方法文章

一种高效提取人输卵管上皮细胞用于单细胞分析的方法

DOI：

10.3791/67753

⸱

2025年3月28日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynecology, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles, 2Eli and Edythe Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research, University of California, Los Angeles, 3Molecular Biology Institute, University of California, Los Angeles, 4Department of Bioengineering, University of California, Los Angeles, 5Department of Microbiology, Immunology and Molecular Genetics, University of California, Los Angeles, 6Parker Institute for Cancer Immunotherapy, University of California, Los Angeles, 7The Jonsson Comprehensive Cancer Center, University of California Los Angeles, 8The VA Greater Los Angeles Healthcare System, 9Department of Medical and Molecular Pharmacology, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本方案描述了一种从人类输卵管上皮组织中分离上皮细胞的一日法。分离得到的上皮细胞可用于二维（2D）培养，或解离为单细胞悬液，进而应用于后续实验，包括流式细胞术和单细胞RNA测序。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

人类输卵管在生殖过程中具有重要作用。输卵管的功能是允许精子、卵子通过，如果受精成功，还允许胚胎通过。衬在输卵管内表面的上皮细胞对输卵管的正常和异常生理过程均至关重要，包括疾病的发生。绝经后，输卵管在体内不再发挥显著作用，其上皮内细胞组成也会发生变化。本文介绍一种方法，可从新鲜输卵管中分离这些上皮细胞，获得单细胞悬液，且间质细胞污染极少。这些细胞可用于体外培养，或进一步用于流式细胞术、单细胞RNA测序等分析。该分离方案可在4至6小时内完成，获得具有活力的细胞，可用于后续即时分析。这一高效方案有助于分离出上皮细胞比例富集的输卵管上皮细胞。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

输卵管由多个部分构成。从卵巢到子宫，输卵管依次包括伞部、壶腹部、峡部和壁内部。伞部从输卵管末端延伸而出，能够捕获卵巢排出的卵子。随后卵子经壶腹部（此处最易发生受精）进入峡部，最终通过壁内部被输送至子宫1。输卵管最内层的黏膜参与卵子的运输，其由管腔上皮层构成，包含纤毛细胞和分泌细胞。纤毛细胞在伞部的分布更为密集2。这些细胞在将卵子从卵巢经输卵管运送至子宫的过程中发挥关键的机械推动作用。其附属结构不仅有助于推动卵子移动，还能在排卵后清除生殖毒性应激物质3。

分泌型输卵管上皮细胞分泌一种液体，有助于营养供给和配子的组装4。在绝经后状态下，输卵管上皮中纤毛细胞与分泌细胞的比例发生变化，纤毛细胞数量减少，因为输卵管不再发挥重要的运输功能5。此外，在缺乏雌激素的情况下，输卵管被认为会退化为痕迹器官1,6。输卵管中纤毛细胞的丢失被认为会增加浆液性癌的发生风险7。此外，输卵管分泌型上皮细胞被认为可发展为浆液性输卵管上皮内癌（STIC）病灶，这是目前公认的最侵袭性输卵管卵巢癌亚型——高级别浆液性癌的重要前驱病变7,8。

本实验方案的目的是从人输卵管中分离上皮细胞，并将其解离为单细胞悬液。该方案可获得富集的单细胞上皮细胞群体，可用于多种分析。如本文所示，我们在分离后进行了流式细胞术分析并将细胞接种于二维培养体系中。流式细胞术分析显示存在大量单细胞，其中大多数具有活性且为上皮来源。在这些分析中，我们使用了四种标记物：e506用于检测细胞活性，EpCAM用于标记上皮细胞，CD45用于标记免疫细胞，CD10用于标记间质细胞。利用e506活性标记物排除死细胞，并通过CD45将免疫细胞设门去除。单细胞悬液中可能存在一定数量的免疫细胞；然而，为了获得相对纯的上皮细胞群体，可使用CD45耗竭试剂盒去除CD45阳性细胞。此外，在培养接种后，CD45阳性细胞通常不增殖。通过本方法分离并在二维条件下培养的细胞呈现出贴壁生长、鹅卵石样形态的上皮细胞群体。该方法可用于制备细胞样本，进而构建单细胞RNA文库。

