Calendula officinalis L. 生长与花发育过程中的黄酮含量

摘要

本文介绍了氯化铝比色法，这是一种用于定量测定金盏花中黄酮类化合物的直接分析技术。该方法利用一个简单的化学反应，即将金盏花提取物与氯化铝试剂反应，形成有色络合物。通过分光光度法测定颜色的强度，其与黄酮类化合物的浓度呈正相关。

摘要

金盏花（Calendula officinalis L.）具有多种用途，尤其因其富含黄酮类等次生代谢产物而具有重要的药用价值，这些成分具有抗炎和抗氧化特性。本研究分析了金盏花在花部发育过程中植株生长和生物量分配情况，以及管状花、舌状花和花序中总黄酮浓度的变化。 移栽后第五周开始花的诱导与分化，其器官生物量积累及植株高度均呈现典型的S型增长模式。地上部分器官在第69天达到最大生物量，为76 g/株。绝对生长速率最高值出现在第62天，为2.38 g/天；相对生长速率最高值则出现在第48天的生殖器官中，达0.137 g/g/天。以槲皮素当量表示的黄酮类物质，在花蕾至花序完全开放的阶段浓度最高（145–177 mg/g干物质）。这些结果强调了在最佳发育阶段采收的重要性，以最大化黄酮含量，并充分发挥其在治疗和商业应用中的潜力。

引言

人们对药用植物次生代谢产物日益增长的兴趣源于其在制药、治疗、化妆品及其他工业中的广泛应用。其中，Calendula officinalis L. 是菊科的一种一年生草本植物，原产于地中海地区¹，但目前已在全球广泛栽培，因其花朵具有观赏、药用、工业和食用等多种用途而受到广泛关注²。目前，英国是全球最大的 C. officinalis 生产国³。 

花序是该植物最常利用的器官，因其含有黄酮类、类胡萝卜素、萜类、精油、单宁、香豆素、碳水化合物和脂肪酸等生物活性化合物^3,4,5,6这些天然化合物赋予其药理特性，包括抗炎、抗氧化、抗菌以及促进伤口愈合的作用。⁷. 从历史上看， C. officinalis 又称金盏花，已在阿育吠陀医学和顺势疗法等传统医学体系中用于缓解多种疾病，包括皮肤创伤、胃肠道紊乱、月经不调及炎症性疾病。⁸现代应用已拓展至制药、食品和化妆品行业，其中金盏花提取物被用于乳霜、血清、酊剂及药物递送系统中。⁹尽管进行了广泛的研究，但在充分挖掘其治疗潜力方面仍存在挑战 C. officinalis生物活性化合物浓度因环境和栽培因素而产生的变异性，凸显了建立标准化提取与制剂工艺的必要性。黄酮类化合物的生物活性及其在植物组织中的鉴定问题 是质量控制的关键环节^10,11.

在墨西哥，万寿菊的栽培通常缺乏对其生长过程和花部发育的深入了解，从而限制了其生理表现、产量以及生物活性化合物与农艺因素之间的相关性研究。植物组织中黄酮类化合物的浓度和分布受生长和栽培条件的影响，这凸显了研究该物种生理与发育过程的重要性。

本研究旨在分析营养器官和生殖器官中生物量分配及源-库关系 C. officinalis，用于识别 关键的花部发育事件，并通过本文提出的显微分光光度法量化花序中总黄酮的浓度。这些研究结果旨在优化农业栽培措施，并提升该植物衍生产品的品质。

方案

1. 通用材料与方法

1. 检测花芽诱导的田间试验
   1. 在田间条件下设置实验。将金盏花幼苗移栽至153 m²的区域，种植密度为每平方米若干株，株距60 cm。
   2.  建立局部滴灌系统，使用16/8000规格的滴灌带。注：本实验所用种子来自单一基因型，经连续三个种植周期的混合选择育种方法筛选获得   。在温带气候条件下，最佳播种时间为春季，约2个月后幼苗准备就绪时进行移栽 。建议每周灌溉一次。应避免病虫害发生，并根据作物需求进行农艺管理。
2. 从移栽后第14天开始，每隔一天采集选定植株的样品。在体视显微镜（约40倍）下观察茎尖分生组织，以确定花序原基出现的日期。
   注：当至少一半样品中出现花分生组织（FM）时，可将该日期记录为FM发生的适宜时期。用于观察花芽起始的实验单位为单株植物中的五个分生组织，共八个重复（植株）。生长与花发育分析
   1. 当花蕾开放时，采集顶端头状花序。
      注：确保舌状花可见。
   2. 在最后七个花发育阶段¹²（图1）期间进行花器官采集。
      注：本实验中，每个发育阶段使用来自八株不同植株的五个头状花序。所有情况下，花朵均采自植株顶端部位。
   3. 在整个生物周期内分六个时间点采集整株样品。
   4. 将采集的样品在通风烘箱中于40 °C下干燥48小时，测定营养器官和生殖器官的干重。
      注：建议在40 °C的通风烘箱中进行干燥。
   5. 分别计算营养器官和生殖器官的库强（Sink Strength, SS）和库活性（Sink Activity, SA）¹³。
      注：SS和SA的计算分别采用与绝对生长速率（AGR）和相对生长速率（RGR）等效的公式。
   6. 使用电子表格软件绘制生长曲线。

