌产卵。
  2. 对于基因敲除突变体：
    1. 产卵后，水分蒸发，纸巾变干，孵化出明显表现出基因敲除突变的雌蝇所产的卵，获得 G2 代。
    2. 收集成功孵化出 G2 后代的 G1 代母体虫体，并提取 DNA。
    3. 以该 DNA 为模板进行 PCR 扩增，扩增覆盖靶位点的序列。确保引物扩增出约 200 bp 的 DNA 片段。设置反应体系（每反应包含 12.5 µL 的 2x 混合液、1.25 µL 的 10 µM 正向引物溶液、1.25 µL 的 10 µM 反向引物溶液、9 µL 超纯水和 1 µL 模板 DNA [5 ng/µL]）。采用以下 PCR 条件：98 °C 预变性 30 s；35 个循环的扩增反应，包括 98 °C 变性 10 s、X °C 退火 15–30 s（引物的最佳退火温度）和 72 °C 延伸 10 s；72 °C 最终延伸 2 min；最后在 4 °C 长期保存。
    4. 纯化 PCR 片段，并通过将以下混合物在 37 °C 孵育 30 min 进行限制性内切酶消化：1 µL 的 10x 限制性消化缓冲液、0.5 µL 限制性内切酶 1、0.5 µL 限制性内切酶 2、1 µL PCR 片段（200 ng/mL）和 7 µL 超纯水。
      注：某些限制性内切酶可在无需预先纯化的情况下直接用于 PCR 产物中。
    5. 通过凝胶电泳观察 PCR 片段的酶切情况，以确认是否发生切割。
    6. 对未酶切的 PCR 片段进行测序，以鉴定基因敲除突变。
    7. 对于 HDR 介导的插入，在产卵后：
      1. 收集 G1 代母体虫体并提取 DNA。
      2. 以 DNA 为模板进行 PCR 扩增，扩增覆盖靶位点的序列。
      3. 对扩增的 DNA 片段进行测序，以确认插入 DNA 窨盒的完整性。
      4. 孵化卵并获得 G2 代。

14. 扩增新的 CRISPR 细胞系

  1. 对于基因敲除突变品系：
    1. 设置G2代雌蚊进行产卵，每只G1代雌蚊对应20只G2代雌蚊。每个G1代个体代表一个品系。
    2. 产卵后，以与G1代相同的方法确认基因敲除突变。
    3. 选择在G1和G2代中均明确鉴定出突变的五个品系进行后续实验。孵化每个品系G2代雌蚊所产的卵，获得G3代。
    4. 从五个回交品系中，选择两个突变明确且适合度高或具有目标表型的品系。
    5. 将每个选定品系的G3代雌蚊与利物浦品系的雄蚊进行回交。
    6. 从每个品系中分别设置50只单只雌蚊进行产卵，并以前述G1代相同的方法确认基因敲除突变。
      注意：增加设置中雌蚊的数量以维持遗传多样性。
    7. 对这两个品系再连续进行两代相同的实验操作（图4J）。
  2. 对于新的HDR介导的插入品系：
    1. 验证G2代中是否存在荧光个体。
    2. 将每个G1代个体来源的G2代蚊虫与利物浦品系进行回交。每个G1代个体代表一个品系。
    3. 继续进行三代的回交操作。持续检测荧光标记，并观察每个品系的适合度19（图4x）。
    4. 选择一个插入正确、适合度高且具有目标表型的品系。

15. 建立纯合品系

  1. 对于基因敲除突变品系：
    1. 第6代（G6）：
      1. 孵化G5代产生的卵，获得G6代个体。
      2. 在各自品系内对G6代成虫进行互交（图4K 和 图9A）。
      3. 每品系设置50只单独的G6代雌蚊产卵，并按前述方法孵化卵（图9B）。
      4. 收集成功孵化出G7代后代的G6代雌蚊，提取DNA，并进行PCR扩增及限制性内切酶消化，操作方式与G1代相同（图9C）。
        注意：此步骤可使用一种简单且低成本的裂解缓冲液（SB）进行DNA提取。
        1. 使用手持研磨器将一只蚊虫在100 µL 1x SB缓冲液（10 mM Tris-HCl pH 8，1 mM EDTA，25 mM NaCl）中匀浆。加入蛋白酶K（终浓度200 µg/mL），37 °C孵育30分钟，随后95 °C处理2分钟。以10,000 × g离心5分钟，收集上清液20。
      5. 通过琼脂糖凝胶电泳观察结果，确认突变。
      6. 丢弃未携带突变的雌蚊所产的卵（图9D）。
      7. 保留经确认携带突变的雌蚊的幼虫，建立多个G7代品系，丢弃无突变的子代群体（图9D）。
    2. 第7代（G7）：
      1. 在每个G7代品系内进行雌雄个体互交（图9E）。
      2. 每品系设置10只单独的G7代雌蚊产卵，并按前述方法孵化卵（图9F）。
      3. 收集成功孵化出G7代后代的G7代雌蚊，提取DNA，并进行PCR扩增及限制性内切酶消化（图9G）。
      4. 通过琼脂糖凝胶电泳观察结果，检测两个等位基因或单个等位基因上的敲除突变。
      5. 保留经确认在两个等位基因上均存在敲除突变的G7代雌蚊的幼虫，以产生G8代个体（图9H）；丢弃无突变的子代群体（图9H）。
        注意：此步骤可确保雌蚊为纯合子。在G8代中检测子代的纯合性，可进一步确认父本是否也为纯合子。"
    3. 第8代（G8）：
      1. 按每个G7代雌蚊来源的品系分别对G8代成虫进行交配（图9I）。
      2. 随机选取五只G8代雄蚊，提取DNA，并进行PCR扩增及限制性内切酶消化（图9J）。
      3. 为与已确认在两个等位基因上均存在敲除突变的G8代雄蚊交配过的G8代雌蚊提供血液餐，并孵化其产下的卵。
      4. 继续保留所有被检测的雄蚊均在两个等位基因上携带敲除突变的G7代品系，表明这些品系已达到纯合状态。
  2. 对于HDR介导的插入品系：
    1. 孵化G5代产生的卵，获得G6代个体。在G6代幼虫阶段筛选荧光标记。
    2. 丢弃无荧光标记的幼虫（图4xi）。
    3. 对表现出荧光标记的蚊虫进行互交。
    4. 在后续每一代中重复此流程，直至不再观察到无荧光的幼虫。此时，该蚊虫品系即为纯合子。

