从兔肌肉中纯化肌质网-内质网 Ca2+-ATP 酶

摘要

本方案描述了一种改进的SERCA纯化方法，该方法在最终的离心步骤中加入了二糖海藻糖。这种碳水化合物可在严苛条件下稳定蛋白质。所获得的纯化SERCA具有催化活性且纯度高，适用于结构与功能研究。

摘要

某些P型ATP酶（如肌质网/内质网Ca²⁺-ATP酶，SERCA）本质上是不稳定的膜蛋白，在纯化过程中需要特定的理化条件，才能获得高纯度、结构完整且具有催化活性的蛋白。二糖海藻糖是一种相容性溶质，可在酵母细胞质中合成并积累至高浓度，以稳定膜结构和蛋白质。在质膜H⁺-ATP酶的纯化方案中添加海藻糖，可获得高质量的蛋白样品，生化分析方法证实其呈六聚体结构。因此，海藻糖可作为稳定添加剂用于膜蛋白（P-ATP酶）的纯化。本方案描述了对经典SERCA纯化方法的改进，即在海藻糖浓度梯度中对SERCA进行离心。加入该碳水化合物后，成功获得了高纯度、催化活性良好且尤为重要的稳定构象的SERCA蛋白。对纯化后的SERCA进行部分生化表征（SDS-PAGE、酶动力学、FITC标记、圆二色光谱）表明，该酶适用于功能与结构研究。建议在P型ATP酶及其他不稳定膜蛋白（和胞质蛋白）的纯化方案中使用海藻糖。

引言

膜蛋白/酶是细胞的基本生物组分，因其在多种生命过程中发挥关键作用^1,2,3。这些功能可能包括离子和分子在细胞或细胞内区室间的进出运输（主动或被动运输）、细胞间识别、细胞间结合、锚定/附着，以及在正常和严苛的物理化学条件（如高盐、低水、高温、耐药性等）下，通过与信号转导机制的整合来感知外部环境³ 因此，测定膜蛋白和/或酶的三维（3D）结构在基础与应用研究中均具有重要意义^4,7,6。尤为重要的是，膜蛋白/酶已被广泛用作药物发现的靶点（无论是天然存在还是理性设计）^7,8,9。也就是说，膜蛋白在健康相关领域具有固有的重要性^9,10,11。

方案

所有动物实验均按照国际和当地（墨西哥官方标准 NOM-062-ZOO-1999）关于实验动物实验室操作的指南进行^51,67,68。肌肉组织取自当地动物管理单位（INE/CITES/DGVS-ZOO-E0055-SLP-98）提供的野生型 Oryctolagus cuniculus⁴⁶。由一位具有实验动物管理经验的兽医完成初始的肌肉解剖与处理。本研究中所用试剂和设备的详细信息列于材料表中。

1. 快肌型兔骨骼肌肌浆网的分离（耗时，7 - 9 小时）

注意：有关该实验步骤的详细信息，请参见 Champeil 等人⁶⁹。

1. 从野生型 Oryctolagus cuniculus 的后肢获取快肌组织（每只动物约 70 g）。
   注意：需预先对拟解剖的肌肉进行视觉识别^70,71。
2. 将快肌....

结果

不同纯化阶段SERCA的SDS-PAGE分析（图1)。考马斯亮蓝染色凝胶显示SERCA蛋白条带的富集（表观分子量 >100 kDa）随着纯化步骤的推进而变化。对应于SERCA的蛋白条带显示其纯度达到 >90% 在海藻糖浓度梯度离心后。ATP 水解速率图 与 ATP浓度（图2A)。纯化的SERCA表现出米氏ATP酶动力学特征（双曲线模式）。数据的双倒数作图（Lineweaver-Burk图） 图2A (图2B）。在图中，横轴与纵轴分别表示 K_m SERCA 的值（10 µM）来自 x-截距（K_m^-1），这与以往研究中发现的结果相似^25,78.......

讨论

大多数分子和离子无法自由穿过细胞膜，例如质子（H⁺）需要多种生物体和细胞器（如线粒体）的质膜上的膜转运蛋白才能通过^83,84。细胞膜具有选择性，能够跨膜运输的分子和离子种类多样，因此细胞中存在多种类型的膜蛋白，例如（a）ABC转运蛋白、（b）离子通道、（c）膜结合ATP酶、（d）SLC转运蛋白以及（e）水通道⁵。在结构生物学中，获取酶/转运蛋白在功能（催化）循环各个阶段的三维构象已成为一个关键问题^85,86。也就是说，深入了解酶的功能性结构特征对于阐明其催化机制至关重要^5,87,88,89

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
ATP	Sigma-Aldrich Corp	A2383
大豆来源的偶氮染料卵磷脂	Sigma-Aldrich Corp	44924
台式紫外透射仪	Cole-Parmer	EW-97623-08	双强度设置中的高亮度模式适用于分析性文档记录，低亮度模式可在进行制备操作时减少凝胶样品的光击穿或光漂白。
CaCl2 • 2H2O	Sigma-Aldrich Corp	223506
Coolpix B500 相机	Nikon Corp	S210
考马斯亮蓝 G-250	Bio-Rad	1610406
十二烷基麦芽糖苷	Sigma-Aldrich Corp	D4641
乙二醇双(2-氨基乙基醚)-N,N,N′,N′-四乙酸	Sigma-Aldrich Corp	E4378
乙二胺四乙酸四钠盐二水合物	Sigma-Aldrich Corp	E6511
异硫氰酸荧光素	Sigma-Aldrich Corp	F3651
KCl	JT Baker	7447-40-7
MgCl2 • 6H2O	Sigma-Aldrich Corp	M9272
MOPS	Sigma-Aldrich Corp	M1254
NADH	Chem-Impex International Inc	230
N-十四烷基-N,N-二甲基-3-氨丙基磺酸盐	Sigma-Aldrich Corp	D0431
磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）	Chem-Impex International Inc	9711
兔骨骼肌乳酸脱氢酶	Roche	10003557103
兔骨骼肌丙酮酸激酶	Sigma-Aldrich Corp	P1506
脱氧胆酸钠	Sigma-Aldrich Corp	D6750
十二烷基硫酸钠	Bio-Rad	1610302
光谱偏振仪	Jasco Corp.	Jasco J1500
蔗糖	Sigma-Aldrich Corp	84100
海藻糖	Sigma-Aldrich Corp	T0167	二水合物
三（羟甲基）氨基甲烷盐酸盐	Sigma-Aldrich Corp	857645
超速离心机	Beckman	Optima XPN
紫外/可见光分光光度计	Agilent Technologies	8453	安捷伦 8453 紫外-可见分光光度计采用光电二极管阵列，可同时测量完整的紫外至可见光光谱
WiseStir HS-30E	Daihan Scientific Co.	DH.WOS01010	适用于所有分散和均质化应用，专为组织研磨器设计。