近四年来，关于输卵管上皮细胞谱系的确定、生殖生命不同阶段中这些谱系的变化，以及导致恶性转化和肿瘤发生的启动事件的研究日益受到关注6,9,10,11,12。本方案将通过提供一种高效分离输卵管上皮并将其处理为单细胞的方法，显著促进该领域的研究进展。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本方案改编自先前描述的子宫上皮细胞分离方法13,14。通过我们加州大学洛杉矶分校（UCLA）经机构审查委员会批准的方案 #10-0727，收集了去标识化的输卵管新鲜标本，并在约 4–6 小时内消化为单细胞悬液。

1. 输卵管的采集与制备

  1. 在含有解离培养基（DMEM [4.5 g/L D-葡萄糖]，含10%胎牛血清（FBS）、5 mL L-谷氨酰胺和5 mL 青霉素/链霉素）的15 mL或50 mL离心管中收集新鲜的人类输卵管（图1A），并在冰上运输 至实验室。
  2. 将输卵管转移至含有新鲜解离培养基的无菌培养皿中。
  3. 在解剖显微镜下，使用尖头镊子和Vannas Tubingen剪刀剥离输卵管周围附着的脂肪、结缔组织及任何血管组织（图1B）。
  4. 在解剖显微镜下，用剪刀沿输卵管的冠状面进行切割，形成直径约3–5 mm的小圆柱状组织片段（图1C），并使用尖头镊子固定组织以保持稳定。

2. 上皮细胞的分离与解离

  1. 小心地从培养皿中吸除消化液。
  2. 用约 2 mL 冷的 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）轻轻吹打覆盖组织块，轻柔旋转培养板，洗涤组织块两次。
  3. 吸除最后一次 PBS 洗涤液，在室温下用冷的 5 mM 乙二胺四乙酸（EDTA）孵育组织块 5 分钟，重复一次，共孵育两次。每次孵育后均吸除 5 mM EDTA 溶液。
  4. 将组织碎片悬浮于冷的 1% 胰蛋白酶/汉克斯平衡盐溶液（HBSS）中，于 4 ˚C 孵育 40 分钟（图 1D）。
  5. 吸除 1% 胰蛋白酶/HBSS 溶液，用冷的消化液洗涤组织块两次，以灭活胰蛋白酶。
  6. 将组织碎片置于含有 0.4 mg DNase 的 2 mL 消化液中，在室温下孵育至少 30 分钟。
    注意：可能需要更长的孵育时间，但在开始步骤 2.7 前不得超过 45 分钟。
  7. 在解剖显微镜下，保持组织仍处于含 DNase 的液体环境中，用镊子夹住一段输卵管组织，使其管腔与培养皿底部平行并固定。另一只手用镊子反复按压输卵管组织片段，以从管腔中挤出上皮细胞。观察组织周围是否出现细胞晕环，以确认细胞已从管腔释放。对培养皿中的每一段输卵管组织重复此操作（图 1E）。
  8. 将含有细胞的液体转移至无菌 15 mL 离心管中，用消化液至少冲洗培养皿两次，并将洗涤液合并至 15 mL 离心管中。弃去间质性组织碎片。
  9. 以 500 × g 离心 5 分钟收集细胞。吸除上清液，将沉淀重悬于 1 mL 消化液中。
  10. 取 10 µL 细胞悬液，与台盼蓝按 1:1 比例混合，进行细胞计数。吸取 10 µL 混合液加入细胞计数板，插入细胞计数仪中进行计数（图 1F）。

3. 消化为单细胞悬液

  1. 将细胞重悬于9 mL解离培养基中，加入1 mL 8 mg/mL胶原酶（I型）和0.4 mg DNase。在37 ˚C下于200 rpm的摇床中孵育30–45分钟。 rpm图1G).
  2. 通过500 × g离心收集细胞 g 孵育5分钟。吸除上清液，将沉淀物重悬于5 mL消化培养基中以去除胶原酶。
  3. 将细胞悬液通过100 µm细胞滤网过滤至50 mL离心管中（图1H).
  4. 通过500 × g离心收集细胞 g 5 分钟。
  5. 如果细胞沉淀呈红色，按照步骤3.6–3.8所述进行红细胞（RBC）裂解。如果细胞沉淀不呈红色，则跳至步骤3.9。
  6. 将500 µL红细胞裂解缓冲液加入4.5 mL超纯水中稀释。
  7. 吸弃培养基，加入5 mL稀释的红细胞裂解缓冲液，冰上孵育3分钟。
  8. 为终止红细胞裂解，向50 mL离心管中加入45 mL 1×PBS。
  9. 通过500 × g离心收集细胞 g 5 分钟。
  10. 通过取10 µL细胞悬液并与台盼蓝以1:1比例混合来计数细胞。将10 µL混合液加入计数板腔室，然后将其插入细胞计数仪中图1I).

