本研究介绍了一种提取和制备保留荧光信号的透明化全脑与脊髓样本的实验方案，可提高实验效率和数据完整性，从而推动神经科学研究的发展。
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本文内容
摘要
摘要
以中枢神经系统为重点的神经科学研究需要深入理解多种因素，包括细胞分布、神经元连接性以及分子动态。传统研究全脑和脊髓的方法通常涉及组织切片的分离、切片和扫描，随后进行耗时的三维图像重建过程。这种传统方法既耗时又繁琐。组织透明化和全器官成像技术的进步已彻底改变了对全脑和脊髓的分析方式。为了充分发挥这些创新方法的潜力，关键在于在保持脑组织与脊髓连接的前提下提取并透明化脑样本。本实验方案提供了连接脊髓的脑组织样本制备的详细且系统化的操作指南，涵盖了样本提取与透明化处理的完整流程。通过优化这些步骤，该方法显著提高了实验效率和数据完整性，从而推动神经科学研究的发展，实现对中枢神经系统复杂性的更全面探究。
引言
精确绘制和分析神经分布可为中枢神经系统的结构与功能组织提供有价值的见解，有助于开发创新的治疗策略，并加深我们对神经机制的整体理解。目前，尚缺乏全面的视频教程来指导研究人员制备与脊髓相连的脑组织样本并成功实现组织透明化。
目前有多种组织透明化方法可供选择：疏水性、亲水性、基于水凝胶以及组织扩张的透明化方法1,2,3。组织透明化技术已广泛应用于脾脏4、肺脏5、腓肠肌6、脑7、脊髓8和肾脏9等器官的研究中。本实验方案将详细介绍如何制备来自STOCK Tg (Thy1-EGFP) MJrs/J品系小鼠的、经荧光标记且与脊髓相连的全脑样本，提供从样本取出到透明化处理的分步操作指导，所采用的透明化试剂为基于亲水性的组织透明化试剂盒。本方案有助于研究人员掌握从脑-脊髓样本提取、制备到后续成像的完整流程，不仅可提高实验效率，还能保障样本的完整性和质量，从而为神经科学研究提供更准确、可靠的数据支持。
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方案
所有动物实验均按照《活体动物实验研究报告指南》（Animal Research Reporting In Vivo Experiments, ARRIVE）以及美国国立卫生研究院《实验动物护理与使用指南》进行。本研究经上海交通大学医学院仁济医院动物护理与使用委员会批准。本研究采用7-8周龄的STOCK Tg (Thy1-EGFP) MJrs/J品系雄性小鼠（C57BL/6J × CBA背景），动物购自商业供应商（见 材料表）并饲养于标准笼具中（22 °C ± 2 °C，12 h/12 h 光照/黑暗循环，食物和水 随意摄取).
1. 灌注
- 使用1 mL注射器经腹腔注射戊巴比妥钠（0.5%溶于无菌蒸馏水中，剂量为50 mg/kg，i.p，参见材料表）对成年小鼠进行深度麻醉。通过夹捏足趾观察有无反应，以检查麻醉深度。
- 用钢夹将小鼠四肢固定在白色丙烯酸板上。剪开小鼠两侧股骨之间的皮肤，并向上延伸剪切至横膈膜。用剪刀和直镊沿横膈膜剪开胸腔两侧，暴露心脏。
- 将一支0.7 mm的灌注针插入左心室。在右心耳处做1–2 mm的切口。
- 使用蠕动泵（参见材料表）以10 mL/min的速度灌注含10 U/mL肝素钠的1×PBS，彻底清除血液。当肝脏完全变为苍白色时....
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结果
本方案成功分离了与脊髓相连的完整脑组织，样本来源于 STOCK Tg (Thy1-EGFP) MJrs/J 品系雄性小鼠。同时，该方法使样本透明化，确保荧光信号得以完整保存和捕获，从而获得清晰且详细的图像，维持了原始荧光的完整性。
图1 显示了一个完整的大脑-脊髓标本，表明本方案中所述的解剖步骤具有高度精确性。此外，组织透明化处理也准确完成，获得了透明的样本，能够清晰呈现复杂的神经结构。进一步地，图2 显示带有荧光信号成像的大脑-脊髓样本保存状况极佳，提供了清晰且详细的图像，完整保留了原始荧光的特性。图3 展示了图2 中所示单个细胞的高倍放大图像。
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讨论
本实验方案涉及使用脑部与标记有荧光神经示踪病毒的脊髓相连的小鼠。该方案提供了制备保持与脊髓相连的完整脑组织样本的全面且详细的步骤说明。方案中细致地描述了每一步操作，以确保研究人员能够精确地重复该过程。
该方案中有多个关键步骤有助于提高透明化和成像的质量。完整地提取与脊髓相连的全脑样本是一项重要任务。保持脑组织和脊髓的完整性对于准确的神经示踪和后续分析至关重要。在采集样本过程中，切口或表面损伤可能在后续透明化过程中加剧，从而导致不可预测的组织损伤。为确保样本的完整性，必须使用材料清单中指定的弯头剪刀和解剖镊进行精细取样。将脑-脊髓样本用缝线固定在固定板上，是防止其在液体中因重力、压力或其他因素引起变形的关键步骤。
以往的研究通常仅集中于脑或脊髓8的结构与功能。然而，中枢神经系统是以一个整体协同运作的。信号从脑向下传递，以及外周信号通过脊髓向上传递至高级中枢的过程十分复杂。获取完整的脑-脊髓样本有助于深入研究这些信号的整合机制。
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披露
作者声明无竞争利益。
致谢
国家自然科学基金（项目编号：82101249 和 82471204，授予孙XY）；中国博士后科学基金（项目编号：2022M722125，授予孙XY）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1 ml 注射器 | 山东威高集团医用高分子制品股份有限公司 | ||
| 502 胶水 | 得力集团 | ||
| BD 胰岛素注射器 | Becton, Dickinson and Company | 328421 | |
| 弯齿解剖镊 | 金钟 | JD1050 | |
| 圆形钢夹 | 威利 | ||
| 精细剪刀 | 金钟 | y00030 | |
| 带齿弯止血钳 | 金钟 | J31020 | |
| 带齿直止血钳 | 金钟 | J31010 | |
| 输液针 0.7mm | 康乐集团 | ||
| 光源箱刻度线 | 诺海生命科学 | NH210901 | |
| 显微解剖直镊 | 金钟 | WA3020 | |
| NobeliumSoftware | 诺海生命科学 | 扫描软件 | |
| 多聚甲醛 | 碧硕 | BL539A | |
| 蠕动泵 | 诺海生命科学 | NH1000 | |
| 蠕动泵头 | 诺海生命科学 | NH-15 | |
| 磷酸盐缓冲液 | 赛维尔生物 | G4202 | |
| 肝素钠 | 上海医药 | H31022051 | |
| STOCK Tg (Thy1-EGFP) MJrs/J 品系小鼠 | Jackson Laboratory | 007788 | |
| 直齿解剖镊 | 金钟 | JD1060 | |
| 组织透明试剂盒（亲水性） | 诺海生命科学 | NH-CR-210701 | |
| 组织培养皿 100mm x 20mm | NEST | 704001 | |
| 组织剪刀 | 金钟 | J21040 | |
| 戊巴比妥钠 | Sigma-Aldrich | P3761 | |
| 金星剪刀 | 金钟 | YBC010 |
参考文献
- Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nat Rev Neurosci. 21 (2), 61-79 (2020).
- Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-b....
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重印与许可
