方法文章

用于研究 结核分枝杆菌 与免疫受体 SLAMF1 相互作用的荧光检测

DOI：

10.3791/67745

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2025年2月28日

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1Centro de Investigaciones Básicas y Aplicadas (CIBA), Universidad Nacional del Noroeste de la Provincia de Buenos Aires (UNNOBA), 2Centro de Investigaciones y Transferencias del Noroeste de la Provincia de Buenos Aires (CIT NOBA), UNNOBA- Universidad Nacional de San Antonio de Areco (UNSAdA)- Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), 3CONICET- Universidad de Buenos Aires, Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (IQUIBICEN), 4Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Departamento de Química Biológica, Universidad de Buenos Aires

本文内容

摘要

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本研究为评估 结核分枝杆菌 与 SLAMF1 微生物传感器的相互作用提供了一种方案。使用流式细胞术和荧光显微镜对人单核细胞衍生的巨噬细胞进行检测。所描述的工具与研究病原体和免疫受体之间的相互作用有关。

摘要

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对病原体和免疫受体之间直接相互作用的评估通常涉及复杂的技术，或者意味着使用转基因菌株和基因工程细胞。在这里，描述了一种检测巨噬细胞微生物传感器 SLAMF1 和 结核分枝杆菌 之间生化相互作用的替代方法。开发了两种采用流式细胞术和荧光显微镜的技术方法。从人巨噬细胞中生成总细胞蛋白提取物，然后在 4°C 下与 结核分 枝杆菌 （WCMtb） 或 结核分 枝杆菌抗原 （Mtb Ags） 全细胞孵育过夜，最后使用甲醛/甘氨酸/乙二醇双（琥珀酰亚胺琥珀酸酯）处理交联。 用 PE 特异性抗 SLAMF1 抗体检测流式细胞术与 WCMtb 的相互作用。通过将罗丹明-PE 染色的 Mtb Ags 附着到聚-D-赖氨酸包被的载玻片上，将其与来自单核细胞衍生的巨噬细胞的总蛋白提取物一起孵育，通过荧光显微镜进行相互作用的存在。交联处理后，使用一抗 （抗 SLAMF1） 和二抗 （Alexa Fluor 488） 对 SLAMF1 进行可视化。这些检测为测量病原体-免疫受体相互作用提供了一种强大的生化工具，克服了与转基因细胞系和蛋白质基因表达调节实验相关的困难。

引言

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结核分枝杆菌是 142 年前发现的结核病致病病原体，仍然是一项全球性挑战，目前至少感染了世界人口的四分之一1。结核分枝杆菌通过感染者的空气飞沫传播，到达肺部的肺泡巨噬细胞，在那里它可以在潜伏状态下长期存活 2,3。不仅局部巨噬细胞反应被激活，而且近年来，据描述外周单核细胞可以被募集到呼吸道并分化为肺泡巨噬细胞，从而产生比胎儿来源的结核分枝杆菌更强烈的反应 2,4。

巨噬细胞是先天免疫的基本参与者。摄入结核分枝杆菌后，巨噬细胞表现出许多杀微生物功能，例如分泌促炎细胞因子、吞噬溶酶体融合以及激活其他免疫细胞以杀死结核分枝杆菌 2,3。然而，这种病原体的复杂结构提供了能够调节巨噬细胞代谢和功能的效应子（例如蛋白质和脂质），从而调节炎症过程3。这种通过分泌毒力因子或利用宿主因子来纵巨噬细....

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方案

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所有涉及人单核细胞来源的巨噬细胞的程序均根据赫尔辛基宣言 （2013） 并经 UNNOBA 伦理委员会 （COENOBA） 同意进行。在样本采集前获得书面知情同意书。男性/女性组分布为 13/6，中位年龄为 32 岁，四分位距 （IQR） 为 18-75 岁。既往病症、合并症或结核病阳性诊断的存在被定义为排除标准。试剂和设备的详细信息列在 材料表中。

1. 单核细胞衍生的巨噬细胞培养和刺激

  1. 抽血
    1. 通过在肝素化注射器中进行静脉穿刺，从健康捐献者那里获得 60 mL 血液。
      注意：血液提取必须由生物化学家或采血技术人员进行。
    2. 丢弃锐器处理容器中的针头和病理废物容器中与献血者血液接触过的任何材料。
  2. 单核细胞分离和巨噬细胞生成
    1. 小心地将血液转移到 50 mL 试管中，并用生理盐水溶液将其稀释一半。
    2. 在密度梯度培养基上进行离心，以获得外周血单核细胞 （PBMC）。
    3. 从白色光晕中收集 PBMC。
    4. 用盐水溶液以 400 x g 的浓度洗涤 10 分钟，最后在 20 °C 下以 200 x g 洗涤 15 分钟，以消除血....

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结果

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在这项工作中，提供了一种方案，允许评估结核分枝杆菌与人巨噬细胞中免疫受体 SLAMF1 的相互作用（图 1）。为此，获得了来自健康供体的外周血。然后，通过在密度梯度培养基上离心分离 PBMCs，并通过磁性阳性选择分离单核细胞 （≥95% 纯度，图 2A，B）。将分离的单核细胞粘附在塑料培养板上 2 小时以获得单核细胞衍生的巨噬细胞，然后继续培养。之后，用超声处理的结核分枝杆菌 （Mtb Ags） 刺激巨噬细胞以诱导 SLAMF1 表面表达，如第 10 节前报道的那样，表面 SLAMF1 水平通过流式细胞术确认（图 2C).最后使用 RIPA 裂解缓冲液结合涡旋和冰上孵育裂解巨噬细胞，以促进细胞裂解。生成的总蛋白提取物用于相互作用测定。

在第一组实验程序中，采用流式细胞术研究 SLAMF1 .......

