在新生兔仔中植入脑电图和心电图遥测装置

摘要

癫痫猝死（SUDEP）的机制尚不明确，且难以从现有模型中进行转化研究。转基因兔模型可能为这些机制提供新的见解。本文描述了一种对转基因兔仔兔进行长期、连续脑电图和心电图记录的方法，用于评估可能导致死亡的严重事件。

摘要

离子通道基因的致病性变异与癫痫猝死（SUDEP）的高发生率相关。SUDEP 的机制尚不明确，但可能涉及自主神经功能障碍和心律失常，而不仅仅是癫痫发作本身。一些离子通道基因在脑和心脏中均有表达，这可能增加伴有癫痫和心律失常的离子通道病患者发生 SUDEP 的风险。表达癫痫相关变异的转基因兔为研究 SUDEP 复杂的生理机制提供了完整的生物模型。重要的是，相较于小鼠模型，兔的心脏生理更接近人类。然而，在进行侵入性监测操作时，兔模型需要额外关注其健康状况和麻醉管理。我们开发了一种新型手术方法，可在新生兔仔兔中植入遥测设备，实现长期同步脑电图（EEG）和心电图（ECG）监测。本文展示了在出生后第14天（P14，体重范围175–250 g）仔兔中植入遥测设备的手术方法，详细说明了手术入路、合适的麻醉与监测措施以及术后护理，从而实现了较低的并发症发生率。该方法可在心脏心律失常、癫痫发作及潜在 SUDEP 发生的关键发育阶段，持续监测神经与心脏的电生理活动，适用于遗传性或获得性癫痫兔模型的研究。

引言

癫痫猝死（SUDEP）是癫痫患者死亡的主要原因之一。SUDEP 的机制尚不明确，但可能涉及自主神经功能障碍、呼吸暂停、心律失常以及癫痫发作本身^{1,2,3,4,5,6,7}。携带通道病相关遗传性癫痫的患者 SUDEP 发生率最高。例如，在电压门控钠通道基因 SCN1A 存在变异的患者中，SUDEP 的发生率高达 20%⁸，该基因突变可导致 Dravet 综合征，这是一种在生命第一年即发病的遗传性癫痫。许多与癫痫相关的离子通道基因在脑和心脏中均有表达，实验室和临床数据表明，通道病相关遗传性癫痫患者可能存在心律失常^{7, 9,10,11,}

方案

所有描述的工作均经密歇根大学机构动物护理和使用委员会审查并批准，作为已批准的动物使用方案的一部分，并符合相关联邦法律和指南，包括美国农业部《动物福利法》和美国国立卫生研究院公共卫生服务政策。密歇根大学是一所通过国际实验动物评估和认可委员会（AAALACi）认证的机构。

1. 动物准备

1. 使用电推剪在手术前1-2天（P14-P19日龄，体重>175 g）对动物进行粗剃毛，以尽量减少手术当天的麻醉时间。
2. 对所有手术器械和材料进行灭菌（高压蒸汽灭菌或气体灭菌）。
   注意：牙科水泥在生产过程中无法保证无菌。因此，每个手术组均应使用全新且在有效期内的牙科水泥容器，并在IACUC批准的实验方案中注明此项例外情况。
3. 通过肌肉注射给予氯胺酮（10 mg/kg）、盐酸丁丙诺啡（0.01 mg/kg，用0.3 mg/mL稀释至0.03 mg/mL）以及通过非重复呼吸回路面罩麻醉给予七氟烷和氧气，以诱导麻醉。
4. 在耳缘静脉（优先选择）或头静脉插入26 G ¾"静脉导管，并用含肝素生理盐水（10单位/mL）冲洗。
5. 使用#40或#50刀头尽可能贴近皮肤剃除腹部、胸部、背部、颈部和头部的毛发。
6. 涂抹非药物性润滑眼膏，以防止角膜溃疡。
7. 给予镇痛药（卡洛芬4 mg/kg，皮下注射，稀释至25 mg/mL）和围手术期抗....