4. 流式细胞术染色

  1. 将250,000个细胞分装至两个独立的5 mL聚苯乙烯圆底试管中，分别用于表面标志物流式细胞术的初级偶联抗体和同型对照。
    注意：可根据细胞数量和下游分析所需的细胞数减少细胞用量。为获得最佳流式结果，分析时应至少包含50,000个细胞。
  2. 按照制造商推荐的稀释比例，用1×PBS稀释抗体（例如抗人EpCAM和CD10）及同型对照。加入可固定的活率染料（e506）和偶联的抗人CD45抗体，以排除活的人免疫细胞。每管至少准备50 µL抗体混合液。避光冰上保存，直至步骤4.4。
  3. 用1 mL 1×PBS洗涤细胞，于4 ˚C下以500 × g离心5 min收集细胞。
  4. 吸除1×PBS，将细胞沉淀重悬于抗体或同型对照抗体组合中，于4 ˚C避光孵育15 min。
  5. 孵育后，加入1 mL 1×PBS稀释，于4 ˚C下以500 × g离心5 min收集细胞。
  6. 吸除1×PBS，将细胞沉淀重悬于200 µL 1×PBS中。

5. 流式细胞术数据采集

  1. 登录流式细胞仪。
    注意：本文展示的方案使用了所引用的流式细胞仪（见材料表）。对于其他型号的流式细胞仪，请遵循制造商的操作说明。本仪器的电压设置已预先优化用于人外周血单个核细胞（PBMCs），因此每次流式分选前无需调整电压。
  2. 如果仪器处于采集模式，则跳至步骤5.3。如果仪器处于数据分析模式，请点击右上角的电源按钮，切换至采集模式。弹出窗口后，点击显示为采集模式的按钮。
  3. 在左下角，若仪器显示需要校准，则进入步骤5.3.1；若显示校准正常，则跳至步骤5.4。
    1. 进行仪器校准时，从4 °C冰箱中取出校准微球并涡旋混匀。
    2. 取1滴校准微球加入5 mL聚苯乙烯圆底管中，并将该管放入单管架中。
    3. 点击右上角的条形码按钮，扫描校准微球瓶上的条形码，弹出窗口后，若所有设置正确，点击是 | 确定，开始校准程序。
    4. 若校准成功，退出并重新登录至采集模式，然后进入步骤5.4。
  4. 点击左上角的打开 | 新建工作区。
  5. 选择冷藏5号架，选中其中三个孔位。选择第一个孔位并输入描述（例如：FTX Ab）；选择第二个孔位并输入唯一描述（例如：FTX Iso）；选择最后一个孔位并输入描述漂白剂。
    注意：每处理4–5个实验样本后，必须加入一个漂白剂样本，以确保及时清洗细胞残留。
  6. 选中所有孔位，并按以下条件设置实验参数：仪器设置：人PBMCs；流速：高；样本混匀：轻柔混匀；模式：标准；样本总体积：200 µL；样本吸取体积：150 µL；注释：输入抗体及其荧光标记信息。
  7. 选择编辑 | 选项，在描述 | 应用 | 确定下为文件命名。
  8. 将样本架从冰箱中取出，放置于载物托盘上，确保条形码面向仪器。将样本管按屏幕上显示的顺序放入架中，然后点击运行按钮以开始实验。
  9. 实验完成后，插入U盘，选择文件 | 复制，展开私有文件夹，选中实验数据，点击复制并弹出。
  10. 数据采集完成后，使用软件分析数据表。
  11. 首先分析同型对照样本。使用多边形工具在前向散射光（FSC）与侧向散射光（SSC）散点图上圈选细胞群体。
  12. 通过将Y轴设为e506、X轴设为FSC来排除死细胞。使用多边形工具圈选e506阴性的活细胞群体。
  13. 双击所选细胞群体，将Y轴改为人CD45，使用多边形工具圈选细胞群体。此即人CD45阴性细胞群体。
  14. 双击CD45阴性细胞群体，将Y轴设为直方图，X 轴设为人EpCAM。使用范围选择工具点击直方图末端，选择空白区域直至图形末端，以圈定EpCAM阳性细胞群。对人CD10染色重复此操作。
  15. 将同型对照的设门结果拖至抗体工作区。CD45阳性细胞将被排除，而EpCAM阳性与CD10阳性细胞群将被保留。
  16. 为生成代表性直方图，选择布局编辑器。将所需直方图拖至布局页面。为比较同型对照与抗体染色结果，可将同型对照直方图与抗体直方图叠加。根据同型对照设门确定阳性细胞群。

