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方法文章

从兔肌肉中纯化肌质网-内质网 Ca2+-ATP 酶

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DOI：

10.3791/67748

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2025年3月21日

1Instituto de Física, Universidad Autónoma de San Luis Potosí

本文内容

摘要

本方案描述了一种改进的SERCA纯化方法，该方法在最终的离心步骤中加入了二糖海藻糖。这种碳水化合物可在严苛条件下稳定蛋白质。所获得的纯化SERCA具有催化活性且纯度高，适用于结构与功能研究。

摘要

某些P型ATP酶（如肌质网/内质网Ca2+-ATP酶，SERCA）本质上是不稳定的膜蛋白，在纯化过程中需要特定的理化条件，才能获得高纯度、结构完整且具有催化活性的蛋白。二糖海藻糖是一种相容性溶质，可在酵母细胞质中合成并积累至高浓度，以稳定膜结构和蛋白质。在质膜H+-ATP酶的纯化方案中添加海藻糖，可获得高质量的蛋白样品，生化分析方法证实其呈六聚体结构。因此，海藻糖可作为稳定添加剂用于膜蛋白（P-ATP酶）的纯化。本方案描述了对经典SERCA纯化方法的改进，即在海藻糖浓度梯度中对SERCA进行离心。加入该碳水化合物后，成功获得了高纯度、催化活性良好且尤为重要的稳定构象的SERCA蛋白。对纯化后的SERCA进行部分生化表征（SDS-PAGE、酶动力学、FITC标记、圆二色光谱）表明，该酶适用于功能与结构研究。建议在P型ATP酶及其他不稳定膜蛋白（和胞质蛋白）的纯化方案中使用海藻糖。

引言

膜蛋白/酶是细胞的基本生物组分，因其在多种生命过程中发挥关键作用1,2,3。这些功能可能包括离子和分子在细胞或细胞内区室间的进出运输（主动或被动运输）、细胞间识别、细胞间结合、锚定/附着，以及在正常和严苛的物理化学条件（如高盐、低水、高温、耐药性等）下，通过与信号转导机制的整合来感知外部环境3 因此，测定膜蛋白和/或酶的三维（3D）结构在基础与应用研究中均具有重要意义4,7,6。尤为重要的是，膜蛋白/酶已被广泛用作药物发现的靶点（无论是天然存在还是理性设计）7,8,9。也就是说，膜蛋白在健康相关领域具有固有的重要性9,10,11。

膜蛋白/酶的疏水性是实验室内最具技术挑战性的理化性质12,13,14，尤其是在处理寡聚态和/或高度不稳定的整合膜蛋白时更为突出15,16。获得足量且尽可能高纯度的膜蛋白/酶，以用于功能实验分析和结构研究，是十分理想的目标17。由于膜蛋白本质上具有疏水性，因此纯化难度很大，而去垢剂的选择通常是需要考虑的最重要因素之一17,18,19,20。在此方面，用于分离膜蛋白的实验室方法通常会对蛋白质的三维结构排列造成一定程度的破坏21。这些方法包括：(a) 超声处理（高频/高能超声波），(b) 蛋白质增溶性去垢剂（剧烈、中等或温和型）22，(c) 柱层析中的相对高压和高速超速离心23，(d) 沉淀分子，(e) 消化酶，以及其他方法21。所有这些过程都可能促成或成为纯化过程中蛋白质失稳的主要原因21。在这方面，某些方案对特定膜蛋白可能表现相对良好。然而，当采用新的现代检测方法或需要更高品质膜蛋白制备物才能获得满意结果时，优化始终是必要的24。优化步骤可能包括但不限于：改进构建设计、寻找膜蛋白表达的最佳条件、建立更优的操作条件（如pH、温度等）、筛选最适配的去垢剂、调整纯化步骤（如超声时间、离心速度）、通过添加稳定剂重新配制缓冲液等25,26,27。因此，任何能够提高纯化后膜蛋白/酶质量（纯度）和活性的纯化方法改进都具有重要意义。