结果

本项目取得成功需要在植入手术和记录方案中优化多个参数。共对16只幼兔进行了植入手术尝试或实施，其中14只成功存活并完成手术。在这些动物中，有12只存活至实验终点。术中或术后死亡的原因详见表1，同时列出了使后续实验成功达到终点的手术方案改进措施。最常见的术中并发症是呼吸抑制，进而导致低氧血症和心动过缓。为此，方案中增加了多种监测手段，包括2台脉搏血氧仪和1台多普勒监护仪，以便在某台设备发生故障或术中松脱时提供备用监测。此外，兔类皮肤色素可能影响脉搏血氧测定的可靠性，因此需要从身体多个部位进行监测。尽管麻醉的诱导期和苏醒期通常被认为是风险最高的阶段，但我们在手术过程的其他阶段也观察到呼吸抑制引发的心动过缓，这突显了全程严密监测生命体征的必要性。针对该并发症，我们在前两批动物（动物1-4）出现麻醉相关并发症后，对方案进行了调整，增加了额外的监测措施并引入了多沙普仑。动物12和13属于同一批次，因呼吸驱动力不足而给予多沙普仑（2-5 mg/kg，静脉注射或舌下给药）。两者在术中均成功从呼吸抑制和呼吸暂停中被成功复苏。

在将幼兔放回其原代笼具后可立即开始遥测.......

讨论

本文所述的麻醉诱导、监测和支持方案在满足外科手术需求和操作便利性的同时，兼顾了兽医护理的金标准。在实验室将该方案采纳为标准操作程序之前，曾尝试过其他几种可能的优化措施，包括背侧皮下植入、使用气管插管或喉罩气道（LMA），以及采用食道听诊器附件进行心率监测。然而，这些方法最终均因各种原因被放弃。尽管皮下空间足以容纳遥测装置，但由于遥测设备本体及导线出口的设计导致无法关闭死腔，导线布线和盘绕以适应动物生长存在困难，且术中需改变体位两次以固定心电图电极，显著延长了手术时间，并增加了不必要的操作复杂性。此外，尽管面罩麻醉通常不被推荐，但由于缺乏尺寸合适的喉罩，且在放置后无法固定和维持气管插管，这些方法均不可行。根据先前报道的新生兔插管技术，即使成功置入气管插管，术中需要翻转幼兔体位以及需暴露颈部和头背部的操作也限制了插管的固定选择²⁵。我们还尝试在幼兔被无菌巾覆盖后，使用食道听诊探头监测心率，以防脉搏血氧仪或多普勒信号丢失。然而，所有市售的食道听诊器均过大，推测每次插入时均会引起迷走神经反应，导致不可持续的严重心动过缓。