6. 免疫细胞化学

  1. 在最终分离步骤后，将细胞培养于所需的腔室载玻片中，直至细胞融合。
  2. 固定细胞：加入 500 µL 冷的 4% 多聚甲醛（PFA），室温孵育 10 分钟。
  3. 吸除 4% PFA，用 1× PBS 洗涤 3 次。
  4. 透化细胞：加入至少 200 µL 含 0.25% Triton-X 的 PBS 溶液，室温孵育 10 分钟。
  5. 透化期间，配制封闭缓冲液（针对非山羊来源的抗体，使用含 4% 正常山羊血清 [NGS] 的 PBS）。
  6. 吸除 0.25% Triton-X 溶液，用 1× PBS 洗涤 3 次。
  7. 加入至少 200 µL 封闭缓冲液（含 4% NGS 的 PBS），室温封闭 1 小时。
  8. 根据生产商推荐，用含 1% NGS 的 1× PBS 配制一抗稀释液。
  9. 封闭完成后，加入至少 200 µL 一抗溶液，室温孵育 2 小时。
    注意：某些一抗可能更适合在 4 °C 过夜孵育，请查阅抗体说明书。
  10. 用含 1% NGS 的 1× PBS 配制二抗溶液。将离心管用锡箔纸包裹，并在避光条件下操作，因为二抗对光敏感。配制后避光保存，待用。
  11. 一抗孵育结束后，用 1× PBS 洗涤 3 次。
  12. 加入至少 200 µL 二抗溶液，避光、室温孵育 1 小时。
    注意：在后续步骤中，应尽可能使载玻片 保持避光状态。
  13. 二抗孵育结束后，用 1× PBS 洗涤 3 次。
  14. 移除腔室，可手动取下或使用载玻片配套工具。请参照腔室载玻片包装上的说明进行操作。
  15. 滴加一滴 4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）封片液，盖上盖玻片。尽量减少气泡，并确保所有细胞均被覆盖。可选步骤：在盖玻片边缘涂抹指甲油 以密封。
  16. 将载玻片平放在载玻片盒中干燥，并置于 4 °C 保存，待成像时使用。
  17. 使用配备合适荧光通道的显微镜进行成像，依据二抗的荧光偶联类型以获得清晰图像。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们共收集了七例输卵管样本，并从中分离出富集的上皮细胞群体（图2A 和 补充图S1A）。为了评估该单细胞悬液制备方法的细胞活力及上皮细胞富集效果，我们进行了流式细胞术分析。为检测细胞活力，使用活力标记物e506对细胞进行染色，该步骤同时可在分析时排除所有碎片和死细胞。

为确定通过该方法分离的细胞组成，将样品用上皮细胞标记物（EpCAM）、间质细胞标记物（CD10）和免疫细胞标记物（CD45）进行染色。如图所示 图2B我们从输卵管组织中分离出具有活力且富集的上皮细胞群体。样本的平均活力为82%。所有样本在排除CD45阳性细胞后，均观察到富集的上皮细胞群体，其中EpCAM阳性细胞平均占样本总量的80%。存在少量间质细胞污染，平均为7.8%。 图2C 显示接种后 2D 培养 4-6 天的分离细胞。可见上皮细胞已被成功分离，因其形成了形态均一、呈鹅卵石样外观的贴壁细胞簇。在 补充的 图 S1B接种细胞后培养2-6天。采用免疫细胞化学法对培养中生长的细胞进行表征。培养物中大多数细胞对EpCAM和分泌细胞标志物PAX8呈阳性染色，仅少数细胞鉴定为波形蛋白阳性。培养中可见纤毛细胞，视频拍摄结果如图所示。 补充视频 S1.