在P型ATP酶家族中，酵母质膜H+-ATP酶似乎是其中最不稳定的成员之一28,29。H+-ATP酶在脱水（冷冻干燥）、热激等条件下会丧失其ATP水解活性28,29。已有研究在从酵母K. lactis分离质膜H+-ATP酶的过程中测试了海藻糖作为蛋白质稳定剂的应用效果30,31；所获得的H+-ATP酶制剂纯度高且具有催化活性。重要的是，这使得可通过生化方法解析该酶的寡聚状态，结果显示其为六聚体，并随后通过冷冻电子显微镜技术得以证实31,32,33,34,35。因此，在纯化过程中相对剧烈的条件可能导致膜蛋白精细的三维（3D）结构遭到破坏36。H+-ATP酶在热诱导失活过程中表现出双相失活动力学特征29。在酵母细胞中，如同许多其他生物体一样，二糖海藻糖在环境胁迫条件下会大量积累37,38,39。海藻糖通过稳定蛋白质（包括膜整合蛋白和胞质蛋白）以及细胞膜，维持膜的完整性和转运功能40,41。海藻糖的稳定机制已被多个研究团队及本实验室广泛研究42,43,44,45。针对H+-ATP酶及其他酶的实验表明，在单糖和二糖中，海藻糖是最有效的蛋白质稳定剂28,29。这促使研究人员将其纳入H+-ATP酶的纯化流程中30。最近，海藻糖也被成功用于从兔快肌中纯化肌浆网Ca2+-ATP酶（SERCA），获得了较高的蛋白纯度和活性46。因此，海藻糖似乎是纯化P型ATP酶以及可能的其他膜蛋白和胞质蛋白的一种良好且合适的添加剂。

对于P型ATP酶而言，其具有结构化的胞质域是一个实验优势，尤其有利于底物/配体相互作用的研究47；ATP结合已在高度纯化的重组N端结构域中得到研究47,48,49，从而避免了对完整膜蛋白酶进行纯化时所需考虑的技术难题47,48,50，以及其他相关问题51。然而，某些功能（催化/能量转换）和结构（亚基排列及与其他蛋白质的相互作用）研究仍需使用完整的P型ATP酶52,53。在这方面，已有多个研究团队成功实现了SERCA的纯化54,55,56,57,58。然而，仍可进一步优化纯化方法46，例如提高所纯化ATP酶的完整性59，避免蛋白质变性或蛋白复合物的破坏25，在不引起膜蛋白变性的前提下提高溶解度（即避免大分子聚集体的形成）60，并提升与后续检测及其他分析方法的兼容性61 此外，随着科学文献中不断出现新的实验策略、添加剂、酶抑制剂等61,62,63,64,65,66，这些新方法 有时需要在完整的P型ATP酶体系中进行测试。本研究描述了SERCA的纯化方案，并介绍了海藻糖作为添加剂在稳定蛋白质结构和ATP酶活性中的应用；即除了提高酶的结构质量外，海藻糖还有助于防止酶在分离和储存过程中结构与活性的丧失，从而节约生物材料，减少酶纯化的次数。

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方案

所有动物实验操作均依照国际及当地（墨西哥官方标准 NOM-062-ZOO-1999）关于实验动物实验室操作指南进行51,67,68. 从野生型小鼠获取肌肉组织 Oryctolagus cuniculus 来自当地动物管理单位（INE/CITES/DGVS-ZOO-E0055-SLP-98）46由一位精通实验动物管理的兽医完成了初始的肌肉解剖与处理工作。本研究中所用试剂和设备的详细信息列于下文 材料表.