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讨论

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本研究为研究 结核分枝 杆菌与人类巨噬细胞中表达的微生物传感器之间的生化相互作用提供了有用的指南，巨噬细胞是结核病期间参与宿主反应的关键细胞类型。提供的协议将与破译在 结核分枝杆菌 进入吞噬细胞中起作用的分子相关。

表征生物分子相互作用，例如病原体和免疫受体之间的相互作用，对于理解结核分枝杆菌引发的免疫保护机制和逃避策略至关重要。很多时候，证明受体与其细菌配体的直接相互作用可能很复杂，并且可能需要缺乏多功能性的复杂技术或系统。Driessen 等人使用牛分枝杆菌 BCG32 的突变缺陷菌株研究了磷脂酰肌醇甘露糖苷在分枝杆菌和 DC-SIGN 相互作用中的作用。尽管他们设法研究了这些相互作用，但作者没有发现突变菌株的差异，并讨论了创造显示结合减少的突变细菌将是一项艰巨的任务32。其他作者进行了出色而费力的工作，以证明 TLR2 与结核分

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披露

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作者声明没有利益冲突。

致谢

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这项工作得到了布宜诺斯艾利斯国立大学（授权号 SIB 0618/2019、SIB 2582/2012 至 VP）、Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica（ANPCyT，授权号 PICT-2012-2459 和 PICT A 2017-1896 至 VP 和 PICT-2021-I-INVI-00584 至 AB）的支持;弗洛伦西奥·菲奥里尼基金会;和 Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas （CONICET，授予号 PIO 15720150100010CO 至 VP）。我们感谢 Natalia Menite 和 Gastón Villafañe 提供的技术支持。我们感谢 Paula Barrionuevo 博士和 Luciana Balboa 博士在出版物期间进行的科学讨论，这导致了本研究中介绍的分析方法的发展。最后，我们感谢 Estermann 博士关于交联方案的建议，Lic。Moroni 关于使用 Poly-Lysine 和 LiC 的建议。Moriconi 帮助制作示意图。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Alexa Fluor 488 二抗InvitrogenA21121用于荧光显微镜
抗SLAMF1 FITC抗体 电子生物科学11-1509-42用于流式细胞术
抗SLAMF1 PE抗体 生物传奇306308用于流式细胞术
抗SLAMF1一抗 生物传奇306302用于荧光显微镜
水形聚形/安装理科18606-20封片介质
CD14 微珠米尔特尼生物科技130-097-052用于单核细胞分离
盖玻片 12 毫米HDA的-用于显微镜相互作用测定
EGS系统赛默飞世尔科技 21565用于交联处理
FACS坎托 IIBD生物科学338960带有BD FACSDiva软件的流式细胞仪
胎牛血清 纳拓科-灭活和辐照，用于巨噬细胞培养
菲科尔-帕克 PLUS赛蒂瓦17144003用于 PBMC 分离
斐济/ImageJ开源软件-用于显微照片分析
FlowJo 7.6.2 树星-用于流式细胞术分析
甲醛默 克K47740803613用于交联处理
载玻片玻璃克拉斯-用于显微镜相互作用测定
甘氨酸西格马G8898用于交联处理
成像仪.A2卡尔蔡司430005-9901-000带有 Colibri 7 照明模块的荧光显微镜
iMark（爱马克）生物辐射1681130微孔板吸光度读数仪 
L-谷氨酰胺西格玛·奥尔德里奇49419用于巨噬细胞培养
结核分枝杆菌，菌株H37Rv，γ射线照射全细胞 BEI 资源、NIAID、NIH编号：NR-14819用于相互作用测定
结核分枝杆菌，菌株 H37Rv，全细胞裂解物BEI 资源、NIAID、NIH编号：NR-14822用于巨噬细胞刺激和相互作用测定
新脱发器 13R治疗力新脱发器 13R用于蛋白质提取的高速冷冻离心机
青霉素/链霉素吉布科15140122用于巨噬细胞培养
PMSF赛默飞世尔科技36978用于蛋白质分离
聚-D-赖氨酸西格玛·奥尔德里奇A-003-M用于盖玻片处理
蛋白酶抑制剂鸡尾酒西格玛·奥尔德里奇 第 8340 页用于蛋白质分离
罗丹明 B 西格玛·奥尔德里奇 21955用于结核分枝杆菌染色
RPMI 1640吉布科11875093用于巨噬细胞培养
Sorvall ST 16/16R 离心机赛默飞世尔科技75004240用于 PBMC 和单核细胞分离

参考文献

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  1. Global Tuberculosis Report 2023. , World Health Organization. Available at: https://www.who.int/tb/publications/global_report/en/ (2023).
  2. Ahmad, F., et al. Macrophage: A cell with many faces and functions in tuberculosis. Front Immunol. 13, 882130(2022).
  3. Bo, H., et al.

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SLAMF1

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