本研究介绍了一种提取和制备保留荧光信号的透明化全脑与脊髓样本的实验方案，可提高实验效率和数据完整性，从而推动神经科学研究的发展。
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本文内容
摘要
摘要
以中枢神经系统为重点的神经科学研究需要深入理解多种因素，包括细胞分布、神经元连接性以及分子动态。传统研究全脑和脊髓的方法通常涉及组织切片的分离、切片和扫描，随后进行耗时的三维图像重建过程。这种传统方法既耗时又繁琐。组织透明化和全器官成像技术的进步已彻底改变了对全脑和脊髓的分析方式。为了充分发挥这些创新方法的潜力，关键在于在保持脑组织与脊髓连接的前提下提取并透明化脑样本。本实验方案提供了连接脊髓的脑组织样本制备的详细且系统化的操作指南，涵盖了样本提取与透明化处理的完整流程。通过优化这些步骤，该方法显著提高了实验效率和数据完整性，从而推动神经科学研究的发展，实现对中枢神经系统复杂性的更全面探究。
引言
精确绘制和分析神经分布可为中枢神经系统的结构与功能组织提供有价值的见解，有助于开发创新的治疗策略，并加深我们对神经机制的整体理解。目前，尚缺乏全面的视频教程来指导研究人员制备与脊髓相连的脑组织样本并成功实现组织透明化。
目前有多种组织透明化方法可供选择：疏水性、亲水性、基于水凝胶以及组织扩张的透明化方法1,2,3。组织透明化技术已广泛应用于脾脏4、肺脏5、腓肠肌6、脑7、脊髓8和肾脏9等器官的研究中。本实验方案将详细介绍如何制备来自STOCK Tg (Thy1-EGFP) MJrs/J品系小鼠的、经荧光标记且与脊髓相连的全脑样本，提供从样本取出到透明化处理的分步操作指导，所采用的透明化试剂为基于亲水性的组织透明化试剂盒。本方案有助于研究人员掌握从脑-脊髓样本提取、制备到后续成像的完整流程，不仅可提高实验效率，还能保障样本的完整性和质量，从而为神经科学研究提供更准确、可靠的数据支持。
与传统的切片、成像及三维重建方法10,11相比，本文所介绍的方法具有若干关键优势，包括：（1）增强的结构完整性：通过保持整个器官的结构，该方法降低了因切片而导致关键信息丢失的风险12；（2）全面的数据获取：使用组织透明化试剂盒可实现对细胞的精细定位，这是传统技术难以达到的；（3）高效性与准确性：该方案简化了从样本提取到成像的整个流程，缩短了免疫组织化学或染色程序所需的时间，并减少了与切片和封片相关的误差13。
该方案克服了传统切片方法的局限性，传统方法常导致数据不完整和碎片化。通过保持完整的大脑-脊髓连接，并结合现代组织透明化技术，本方案提供了对中枢神经系统的更全面观察，这对于理解复杂的神经机制和功能至关重要。该方法的主要目标是通过制备与脊髓相连且已标记荧光神经元标记物的全脑样本，实现对中枢神经系统的全面成像。本方案旨在利用先进的解剖学方法和组织透明化技术，促进对神经结构和细胞分布的精细可视化。
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方案
所有动物实验均按照《活体动物实验研究报告指南》（Animal Research Reporting In Vivo Experiments, ARRIVE）以及美国国立卫生研究院《实验动物护理与使用指南》进行。本研究经上海交通大学医学院仁济医院动物护理与使用委员会批准。本研究采用7-8周龄的STOCK Tg (Thy1-EGFP) MJrs/J品系雄性小鼠（C57BL/6J × CBA背景），动物购自商业供应商（见 材料表）并饲养于标准笼具中（22 °C ± 2 °C，12 h/12 h 光照/黑暗循环，食物和水 随意摄取).