生殖解剖学中的显微外科技术：显微镜视野、组织样本、分析装置。
图 1：实验流程图。（A）获取输卵管。（B）去除多余的脂肪和结缔组织。（C）将输卵管切成约 3–5 mm 的小段。（D）用 PBS 清洗组织片段，随后在 2× EDTA 中孵育 5 分钟，并在 4 ˚C 下用 1% 胰蛋白酶孵育 40 分钟。（E）使用两对镊子，一对固定，另一对推动，将上皮细胞从输卵管片段中挤出。（F）将细胞转移至 15 mL 离心管中，离心并计数。（G）用 DMEM、胶原酶和 DNase 重悬，消化 30–45 分钟。（H）用 100 µm 滤网过滤。（I）通过离心收集细胞并进行计数。请点击此处查看该图的放大版本。

患者细胞活力、EpCAM、CD10 流式细胞术图谱、显微镜图像。细胞标志物分析。
图 2：分离的上皮细胞的表征。（A）患者临床信息及流式细胞术结果表格。（B）分离后进行流式细胞术分析，以显示已成功分离出富集的上皮细胞群体（EpCAM 阳性）。同型阴性对照以黑色表示，实验结果以粉色表示。（C）分离后将细胞接种培养。接种后 4–6 天拍摄照片。比例尺 = 100 µm。缩写：AUB = 异常子宫出血；EIN = 子宫内膜上皮内瘤变。请点击此处查看该图的放大版本。

补充 图 S1：培养中分离的上皮细胞的进一步表征。（A）患者临床信息表。（B）分离的细胞在接种后 2–6 天进行培养，并对 EpCAM、分泌细胞标志物（PAX8）和间质细胞标志物（Vimentin）进行染色，以表征培养中的细胞类型。比例尺 = 50 µm。缩写：EIN：子宫内膜上皮内瘤变；DAPI = 4',6-二脒基-2-苯基吲哚。请点击此处下载该图。

补充视频 S1：以 30 倍放大拍摄的纤毛细胞搏动视频，用于展示培养中的纤毛细胞。 请点击此处下载该视频。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

人们对研究输卵管上皮存在极大兴趣，因为输卵管在生殖过程中发挥着重要作用，并且是大多数高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）的起源部位。为此，许多研究人员已描述了在人和小鼠模型中分离输卵管细胞的实验方案。10,11,12,15,16,17,18,19,20,21我们所描述的提取和富集输卵管上皮细胞的方法，是对现有输卵管细胞分离方案的补充。尽管这些方案之间存在部分重叠，但在小鼠和人类中已报道的方法总体上可分为两类。第一类方法涉及将整段输卵管剪碎并进行酶消化，从而获得总细胞悬液10,12,15,16,17第二种方法涉及通过振荡或刮取使组织脱落，从而获得组织片层11,18,19,20,21两种方法均可用于获取上皮细胞，以便进行后续实验分析，如流式细胞术、测序等。 体外 培养。本方法的一个主要优势在于，该方案通过酶消化和机械推压步骤，已获得富含上皮细胞的输卵管细胞群体。该富集上皮细胞的群体可进一步消化，获得可用于多种应用的单细胞悬液，例如流式细胞术、二维培养、免疫细胞化学以及单细胞RNA测序。

我们发现影响细胞得率的关键步骤包括输卵管组织碎片在1%胰蛋白酶/HBSS和DMEM/DNase中孵育的时间。在任一溶液中孵育时间过长均会导致细胞降解，显著降低细胞活力；而孵育时间不足则会阻碍研究人员在方案步骤2.6中将大量上皮细胞推出，因为细胞仍会相互黏附。使用1%胰蛋白酶溶液也至关重要，因为胰蛋白酶浓度过低或过高均会减少可存活的输卵管上皮细胞的得率。通过结合化学与机械分离方法以及消化步骤（方案步骤3.1），我们可以指数级缩短从组织到单细胞悬液所需的时间，从而确保细胞具有良好的活力，并可在同一天内完成后续分析。

