利用小鼠模型通过微型计算机断层扫描和血液采样监测肺结节进展

摘要

本方案描述了一种高效、简便且微创的方法，用于研究肺结节。采用颌下静脉采血和微型CT成像作为研究技术。

摘要

微型计算机断层扫描（micro-CT）是一种实时、直观、灵敏且 minimally invasive 的技术，可用于监测肺结节（PN）向肺癌（LC）演变过程中的变化。结合下颌静脉采血，可在 PN 向 LC 进展过程中快速、稳定且简便地检测成像特征及关键靶标的变化。本研究中，我们向 A/J 小鼠给予 100 mg/kg 剂量的 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone，以建立肺腺癌模型。随后通过下颌静脉采血和 micro-CT 检测对实验动物的疾病进展进行监测。实验结果表明，部分动物在第 10 周时肺部已出现结节样病灶^th 周，肺腺癌的影像学表现到第21天时已变得明显^st 周。综上所述，显微CT可有效观察小鼠肺部的病理变化，结合下颌静脉采血技术，能够动态监测血液、蛋白及靶标物的变化。该方法为药物筛选、药代动力学检测、毒理学实验及安全性研究提供了一种高特异性、简便且灵敏的技术手段。

引言

肺癌（LC）是一种起源于支气管黏膜或肺腺体的严重肿瘤。根据2021年的统计数据，全球每年约有两百万人死于肺癌，其发病率和死亡率均呈上升趋势¹。肺癌的早期诊断和干预有助于提高治愈率、降低死亡率并减少治疗成本。肺结节（PN）是肺癌的特定前体病变，在影像学检查中表现为直径≤30 mm的局限性、类圆形、密度增高的实性或亚实性阴影，且无肺不张、纵隔淋巴结肿大或胸腔积液的证据²。2022年，美国国家综合癌症网络（NCCN）根据肺结节的数量、直径和密度对其进行分类，例如将右肺单发的5 mm磨玻璃样结节作为分类组合之一³。然而，NCCN指南指出，肺结节的恶性风险随其直径增大和数量增多而升高。低剂量计算机断层扫描的广泛应用显著增加了肺结节的检出率，每年新发现的病例达数百万例⁴。

A/J小鼠与4-(甲基亚硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮（NNK）联用是肺癌（LC）最常用的动物模型^5,6结合下颌下静脉采血使用显微CT是实时监测肺结节（PN）向肺癌（LC）演变变化的有效方法。化学致癌物诱导，尤其是采用NNK诱导A/J小鼠，是目前最常用的肺癌建模方法，已被证实为建立癌变模型的有效手段。 原位^7,8该建模方法相较于腋窝接种法能更准确地模拟周围神经病变为肺部病变的进展过程。

既往研究主要集中在安乐死后对结节形态的统计学分析以及组织样本的病理染色⁹。然而，这些方法无法实现实时监测肺结节（PN）向肺癌（LC）的动态进展过程¹⁰。微型计算机断层扫描（Micro-CT）作为一种非侵入性成像技术，具有高分辨率、快速成像、低辐射剂量和安全性等优势，可提供准确的纵向数据，适用于肺部影像的实时检测^11,12。下颌静脉采血是目前最新、最简单且最快的从小鼠获取血液样本的方法¹³。这种非侵入性技术对动物操作要求极低，且动物恢复迅速，符合“3R原则”，即减少实验动物使用数量、最小化动物痛苦并促进伦理化动物实验。所采集的血量约为0.2–0.5 mL，足以满足对血液参数进行中等要求的监测¹⁴。

同时使用微型CT和下颌下静脉采血技术，可对影像学中的PN向LC进展过程进行动态、实时观察，并实时检测血液中的关键靶标¹⁵。此外，该方法还能够实时研究代谢物及其他生化物质，结合高效液相色谱等技术，进一步加深对LC的理解^16,17。

本研究采用A/J小鼠联合NNK构建原位肺癌小鼠模型。在造模后第4、10和20周进行微型CT扫描以获取肺部影像，同时采集血液样本 通过 实验全程进行颌下静脉采血。本研究旨在通过结合颌下静脉血液采样与显微CT技术，为疑核（PN）和蓝斑核（LC）的研究建立基础。