1. 快肌型兔骨骼肌肌浆网的分离（耗时，7 - 9 小时）

注意：有关该实验步骤的详细信息，请参见 Champeil 等人69。

  1. 从野生型 Oryctolagus cuniculus 的后肢获取快肌组织（每只动物约 70 g）。
    注意：在解剖前需对目标肌肉进行视觉识别70,71。
  2. 将快肌组织悬浮于三倍体积的 100 mM KCl 溶液中，使用搅拌器进行匀浆处理，每次运行 1 分钟，随后在冰上静置 1 分钟，重复此过程三次72。
  3. 在 4 °C 条件下以 1500 × g 离心 5 分钟，去除组织碎片；如有必要，可进行第二次离心（4200 × g）。
  4. 收集上清液，并使用组织研磨器进行匀浆（低速研磨 10 次，即 500–1,500 rpm）72,73。将匀浆液在 4 °C 条件下以 10,000 × g 离心 15 分钟。
    注意：匀浆过程中需格外小心，因使用相对较高的转速可能导致系统损坏或对操作人员造成伤害。
  5. 将上清液（含肌浆网组分）在 4 °C 条件下以 33,000 × g 离心 120 分钟。
  6. 将沉淀物重悬于 40 mL 的 0.5 M 蔗糖溶液中，在 4 °C 条件下以 12,000 × g 离心 15 分钟。将上清液稀释（含 0.6 M KCl 和 0.15 M 蔗糖），并将该悬液在 4 °C 条件下以 34,000 × g 离心 165 分钟。
  7. 将含有肌浆网小泡（SRVs）片层的沉淀物重悬于含 0.3 M 蔗糖、0.1 M KCl 和 5 mM Tris-HCl（pH 7.0）的溶液中。采用 Lowry 法测定蛋白浓度74，并以人血清白蛋白作为蛋白标准品。
  8. 将 SRVs 分装为每份 1 mL（浓度为 30–32 mg/mL）。将 SRVs 样品储存于 -72 °C，以备后续使用。
    注意：每只动物可获得蛋白产量为 100–110 mg SRVs。

2. SERCA 的纯化（用时，18 - 20 小时）

注意：有关该实验步骤的详细信息，请参见 Rivera-Morán 等人46。

  1. 将SRVs悬液用预冷的75 mM Tris-HCl（pH 7.2）、0.6 M KCl、6 mM EDTA、1 mM EGTA和0.1%（w/v）脱氧胆酸钠（DOC）稀释至2 mg蛋白/mL。将SRVs悬液置于冰上孵育10分钟，并轻柔振荡。在4 °C下以100,000 × g离心60分钟。
    注意：DOC应逐滴加入。
  2. 将沉淀物重悬于<3 mL的25 mM Tris-HCl（pH 7.5）、0.3 M KCl、45%甘油（v/v）和2 mM EDTA中。匀浆后调节终体积至10 mL。测定蛋白浓度，然后将其调至6.5 mg/mL。加入卵磷脂至终浓度5 mg/mL，并加入0.85（w/w）两性离子去污剂Zwittergent 3-14。
    注意：卵磷脂和Zwittergent 3-14应逐滴加入。
  3. 充分匀浆悬液，并在4 °C下以100,000 × g离心60分钟。收集上清液，用2 mM EGTA（pH 7.2）按1:2比例稀释。
  4. 将悬液缓慢铺在含有45%、40%、35%和30%（w/v）海藻糖浓度梯度的不连续梯度溶液上，梯度溶液成分为10 mM Tris-HCl（pH 7.0）、1 mM EDTA、0.1%脱氧胆酸钠和1 mg/mL卵磷脂。在4 °C下以100,000 × g离心14小时。收集试管底部形成的透明微黄色沉淀物。
    注意：海藻糖梯度的制备和样品悬液的加样均需采用适当技术操作。建议进行过夜离心。
  5. 将沉淀物用少量体积（<1.5 mL）的25 mM Tris-HCl（pH 7.5）、0.3 M KCl、45%甘油和2 mM EDTA轻柔重悬。测定蛋白浓度，并通过稀释调节至2 mg/mL。取等分试样（约50 µL），将纯化的SERCA于−72 °C保存备用。
  6. 对纯化的SERCA72以及纯化过程中不同步骤采集的蛋白样品进行SDS-PAGE分析，并用考马斯亮蓝72染色凝胶。
    注意：在悬液缓冲液中使用0.6 M海藻糖替代甘油可提高酶在储存及冻融循环过程中的稳定性28,29。