使用七氟烷而非异氟烷.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 英寸弹性绷带 - Coban 或 Vetwrap	3M	https://www.3m.com/3M/en_US/p/d/b00003186/
4-0 PDS 单股缝线	Ethicon	https://www.jnjmedtech.com/en-US/company/ethicon/all-products
5-0 Ethilon 尼龙缝线	Ethicon	https://www.jnjmedtech.com/en-US/company/ethicon/all-products
数据采集计算机	Dell	https://www.dell.com/en-us
粘性手术巾	N/A	N/A
麻醉回路 - 带 0.5 L 重复呼吸袋的 Jackson-Rees 回路	JorVet	J0248GA
聚维酮碘擦洗液	N/A	N/A
布比卡因 (0.5%)	N/A	N/A	给药前稀释至 2.5 mg/mL
丁丙诺啡 (0.3 mg/mL)	N/A	N/A	给药前稀释至 0.03 mg/mL
骨钻 - 1.00 mm	Cell Point Scientific	60-1000	用于颅骨钻孔
头孢唑啉 (1 g 冻干粉)	N/A	N/A	稀释至 50 mg/mL
卡洛芬 (50 mg/mL)	MWI Veterinary		给药前稀释至 25 mg/mL
棉签	N/A	N/A
定制 3D 打印面罩	N/A	https://www.thingiverse.com/thing:923725
牙科丙烯酸树脂	N/A	N/A
营养凝胶 Diet Gel Criticare	Clear H2O	72-05-5042	营养支持
多普勒耦合凝胶 - Aquasonic	Patterson	07-890-5542
多普勒仪 - Vet-Dop2	Patterson	07-888-8986
多沙普仑 (20 mg/mL)	MWI Veterinary	N/A	仅用于紧急情况
Dumont #5 精细镊子	Fine Science Tools	11254-20	用于夹持螺钉
Duraprep	3M	8630	最终皮肤准备
ecgAuto 数据分析软件	emka technologies	N/A
肾上腺素 (1:1000)	MWI Veterinary	N/A	仅用于紧急情况
纱布	N/A	N/A
血糖仪 ipet Pro	MWI Veterinary	63867	若恢复不良则进行监测
格隆溴铵 (0.2 mg/mL)	MWI Veterinary	N/A	仅用于紧急情况
电子天平	N/A	N/A
止血钳	Fine Science Tools	13008-12	打结固定导线环时用于夹持导线
Ideal 微型钻机	Cell Point Scientific	67-1204	用于颅骨钻孔
恒温培养箱	DRE-veterinary (Infantia - NB1)	N/A
诱导箱	VetEquip	941444
红外加热垫 - RightTemp Jr	Kent Scientific Corporation	RT-0502
IOX2 数据采集软件	emka technologies	N/A
静脉导管 - Covidein Monoject 26 G，3/4 英寸 PTFE	Patterson	07-836-8494
氯胺酮 (100 mg/mL)	MWI Veterinary	N/A
医用胶带	N/A	N/A
窄型直头镊子 - 直型/12 cm	Fine Science Tools	11002-12
新生儿听诊器	Ultrascope	N/A
Olsen-Hegar 带剪镊子 - 12 cm	Fine Science Tools	12002-12	用于缝合
眼科软膏 Puralube	MWI Veterinary	N/A	麻醉期间应用于双眼
眼科润滑剂 - Paralube Vet	Patterson	07-888-2572
脉搏血氧仪 (AccuWave Portable)	Patterson	07-892-9128	用于术前准备和恢复期；可读取最高 400 次/分钟的心率
脉搏血氧仪 (SDI - Vet/Ox plus 4700)	Heska	N/A	术中使用；已停产
接收器	emka technologies	N/A	每 4 个遥测植入物配备 1 个接收器
直肠温度计	N/A	N/A
手术刀	Fine Science Tools	10003-12
手术剪	Fine Science Tools	14002-12	用于裁剪手术单
螺丝刀 - 1.0 mm	N/A	N/A	来自电子设备用迷你螺丝刀套装
螺钉 00-96 x 3/32 (2.4 mm)	Protech International	8L0X3905202F
七氟烷	MWI Veterinary		维持麻醉
七氟烷蒸发器及麻醉机	N/A	N/A
皮肤粘合剂 Gluture	MWI Veterinary	34207	用注射器少量涂抹
小型剪刀	Fine Science Tools	14084-08
无菌铝箔	N/A	N/A	在动物旋转前包裹导线
无菌毛刷	N/A	N/A	用于涂抹牙科丙烯酸树脂
无菌生理盐水	N/A	N/A
无菌外科手套	N/A	N/A
无菌超声探头套	N/A	N/A	用于覆盖钻头
无菌水	N/A	N/A	用于头孢唑啉的重悬
15 号手术刀片	N/A	N/A
手术单	N/A	N/A
手术衣	N/A	N/A
旋转连接器 - Jorgensen Labs	Patterson	07-802-2349	用于连接麻醉回路与面罩
遥测植入物	emka technologies	easyTEL+_M1_EETA_B_35
套管针	SAI	TRO-10-6	用于导线穿隧