在实验步骤1.4中，必须确保所切割的输卵管组织块厚度为3-5 mm。如果组织块过大，将难以进行步骤2.7的操作，最终导致细胞得率降低，因为需要在DMEM/DNase中孵育更长时间。

尽管细胞悬液中上皮细胞已得到富集，但仍不可避免地存在间质细胞污染。如果实验需要获得纯的上皮细胞，可利用流式细胞术及我们所述的标记物进行分选，以分离上皮细胞并去除间质细胞。

本研究使用了绝经后的输卵管组织。然而，该方法在本实验室已成功应用于绝经前的输卵管组织。绝经前与绝经后输卵管的主要差异在于纤毛细胞和分泌性上皮细胞的组成1。本方案适用于所有生殖阶段。

这一高效方案将有助于研究细胞类型 输卵管上皮，包括细胞谱系的界定、其在生殖周期以及绝经后的动态变化，以及其在高级别浆液性卵巢癌发生中的作用。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者声明无利益冲突。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者Ruegg L、James-Allan LB和DiBernardo G的部分研究工作由大洛杉矶退伍军人协会项目1I01BX006019-01A2和I01BX006411-01资助，项目负责人为Memarzadeh S。作者Ochoa C的研究由加州大学洛杉矶分校Eli和Edythe Broad再生医学与干细胞研究中心的Rose Hills基金会研究生奖学金培训项目资助。我们感谢加州大学洛杉矶分校转化病理学核心实验室，特别是Ko Kiehle和Chloe Yin在组织获取方面的协助。我们还要感谢Ken Yamauchi以及BSCRC显微成像核心在成像方面的技术支持。图1使用BioRender.com（协议编号：JL27QWDYNT）制作。最后，我们感谢Felicia Cordea及BSCRC流式细胞术核心在流式细胞术方面的协助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1% 胰蛋白酶 赛默飞世尔科技 J63993.09
100 µm细胞筛康宁431752
4% 甲醛电子显微镜科学公司15710-S
5 mL 圆底管康宁352008
60 mm 细胞培养皿Corning CLS430589-500EA
6孔细胞培养板康宁353046
抗CD10BioLegend312212
抗-CD326（Ep-CAM）BioLegend324218
抗CD45 BioLegend304026
抗EpCAMAbcamab223582
抗小鼠IgG2a PerCP BioLegend400250
抗PAX8Sigma-Aldrich363M-15
抗波形蛋白安捷伦科技M072501-2
腔室载玻片系统赛默飞世尔科技 154917PK
胶原酶 赛默飞世尔科技 17100017
DMEM赛默飞世尔科技 10569-010
DNase ISigma10104159001
EDTASigma3690
eFluor 506Invitrogen65-0866-14
FBSSigmaF2442
精细尖头镊子 VWR102091-526任何您选择的精细镊子均可使用
可固定的活力染料 eFluor 506Invitrogen65-0866-14
FlowJo 软件版本 9 BD 生物科学数据分析软件
GlutaMAXGibco35050-061
HBSS赛默飞世尔科技 14175-095
MACSQuant Analyzer 10 流式细胞仪 Miltenyi Biotec
MACSQuant 校准微球Miltenyi Biotec130-093-607
Mammocult Stemcell Technologies5620
正常山羊血清Fisher ScientificPI31873
PBS 赛默飞世尔科技 14190-144
青霉素-链霉素 Gibco15140-122
PerCP 标记的 CD45BioLegend304026
红细胞裂解缓冲液 Tonbo BiosciencesTNB-4300-L100 
Triton X-100赛默飞世尔科技 BP151-100
万纳斯-蒂宾根弹簧剪 精细科学工具15003-08
含DAPI的VECTASHIELDFisher ScientificNC9524612