在肿瘤学中，微型计算机断层扫描（micro-CT）是一种检测肿瘤生长的高效工具，可在研究过程中的任何时间点提供高分辨率技术，用于测量局部阴影焦点的变化^18,19。然而，必须认识到，micro-CT 本身并不能提供关于阴影焦点特征、动物生理状态或关键生物因子水平的信息。因此，本研究采用了下颌下静脉采样作为补充方法。

方案

本研究中描述的所有动物实验均经成都中医药大学实验动物福利伦理委员会批准，并依照动物研究相关法律法规及伦理标准进行（审查编号：2024035）。雌性近交系 A/JGpt 小鼠（7–8 周龄）饲养于温度 20–24 °C、相对湿度 40%–70% 的环境中，自由摄取标准动物饲料和纯化水。 随意摄取 在12小时光照-黑暗循环条件下进行。实验前，每只动物在此环境中适应7天。所用试剂和设备的详细信息见下文列出的 材料清单.

1. 试剂与动物准备

1. 化学试剂与试剂
   1. 将NNK溶于生理盐水中，配制成10 mg/mL的母液²⁰。对NNK组小鼠进行单次腹腔注射，剂量为0.2 mL，浓度为100 mg/kg；对照组小鼠则给予等体积的正常生理盐水。
      注：参考Jang等人的研究²¹确定微计算机断层扫描（micro-CT）和采血的时间点。
2. 血液采集
   注：为确保小鼠健康，每次采血量不得超过0.2 mL，并给予一周恢复时间。由于颏下区域毛发较多，采血过程中需注意避免毛发污染血液样本。
   1. 实验前一天使用合适的剃毛器去除小鼠面部毛发。
   2. 用左手牢固抓住小鼠头部后侧皮肤，防止其移动，并保持头部固定。
   3. 迅速将采血针从斜眼眶后方的下颌区域插入颌下动脉。针头留置至少3秒，以保证充分血流。采集50–200 µL血液。
   4. 将血液收集至EDTA抗凝管中。用棉签轻压皮肤止血。待出血停止后，释放小鼠并观察30秒。
   5. 轻轻振荡试管，确保血液与抗凝剂充分混合。
   6. 进行常规血液检测时，将采集的血液放入兽用血常规检测仪器中，按下采样按钮，由仪器自动完成采样。记录显示结果，并安全处理剩余血液。

2. 体内 显微CT成像

注意：使用微型计算机断层扫描（micro-CT）前，务必从实验动物身上移除耳标等金属物品。金属物体会在图像中产生严重伪影。micro-CT 会释放一定剂量的辐射，请确保其他实验结果不受影响。

1. 启动设备，运行微计算机断层扫描（micro-CT）软件，并执行探头校准和预热。使用专用于小鼠的工具床进行扫描。
2. 创建一个新的数据库并为本次扫描命名，或连接至一个已存在的数据库。
3. 在软件设置窗口中修改参数。将X射线滤光片设为Cu0.06 + Al0.5，电压设为70 kV，电流设为80 µA，视野设为36 mm × 36 mm，采用360°旋转扫描，扫描时间设为4 min²²。
4. 扫描前使用3%异氟烷对小鼠进行麻醉²³（遵循机构批准的实验方案）。打开micro-CT观察界面，用胶带将小鼠固定在工具床上。通过放置在micro-CT仪器工具床上的鼻胃管持续维持麻醉状态。
5. 小心地将动物引导至装置中，并实时监测其位置。使用相应按钮调整小鼠位置，确保其胸部完全处于视野范围内。
6. 将工具床旋转90°以调整小鼠体位。使用按钮进一步调节小鼠位置，确保肺部区域位于视野中心。随后将工具床恢复至原始位置。
7. 点击扫描按钮开始扫描。让系统 uninterrupted 地完成扫描过程，期间避免打开观察界面。通过软件实时观察重建图像的横断面、冠状面和矢状面切片。
8. 扫描完成后立即评估图像质量。若出现伪影或图像模糊，需重复扫描步骤。
9. 将小鼠从装置中取出，并监测其健康状况，确认其状态稳定后送回笼具。
10. 实验结束后，从工具床上移除胶带并清洁工具床表面。保存数据并关闭仪器。
11. 轻柔地将小鼠转移回笼具，以尽量减少应激反应。确保笼具清洁并铺有适当的垫料。
12. 监测小鼠从麻醉中恢复的迹象，观察其行为、活动能力和食欲。根据需要提供食物和饮水。
13. 为小鼠提供温暖的环境，防止麻醉后低体温。必要时使用加热垫或保温毯。
14. 在接下来的一周内进行每日健康检查。注意观察是否有痛苦表现、异常行为或任何损伤。记录每只小鼠的观察结果。
15. 若发现任何小鼠出现疾病或痛苦迹象，应咨询兽医以采取适当的干预和护理措施。
16. 确保小鼠在完全恢复且状态稳定后，返回正常的饲养环境。