1. 灌注
- 使用1 mL注射器经腹腔注射戊巴比妥钠（0.5%溶于无菌蒸馏水中，剂量为50 mg/kg，i.p，参见材料表）对成年小鼠进行深度麻醉。通过夹捏足趾观察有无反应，以检查麻醉深度。
- 用钢夹将小鼠四肢固定在白色丙烯酸板上。剪开小鼠两侧股骨之间的皮肤，并向上延伸剪切至横膈膜。用剪刀和直镊沿横膈膜剪开胸腔两侧，暴露心脏。
- 将一支0.7 mm的灌注针插入左心室。在右心耳处做1–2 mm的切口。
- 使用蠕动泵（参见材料表）以10 mL/min的速度灌注含10 U/mL肝素钠的1×PBS，彻底清除血液。当肝脏完全变为苍白色时，表明血液已清除完全。
- 使用蠕动泵以10 mL/min的速度灌注50 mL预冷的4%多聚甲醛（PFA）。观察小鼠尾巴卷曲和肌肉抽搐等现象。
注意：灌注失败可能影响后续的透明化处理。尾巴卷曲和肌肉抽搐是正常灌注的表现，不代表动物恢复意识或麻醉不足。
2. 样品提取
- 使用剪刀和镊子小心解剖整个脑和脊髓，避免损伤样本。
- 用眼科剪分离小鼠背部和头部的皮肤。在两侧后肢上缘连线与脊柱相交处切断脊柱。
- 去除小鼠颈部和背部的肌肉及脂肪组织，暴露脊柱和颅骨。从椎管下端开始，沿脊柱左右两侧之间的正中裂隙使用Venus剪沿中线剪开。
- 移除已切断的脊柱上部及两侧部分，以暴露脊髓。重复上述步骤，直至到达脑连接处。
- 将Venus剪的一侧刀尖置于枕骨大孔与脑之间，沿正中矢状缝滑动并剪开颅骨。用镊子移除颅骨，暴露脑组织。
- 使用镊子和Venus剪从颅端取下小鼠脑-脊髓组织。
注意：切割或表面损伤可能在后续透明化过程中加剧，导致样本出现不可预知的损伤。请小心操作样本。 - 在体视显微镜下使用解剖镊去除脊髓膜。
- 用缝线将脑-脊髓样本固定在固定板上（见材料表）。加入至少20倍于样本体积的4%多聚甲醛（PFA），置于摇床上，在4 °C下缓慢振荡，固定过夜16–24小时。
注意：过度固定会导致蛋白质过度交联，降低透明化效率14。固定不足或延迟固定可能导致抗原降解和组织形态破坏。 - 弃去PFA溶液，用1×PBS洗涤样本3次。每次PBS体积应至少为样本体积的10倍，确保样本完全浸没。每次洗涤持续2小时，在摇床上以不低于60 rpm的速度振荡，以彻底清除残留的PFA。
3. 组织透明化
注意：此处使用了组织透明化试剂盒（参见材料表）。
- 按质量比9:1混合溶液A和溶液B，配制脱脂溶液。
注意：建议脱脂溶液的体积应超过样本体积的20倍。 - 将固定后的组织放入50 mL离心管中，并加入50 mL脱脂溶液。将离心管置于37 °C摇床中，以60 rpm轻柔振荡进行脱脂，持续3–5天，每天更换一次脱脂溶液。为判断脱脂是否完成，可将离心管置于带刻度线的透射光箱上观察。若能清晰且无畸变地透过样本看到黑色刻度线，则表明脱脂已完成。
- 将样本置于20 mL溶液C中，在25 °C下以低于60 rpm的转速振荡，进行折射率匹配。24小时后更换新的溶液C。将完全浸没于溶液C中的样本连同培养皿一起置于带刻度线的透射光箱上观察。若能清晰且无畸变地透过样本看到黑色刻度线，则表明折射率匹配已完成。
注意：成年小鼠组织的折射率匹配通常在2天内完成。
4. 组织包埋
- 在200 mL玻璃瓶中加入147 g溶液C，配制凝胶溶液，再加入3.0 g琼脂糖，充分涡旋混匀，然后微波加热至沸腾，立即关闭微波炉。将离心管转移至37 °C培养箱中，直至琼脂糖完全溶解。
注意：建议根据需要新鲜配制凝胶溶液。 - 将透明化样品置于模具中，加入深度为2 mm、温度为37 °C的凝胶溶液，随后在4 °C冰箱中冷却30分钟，直至半凝固。将折射率匹配的样品放入模具中，并加入凝胶溶液，使液面与样品顶部齐平或略低。
- 将模具放回4 °C冰箱中静置2小时。继续添加凝胶溶液，使其液面与模具表面齐平。盖上盖玻片，并在4 °C冰箱中加速凝固2小时。将包埋好的样品在4 °C冰箱中过夜保存。请尽快进行成像操作。
5. 扫描
- 用镊子取下盖玻片，取出包埋的样品。将样品放入50 mL离心管中，并加入30 mL成像溶液，确保样品完全浸没。
- 在样品上涂抹502胶水，将其牢固地粘附在样品台上。将样品台固定到成像设备上。
- 按照说明运行扫描软件。在放大倍数选项中选择4倍放大。点击校准按钮以启动校准模式。
- 点击预览按钮进入预览模式。点击Z方向移动按钮，缓慢将样品从样品腔底部向上移动，直至生成的光片穿过样品。
- 选择合适的激光通道和照明模式选项。选择样品的扫描路径方向。点击自动扫描按钮以开始采集样品图像。