2. 总黄酮含量的定量分析¹⁴

1. 将植物材料置于强制通风烘箱中，在 40 °C 下干燥 48 小时。
2. 将干燥后的材料储存于纸袋中，避光并室温（RT）保存。
3. 使用液氮冷冻植物材料，以备研磨。
4. 在瓷研钵中研磨冷冻材料，直至质地均匀。
   注意：操作液氮时需谨慎，因其接触植物材料时可能发生飞溅。
5. 样品制备：称取每份样品的 25 mg 粉碎干燥物，加入 500 µL 80% 甲醇。
6. 黄酮类化合物提取：将混合物置于超声设备中，在 70 °C 下孵育 1 小时，随后在 731 g 条件下离心 13 分钟¹⁵。
7. 制备分样：取 150 µL 所得提取液，加入 37 µL 80% 甲醇。
8. 混合 50 µL 提取液、 100 µL 10% 氯化铝溶液和 100 µL 1 M 醋酸钾溶液，再加入蒸馏水定容至 5 mL。
9. 将溶液在室温下静置 30 分钟。
10. 使用分光光度计在 415 nm 处测定吸光度。
11. 绘制标准曲线：称取 2.7 mg 槲皮素溶于 10 mL 80% 甲醇中配制储备液；从中分别取 50、100、175、250 和 350 µL，稀释至 10 mL，配成 5 个不同浓度的槲皮素溶液。
12. 制备标准样品：向每份 500 µL 槲皮素溶液中加入 100 µL 10% 氯化铝溶液 和 100 µL 1 M 醋酸钾溶液、1.5 mL 80% 甲醇以及 2.8 mL 蒸馏水。
13. 将溶液在室温下静置 40 分钟。
14. 使用分光光度计在 415 nm 处测定各标准样品的吸光度，记录数值以绘制标准曲线。
    注意：比较舌状花、管状花及整朵花头中总黄酮含量。本实验采用完全随机设计，每个处理重复 5 次。以黄酮浓度为响应变量，采用 Tukey 检验进行处理均值比较（SAS Institute, 2003）。

结果

C. officinalis 在整个植株及其器官中的生长表现出S形生物量积累动力学特征。该观察结果与其他研究者的报道一致，均显示出典型的S形生长曲线。在所有地上器官中，茎积累的生物量最多（图3）。所有地上器官的初期生长均较缓慢，开花和花芽发育始于第41天。植株在第69天达到最大干重生物量，平均每株为76 g。

从授粉期至移栽后77天，对植株主要器官的汇强（Sink Strength, SS）动态变化进行了评估（图3）。结果表明，在花头发育期间，营养器官（根、茎、叶）持续生长，因此营养器官与生殖器官之间存在对养分的竞争。营养器官的汇强显著高于花头。营养器官的汇强在第50天达到峰值（2.2 g/天），而生殖器官的生长速率峰值（0.64 g/天）出现在第62天。
盆栽金盏花植株及其器官的相对生长速率（RGR）（图4）随着作物的成熟而下降。这种下降归因于植株分生组织所占比例的减少。生殖器...

讨论

鉴定出两种类型的花，即舌状花和管状花（图5）。我们发现，舌状花中黄酮类化合物的浓度低于管状花，差异范围为11%至53%。这表明管状花比舌状花积累了更多的黄酮类化合物，因为管状花具有更大的生物量和更高浓度的这些化合物。

比较花发育各阶段发现，管状花的黄酮类化合物浓度在花发育过程中持续下降，因此枯萎的花序中黄酮类化合物含量仅为幼嫩花蕾（萼片未分离）的一半左右。相比之下，舌状花的黄酮类化合物浓度在除第10和第13阶段外的其他阶段基本保持稳定，在这两个阶段观察到显著降低。花发育不同阶段中黄酮类化合物浓度的差异表明，黄酮类化合物的合成高峰出现在第11阶段（成熟花序），这可能是一种抵御植食性动物的防御机制^18,19。如果花序中黄酮类化合物的积累来源于其他器官的转运（即在其他部位合成），那么在果实形成期间花序可能仍在积累黄酮类化合物，因为种子发育所需的代谢物通常多于花朵。在番石榴（Psidium guajava<...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
鼓风干燥箱	Precision 17 GCA Corp.	N/A	设备
Bug clean	Alternagro	N/A	利用植物油和提取物控制农业害虫
甲醇分析纯	merck	822283	试剂
硝磷酸钾复合肥 特级 12+12+17+2 MgO+8 S	EUROCHEM	7/548/CEE,1999/45/CE	NPK颗粒肥料，含有：硝酸铵、铵盐、磷酸盐、钙盐、钾，有时还含有镁和微量元素。1H-吡唑-3,4-二甲基磷酸盐（1:1）
PHC Healthy Start	PHC Mexico	N/A	PHC Healthy Start 12-16-12 是一种可改善植物营养、色泽和活力的肥料。
槲皮素	Sigma-Aldrich	204-187-1	标准物质