3. 数据处理与分析

1. 使用统计与绘图软件作为数据分析的有力工具，并用于制作表格以展示结果。
2. 打开软件，从新创建的数据表中选择XY 图表，输入NNK组和对照组的周体重数据，生成显示小鼠体重变化的图表。
3. 再次打开软件，从新创建的数据表中选择列联图，输入NNK组与对照组的血常规数据，并生成图标。
4. 在软件中选择分析选项，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）对整体数据进行分析，随后通过t检验对数据进行验证，并标注显著性差异。
5. 将微计算机断层扫描（micro-CT）数据保存为SimpleViewer格式或DICOM格式。打开SimpleViewer软件，在专业影像医师的指导下观察成像数据，利用提供的测量工具对结节进行标注并量化阴影体积。

结果

本研究展示了利用NNK结合A/J小鼠构建稳定的肺癌模型。实验设计如图1所示。研究目的是通过微型CT（micro-CT）和下颌静脉采血技术，实时观察小鼠肺部从肺结节（PN）向肺癌（LC）转变的过程。因此，在第4、第10和第20周时对小鼠肺部进行了micro-CT扫描和血液采样。

实验结果表明，NNK联合A/J小鼠的建模方法有效模拟了从肺结节（PN）到肺癌（LC）的病理过程。首先，本研究所采用的检测方法对实验动物的健康状况未造成显著影响。如图2所示，在为期20周的喂养期间，实验动物的体重与对照组相比未表现出明显差异。其次，对实验动物采样后进行的常规血液检测结果显示，模型组白细胞和血小板数量显著升高，而红细胞和血红蛋白数量保持不变（图3）。这表明从肺结节向肺癌的转化过程也伴随着慢性炎症的逐步加剧。重要的是，微型CT扫描和下颌静脉采血均未对实验动物的造血功能造成损伤，该结果与既往大量研究的发现一致。此外，在整个研究过程中对实验动物的行为、毛发状况、呼吸、饮食及饮水情况的密切观察均未发现异常。

在对实验动物初次给予NNK后，我们分别在第4周、第10周和第20周的第一天对肺部进行了显微CT扫描²⁴结果表明，与对照组相比，模型组的肺纹理逐渐增粗。至第10天^th 周时，可见微小结节灶的形成，至第20天^th 周时，结节已发展为可辨识的阴影灶。根据这些发现，可以推断肺部阴影灶的形成与NNK诱导的慢性炎症相关。²⁵然而，由于本研究旨在观察PN向LC安全、高效且无害的发展过程，未涉及动物的病理学研究，因此后续研究必须依据特定的实验方案进行。²⁶. 图4 展示了实验动物在第4周、第10周和第20周时肺部影像学的改变。

图 1：A/J 小鼠 NNK 处理的实验设计。 五只雌性 A/J 小鼠在单一时间点注射化合物 NNK，另外五只小鼠注射生理盐水作为对照。在第 4、10 和 20 周时，通过小鼠肺部的微型计算机断层扫描（micro-CT）和颌下静脉采血收集血液样本。所获得的数据进行交叉验证，以评估小鼠的疾病进展情况。(A) 实验设计概览。(B) 颌下动脉采血示意图。(C) micro-CT 成像装置的示意图，显示小鼠放置在动物床（蓝色）上，黄色框为取景框，应完全覆盖小鼠的肺组织。请点击此处查看该图的放大版本。

图2：小鼠在20周内的体重变化。 体重变化趋势表明，NNK处理对A/J小鼠的体重无显著降低作用。微型CT扫描和颌下静脉采血可能对小鼠造成一定应激反应；然而，小鼠可迅速恢复。数据以均值±标准误表示，(n = 5)。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3：随时间变化的血细胞计数。在第4、10和20周时检测了小鼠白细胞、血小板、红细胞和血红蛋白的含量。与对照组相比，NNK组白细胞和血小板数量呈上升趋势，而血红蛋白和红细胞水平无显著变化。这些结果表明，PN-LC的转化过程与炎症增加相关，且间隔超过4周进行的颌下静脉采血方法不会引起感染或对小鼠造血功能造成损伤。（A）白细胞。（B）血小板。（C）红细胞。（D）血红蛋白。数据以均值±标准误表示，（n = 5）。请点击此处查看该图的放大版本。