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结果
本方案成功分离了与脊髓相连的完整脑组织，样本来源于 STOCK Tg (Thy1-EGFP) MJrs/J 品系雄性小鼠。同时，该方法使样本透明化，确保荧光信号得以完整保存和捕获，从而获得清晰且详细的图像，维持了原始荧光的完整性。
图1 显示了一个完整的大脑-脊髓标本，表明本方案中所述的解剖步骤具有高度精确性。此外，组织透明化处理也准确完成，获得了透明的样本，能够清晰呈现复杂的神经结构。进一步地，图2 显示带有荧光信号成像的大脑-脊髓样本保存状况极佳，提供了清晰且详细的图像，完整保留了原始荧光的特性。图3 展示了图2 中所示单个细胞的高倍放大图像。
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讨论
本实验方案涉及使用脑部与标记有荧光神经示踪病毒的脊髓相连的小鼠。该方案提供了制备保持与脊髓相连的完整脑组织样本的全面且详细的步骤说明。方案中细致地描述了每一步操作，以确保研究人员能够精确地重复该过程。
该方案中有多个关键步骤有助于提高透明化和成像的质量。完整地提取与脊髓相连的全脑样本是一项重要任务。保持脑组织和脊髓的完整性对于准确的神经示踪和后续分析至关重要。在采集样本过程中，切口或表面损伤可能在后续透明化过程中加剧，从而导致不可预测的组织损伤。为确保样本的完整性，必须使用材料清单中指定的弯头剪刀和解剖镊进行精细取样。将脑-脊髓样本用缝线固定在固定板上，是防止其在液体中因重力、压力或其他因素引起变形的关键步骤。
以往的研究通常仅集中于脑或脊髓8的结构与功能。然而，中枢神经系统是以一个整体协同运作的。信号从脑向下传递，以及外周信号通过脊髓向上传递至高级中枢的过程十分复杂。获取完整的脑-脊髓样本有助于深入研究这些信号的整合机制。
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披露
作者声明无竞争利益。
致谢
国家自然科学基金（项目编号：82101249 和 82471204，授予孙XY）；中国博士后科学基金（项目编号：2022M722125，授予孙XY）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1 ml 注射器 | 山东威高集团医用高分子制品股份有限公司 | ||
| 502 胶水 | 得力集团 | ||
| BD 胰岛素注射器 | Becton, Dickinson and Company | 328421 | |
| 弯齿解剖镊 | 金钟 | JD1050 | |
| 圆形钢夹 | 威利 | ||
| 精细剪刀 | 金钟 | y00030 | |
| 带齿弯止血钳 | 金钟 | J31020 | |
| 带齿直止血钳 | 金钟 | J31010 | |
| 输液针 0.7mm | 康乐集团 | ||
| 光源箱刻度线 | 诺海生命科学 | NH210901 | |
| 显微解剖直镊 | 金钟 | WA3020 | |
| NobeliumSoftware | 诺海生命科学 | 扫描软件 | |
| 多聚甲醛 | 碧硕 | BL539A | |
| 蠕动泵 | 诺海生命科学 | NH1000 | |
| 蠕动泵头 | 诺海生命科学 | NH-15 | |
| 磷酸盐缓冲液 | 赛维尔生物 | G4202 | |
| 肝素钠 | 上海医药 | H31022051 | |
| STOCK Tg (Thy1-EGFP) MJrs/J 品系小鼠 | Jackson Laboratory | 007788 | |
| 直齿解剖镊 | 金钟 | JD1060 | |
| 组织透明试剂盒（亲水性） | 诺海生命科学 | NH-CR-210701 | |
| 组织培养皿 100mm x 20mm | NEST | 704001 | |
| 组织剪刀 | 金钟 | J21040 | |
| 戊巴比妥钠 | Sigma-Aldrich | P3761 | |
| 金星剪刀 | 金钟 | YBC010 |
参考文献
- Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nat Rev Neurosci. 21 (2), 61-79 (2020).
- Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling. Annu Rev Cell Dev Biol. 32, 713-741 (2016).
- Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: Toward organism-level systems biology in mammals. Cell Chem Biol. 23 (1), 137-157 (2016).
- Wu, M., et al. Innervation of nociceptor neurons in the spleen promotes germinal center responses and humoral immunity. Cell. 187 (12), 2935-2951.e19 (2024).
- Liu, T., et al. Local sympathetic innervations modulate the lung innate immune responses. Sci Adv. 6 (20), eaay1497(2020).
- Qi, Y., et al. FDISCO: Advanced solvent-based clearing method for imaging whole organs. Sci Adv. 5 (1), eaau8355(2019).
- Bagnoli, S., Terzibasi Tozzini, E., Cellerino, A. Whole-Brain clearing and immunofluorescence in Nothobranchius furzeri. Cold Spring Harb Protoc. 2023 (9), 698-704 (2023).
- Lu, T., Shinozaki, M., Nagoshi, N., Nakamura, M., Okano, H. 3D imaging of supraspinal inputs to the thoracic and lumbar spinal cord mapped by retrograde tracing and light-sheet microscopy. J Neurochem. 162 (4), 352-370 (2022).
- Saritas, T., Puelles, V. G., Su, X. T., Ellison, D. H., Kramann, R. Optical clearing and imaging of immunolabeled kidney tissue. J Vis Exp. (149), e60002(2019).
- Song, J. H., et al. Precise mapping of single neurons by calibrated 3D reconstruction of brain slices reveals topographic projection in mouse visual cortex. Cell Rep. 31 (8), 107682(2020).
- Fournel, R., Veruki, M. L., Hartveit, E. Digital reconstruction and quantitative morphometric analysis of bipolar cells in live rat retinal slices. J Comp Neurol. 530 (10), 1700-1728 (2022).
- Lin, R., et al. Cell-type-specific and projection-specific brain-wide reconstruction of single neurons. Nat Methods. 15 (12), 1033-1036 (2018).
- Peng, Y. C., et al. Rapid histological assessment of prostate specimens in the three-dimensional space by hydrophilic tissue clearing and confocal microscopy. J Histochem Cytochem. 70 (8), 597-608 (2022).
- Singhal, P., et al. Evaluation of histomorphometric changes in tissue architecture in relation to alteration in fixation protocol - An in vitro study. J Clin Diagn Res. 10 (8), ZC28-ZC32 (2016).
- Tainaka, K., et al. Chemical landscape for tissue clearing based on hydrophilic reagents. Cell Rep. 24 (8), 2196-2210.e9 (2018).
- Lee, S. H., Son, H. J. Second wave, late-stage neuroinflammation in cleared brains of aged 5xFAD Alzheimer's mice detected by macrolaser light sheet microscopy imaging. Int J Mol Sci. 24 (23), 242317058(2023).
- Zhao, J., Lai, H. M., Qi, Y., He, D., Sun, H. Current status of tissue clearing and the path forward in neuroscience. ACS Chem Neurosci. 12 (1), 5-29 (2021).
- Ou, Z., et al. Achieving optical transparency in live animals with absorbing molecules. Science. 385 (6713), eadm6869(2024).
- Ou, Z., et al. Achieving optical transparency in live animals with absorbing molecules. Science. 385, eadm6869(2024).
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