3. ATP酶活性检测（用时，1 - 2 小时）

  1. 酶偶联测定法：ATP酶-丙酮酸激酶-乳酸脱氢酶
    1. 配制反应混合液（1 mL）：50 mM MOPS（pH 7.0）、1 mM EGTA、80 mM KCl、5 mM MgCl2、3 mM CaCl2、5 mM 磷酸烯醇式丙酮酸、250 µM NADH。加入不同浓度的ATP（0.001 至 0.25 mM）。
    2. 通过涡旋充分混匀反应体系。将反应体系在37 ◦C下孵育10分钟。加入0.9 U L-乳酸脱氢酶（LDH）和1.5 U 丙酮酸激酶（PK）。
    3. 通过加入10 µg SERCA启动ATP酶反应。
    4. 测定NADH的生成量。使用带有恒温比色皿池的分光光度计，在340 nm波长下每隔1秒监测600秒内吸光度随时间的变化。
      注：吸光度测定的时间间隔可调整，但应尽可能记录更多数据点，以准确绘制ATP酶反应初始阶段的直线部分。
  2. 测定ATP水解速率
    注：有关实验步骤的详细信息，请参见Rivera-Morán等人的研究46。
    1. 计算每条曲线中线性部分的斜率值（Δabs/min）。利用NADH的摩尔消光系数（ε）（λ = 6,220 M−1·cm−1）计算ATP酶活性（µmol ATP水解/min·mg蛋白）。
  3. 测定动力学参数 Km 和 Vmax
    1. 使用数据分析与绘图软件，将反应速率数据对ATP浓度作图。
    2. 采用非线性回归将数据拟合至米氏方程（公式1）46：
      米氏方程：v=Vmax·S/(Km+S)，酶动力学公式，生化分析
      其中 v 为反应速率，Vmax 为最大反应速率，[S] 为ATP浓度，Km 为米氏常数。
    3. 通过迭代法确定 Km 和 Vmax。
      注：加入DOC可能提高ATP酶反应速率；建议测试不同浓度的DOC以确定最佳浓度。

4. 使用异硫氰酸荧光素（FITC）对肌浆网钙ATP酶（SERCA）进行标记实验（耗时：30–45分钟，仅适用于FITC标记）

注意：有关该操作步骤的详细信息，请参见54,75,76。

  1. 将 SERCA（20 µg）悬浮于 50 µL（终体积）标记缓冲液（含 100 mM KCl、5 mM MgCl2 和 30 mM Tris-HCl，pH 8.9）中，其中加入 1 mM FITC。通过涡旋混合。
  2. 在避光、室温条件下，将样品分别孵育不同时间（15 分钟、10 分钟、7 分钟、5 分钟和 2 分钟）。
  3. 加入等体积的冰上预冷的终止缓冲液（含 480 mM 蔗糖和 48 mM MOPS，pH 7.0），其中加入 ATP（5 mM），以终止标记反应。在冰上避光孵育 5 分钟。
  4. 将 FITC 标记的 SERCA 进行 SDS-PAGE72 分析。将透明凝胶暴露于紫外光（λ = 302 nm）下，并拍照记录结果。
  5. 用考马斯亮蓝染色凝胶，并拍照记录结果。
    注意：在暗室中进行 FITC 标记可能有助于提高荧光信号的质量。

5. 圆二色性（CD）光谱（用时，30 分钟）

注意：有关该操作步骤的详细信息，请参见11,77。

  1. 将SERCA（3 µM）悬浮于400 µL、pH 7.0的10 mM磷酸缓冲液中，25 °C下孵育。
  2. 将样品装入光程为0.1 cm的比色皿中。设定远紫外圆二色光谱的波长范围为190–260 nm，分辨率和带宽均设为1 nm。
  3. 在25 °C下，以50 nm/min的扫描速度记录圆二色（CD）信号。