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结果

gRNA介导的HDR同源重组基因靶向设计与验证
为确保准确靶向目标基因，我们建议选择若干gRNA，并将5'和3'同源臂定位在HDR介导的同源重组切割位点附近（图1A）。例如，我们设计了两个gRNA，分别靶向目的基因起始密码子的两侧，并使用QF2-Hsp70-OpIE2-ECFP-SV40片段作为标记，通过HDR机制利用1 kb的同源臂将其插入目标基因中（图1B）。双链断裂将导致gRNA切割位点之间的短DNA片段被删除（图1A）。

通过检测gRNAs对目标基因的切割效率及其切割能力来验证 体外 Cas9 切割实验。来自靶基因的 PCR 片段被装载了 gRNA 的 Cas9 切割成两个片段（

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讨论

CRISPR-Cas 技术通过促进染色体上特定位点的靶向改变，彻底改变了基因组编辑的格局1。尽管转座元件在首批转基因蚊子的构建中发挥了关键作用，但其插入位点具有一定的随机性，且由于基因组位置效应（即插入位点）的影响，所携带构建体（启动子 + 基因）的表达模式可能与目标基因的实际表达谱不一致，通常会导致异位表达21。在 CRISPR-Cas9 分子剪刀技术出现之前，已有技术通过特定蛋白结构域与 FokI 限制性内切酶融合，利用这些结构域的 DNA 结合特性，在特定位点诱导 DNA 双链断裂，例如 TALEN22 和锌指核酸酶（Zinc Finger）23。尽管后者已成功应用于蚊子的遗传改造24,25，但由于设计此类结构域成本高昂，且存在脱靶切割的风险，这类技术已逐渐被淘汰。自此以后，CRISPR-Cas9 技术已成为首选的分子剪刀工具...

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披露

O.S.A. 是 Agragene, Inc. 和 Synvect, Inc. 的创始人，持有股权利益。此安排的条款已根据加州大学圣地亚哥分校的利益冲突政策进行审查并获得批准。其余作者声明不存在竞争利益。

致谢

作者感谢Judy Ishikawa和Ava Stevenson在蚊虫饲养方面提供的帮助。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目（R01AI151004、RO1AI148300、RO1AI175152）支持，上述项目授予O.S.A.；此外，N.H.R. 获得K22AI166268资助。图示使用 BioRender绘制。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10x Cas9 反应缓冲液PNA Bio CB01
Benchling 软件BenchlingN/Awww.benchling.com
Cas9 稀释缓冲液PNA Bio CB03
Cas9 蛋白PNA Bio CP01-50
DH5α E. coli 感受态细胞New England BiolabsC2987
双面胶带Scotch Permanent3136
果蝇培养管Genesee Scientific 32-109
滤纸 GE Healthcare Life Science 1450-042
鱼食 TetraB00025Z6YI金鱼薄片饲料 
果蝇培养瓶Genesee Scientific AS273
荧光显微镜Leica Microsystems  M165 FC
基因片段Integrated DNA TechnologiesN/A
gRNASynthegoN/A
卤代烃油 700 Sigma-AldrichH8898
显微注射显微镜Leica Microsystems DM2000
JM109  E. coli 感受态细胞 Zymo ResearchT3005
显微注射仪EppendorfFemtoJet 4x 
填充 Femtotips 用 Microloader 吸头 EppendorfE5242956003
显微操作器 EppendorfTransferMan 4r 
微量移液器拉制仪 Sutter Instrument P-2000
显微镜盖玻片 Fisherbrand 12-542-B
显微镜载玻片 Eisco12-550-A3
小鼠血液（用于喂食的活体小鼠）加州大学IACUC，动物使用方案 #S17187用于蚊虫血液喂养；详细信息符合动物伦理协议
NEB Q5 高保真 DNA 聚合酶 New England BiolabsM0491S
PCR 纯化试剂盒Qiagen28004
质粒小提试剂盒 Zymo ResearchD4036
石英丝 Sutter InstrumentsQF100-70-10
体外转录纯化试剂盒Fisher ScientificAM1908
超纯水 Life Technologies10977-023

参考文献

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胚胎显微注射基因敲除基因敲入荧光标记同源定向修复蚊群抑制向导RNA
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