图4：小鼠在第4、10和20周的显微CT扫描图像。显微CT成像结果显示，NNK处理可有效模拟A/J小鼠肺部PN-LC的转化过程。与对照组相比，NNK组在第10周时肺部影像已开始出现增厚和纹理改变的特征。至第20周时，肺组织内可清晰辨识出明显的阴影病灶。（A）第4周图像。（B）第10周图像。（C）第20周图像。请点击此处查看该图的高清版本。

讨论

有必要重申本研究中的几个关键要点。首先，尽管下颌下静脉采血是一种相对低损伤的操作，但仍可能对动物造成一定程度的伤害。因此，有必要通过多次操作以减轻对小鼠的负担，并及时完成整个过程²⁷。其次，采血前去除毛发可确保样本的纯净性。第三，必须使用合适的采血管。在本研究中，常规血液检测使用了含EDTA的采血管。若需获取血清，则应使用专门设计用于采集纯血的采血管²⁸。第四，所有麻醉剂均具有一定的致死风险；因此，尽量缩短麻醉和成像时间可有效保障小鼠的健康。第五，由于显微CT可观察多种组织和器官，本研究中用于神经成像的显微CT软件具体参数设置可供参考，但未必适用于其他组织^29,30。

既往研究更倾向于在固定时间点处死动物，并通过病理染色观察肺结节转化过程³¹。该方法导致实验动物大量死亡，且难以实现对肺部变化的实时追踪。与传统技术相比，下颌下采血结合微型CT具有多项优势，包括损伤小、可实时监测、操作直观及适用性广等。本研究选择下颌下采血作为获取常规检测所需血液样本的首选方法³²。此外，所采集的血液还可用于蛋白质组学、血清药理学及血液生化分析。

同样，本研究采用显微CT技术，在无需处死实验小鼠的情况下，观察肺结节（PN）的动态生长过程。该方法有助于更直观、准确地评估药物对肺结节的抑制作用，同时显著减少实验所需动物数量，从而提高实验结果的准确性。值得注意的是，这两种技术的结合可实现对实验动物体内结节形成、发展及癌变过程的全面追踪，并能定位关键靶点（如TNF-α）的改变³³，为肺结节乃至肺癌的研究提供了独特的研究思路。

然而，仍有一些问题需要进一步考虑，以提高未来研究的质量。由于NNK联合A/J小鼠动物模型所需的实验周期较长，必须确保早期药物注射的极高精确度³⁴。其次，小鼠肺腺癌的标准建模方法是使用NNK与雌性A/J小鼠联合造模，其潜在机制与雌二醇相关。因此，必须考虑所用治疗药物的具体作用机制³⁵。此外，尚未使用显微CT来确定阴影病灶的性质，仍需依赖苏木精染色和荧光染色，而这需要处死小鼠以获取肺组织样本。最后，尽管显微CT具有辐射暴露低的优点，但仍可能对人体造成一定损伤，因此必须避免无关人员靠近³⁶。为解决上述问题，可通过尾静脉注射造影剂，有效实现对不同组织、气道和血管的区分与标记。此外，可将显微CT与新型材料药物（如纳米颗粒）结合，实现更精准的治疗。最后，显微CT技术已逐步与病理学整合，例如空间组学和成像组织学，从而更动态地追踪肺结节的变化过程^36,37。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
A/J 小鼠	GemPharmatech LLC.	N000018
0.5 mL EDTA 管	Labshark	130201070
1-丁酮,4-(甲基亚硝基氨基)-1-(3-吡啶基)	Gu Shi Gong Yuan 医疗设备有限公司	N589770
75% 乙醇	成都 chron 化学品有限公司	2023052901
动物剃毛器	Codos	BM010220
异氟烷	深圳 Reward Life 科技有限公司	R510-22-16
医用三录仪	MedChemexpress	69652
Quantum GX2 微型CT成像系统	PerkinElme	2020166501
生理盐水（药品）	北京 Biolabs 技术有限公司	GL1736‌