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结果

不同纯化阶段 SERCA 的 SDS-PAGE 分析（图1)。考马斯亮蓝染色凝胶显示 SERCA 蛋白条带的富集（表观分子量 >100 kDa）随着纯化流程的推进。对应于SERCA的蛋白条带显示出的纯度为 >经海藻糖浓度梯度离心后，回收率为90%。ATP水解速率图 与 ATP浓度（图 2A)。纯化的SERCA表现出米氏ATP酶动力学特征（双曲线模式）。数据的林-伯氏作图显示 图2A (图2B）。在图中， Km SERCA 的值（10 µM）是从 x-截距（Km-1），这与之前研究中发现的结果相似25,78,

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讨论

大多数分子和离子无法自由穿过细胞膜，例如质子（H+）需要多种生物体和细胞器（如线粒体）的质膜上的膜转运蛋白才能通过83,84。细胞膜具有选择性，能够跨膜运输的分子和离子种类多样，因此细胞中存在多种类型的膜蛋白，例如（a）ABC转运蛋白、（b）离子通道、（c）膜结合ATP酶、（d）SLC转运蛋白以及（e）水通道5。在结构生物学中，获取酶/转运蛋白在功能（催化）循环各个阶段的三维构象已成为一个关键问题85,86。也就是说，深入了解酶的功能性结构特征对于阐明其催化机制至关重要5,87,88,89

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披露

作者声明其不存在竞争性经济利益。

致谢

作者感谢Edmundo Mata-Morales在视频编辑方面的帮助，VM，Valentín de la Cruz-Torres在SRV纯化方面的工作，Miguel A. Rivera-Moran在SERCA纯化与分析方面的贡献，以及Juan C. Gonzalez-Castro、Franco E. Juarez、Alejandra Nevarez、Nicolas Rocha-Vizuet和Jocelin I. Ramírez-Alonso在视频制作中的协助。本研究未获得任何资金、资助或其他支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
ATPSigma-Aldrich CorpA2383
大豆来源的偶氮染料卵磷脂Sigma-Aldrich Corp44924
台式紫外透射仪 Cole-ParmerEW-97623-08双强度设置中的高亮度模式适用于分析性文档记录，低亮度模式可在进行制备操作时减少凝胶样品的光击穿或光漂白。
CaCl2 • 2H2OSigma-Aldrich Corp223506
Coolpix B500 相机 Nikon CorpS210
考马斯亮蓝 G-250Bio-Rad1610406
十二烷基麦芽糖苷Sigma-Aldrich CorpD4641
乙二醇双(2-氨基乙基醚)-N,N,N′,N′-四乙酸Sigma-Aldrich CorpE4378
乙二胺四乙酸四钠盐二水合物 Sigma-Aldrich CorpE6511
异硫氰酸荧光素Sigma-Aldrich CorpF3651
KClJT Baker7447-40-7
MgCl2 • 6H2OSigma-Aldrich CorpM9272
MOPSSigma-Aldrich CorpM1254
NADHChem-Impex International Inc230
N-十四烷基-N,N-二甲基-3-氨丙基磺酸盐Sigma-Aldrich CorpD0431
磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）Chem-Impex International Inc9711
兔骨骼肌乳酸脱氢酶Roche10003557103
兔骨骼肌丙酮酸激酶Sigma-Aldrich CorpP1506
脱氧胆酸钠Sigma-Aldrich CorpD6750
十二烷基硫酸钠Bio-Rad1610302
光谱偏振仪 Jasco Corp.Jasco J1500 
蔗糖Sigma-Aldrich Corp84100
海藻糖Sigma-Aldrich CorpT0167二水合物
三（羟甲基）氨基甲烷盐酸盐Sigma-Aldrich Corp857645
超速离心机BeckmanOptima XPN
紫外/可见光分光光度计 Agilent Technologies8453安捷伦 8453 紫外-可见分光光度计采用光电二极管阵列，可同时测量完整的紫外至可见光光谱
WiseStir HS-30EDaihan Scientific Co.DH.WOS01010适用于所有分散和均质化应用，专为组织研磨器设计。

参考文献

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