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Morphology and ultrastructure of fallopian tube epithelium at different stages of the menstrual cycle and menopause. Hum Reprod. 9 (12), 2224-2233 (1994).">Crow, J., Amso, N. N., Lewin, J., Shaw, R. W. Morphology and ultrastructure of fallopian tube epithelium at different stages of the menstrual cycle and menopause. Hum Reprod. 9 (12), 2224-2233 (1994).
  2. Scanning electron microscopic study of the human fallopian tube. Report II. Fetal life, reproductive life, and postmenopause. Fert Steril. 23 (10), 719-733 (1972).">Patek, E., Nilsson, L., Johannisson, E. Scanning electron microscopic study of the human fallopian tube. Report II. Fetal life, reproductive life, and postmenopause. Fert Steril. 23 (10), 719-733 (1972).
  3. Exploring the role of fallopian ciliated cells in the pathogenesis of high-grade serous ovarian cancer. Int J Mol Sci. 19 (9), 2512(2018).">Coan, M., et al. Exploring the role of fallopian ciliated cells in the pathogenesis of high-grade serous ovarian cancer. Int J Mol Sci. 19 (9), 2512(2018).
  4. Formation of fallopian tubal fluid: role of a neglected epithelium. Reproduction. 121 (3), 339-346 (2001).">Leese, H., Tay, J., Reischl, J., Downing, S. Formation of fallopian tubal fluid: role of a neglected epithelium. Reproduction. 121 (3), 339-346 (2001).
  5. Changes in ciliation and cell height in human tubal epithelium in the fertile and post-fertile years. Maturitas. 5 (1), 39-45 (1983).">Donnez, J., Casanas-Roux, F., Ferin, J., Thomas, K. Changes in ciliation and cell height in human tubal epithelium in the fertile and post-fertile years. Maturitas. 5 (1), 39-45 (1983).
  6. A molecular atlas of the human postmenopausal fallopian tube and ovary from single-cell RNA and ATAC sequencing. Cell Rep. 41 (12), 111838-111838 (2022).">Lengyel, E., et al. A molecular atlas of the human postmenopausal fallopian tube and ovary from single-cell RNA and ATAC sequencing. Cell Rep. 41 (12), 111838-111838 (2022).
  7. Loss of tubal ciliated cells as a risk for "ovarian" or pelvic serous carcinoma. Am J Cancer Res. 10 (11), 3815(2020).">Tao, T., et al. Loss of tubal ciliated cells as a risk for "ovarian" or pelvic serous carcinoma. Am J Cancer Res. 10 (11), 3815(2020).
  8. Ovarian serous carcinoma: recent concepts on its origin and carcinogenesis. J Hematol Oncol. 5 (1), 8(2012).">Li, J., Fadare, O., Xiang, L., Kong, B., Zheng, W. Ovarian serous carcinoma: recent concepts on its origin and carcinogenesis. J Hematol Oncol. 5 (1), 8(2012).
  9. The repertoire of serous ovarian cancer non-genetic heterogeneity revealed by single-cell sequencing of normal fallopian tube epithelial cells. Cancer Cell. 37 (2), 226-242.e7 (2020).">Hu, Z., et al. The repertoire of serous ovarian cancer non-genetic heterogeneity revealed by single-cell sequencing of normal fallopian tube epithelial cells. Cancer Cell. 37 (2), 226-242.e7 (2020).
  10. Single-cell transcriptomics identifies gene expression networks driving differentiation and tumorigenesis in the human fallopian tube. Cell Rep. 35 (2), 108978(2021).">Dinh, H. Q., et al. Single-cell transcriptomics identifies gene expression networks driving differentiation and tumorigenesis in the human fallopian tube. Cell Rep. 35 (2), 108978(2021).
  11. Cellular heterogeneity of human fallopian tubes in normal and hydrosalpinx disease states identified using scRNA-seq. Dev Cell. 57 (7), 914-929.e7 (2022).">Ulrich, N., et al. Cellular heterogeneity of human fallopian tubes in normal and hydrosalpinx disease states identified using scRNA-seq. Dev Cell. 57 (7), 914-929.e7 (2022).
  12. Fallopian tube single cell analysis reveals myeloid cell alterations in high-grade serous ovarian cancer. iScience. 27 (3), 108990-108990 (2024).">Brand, J., et al. Fallopian tube single cell analysis reveals myeloid cell alterations in high-grade serous ovarian cancer. iScience. 27 (3), 108990-108990 (2024).
  13. Cell-autonomous activation of the PI3-kinase pathway initiates endometrial cancer from adult uterine epithelium. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (40), 17298-17303 (2010).">Memarzadeh, S., et al. Cell-autonomous activation of the PI3-kinase pathway initiates endometrial cancer from adult uterine epithelium. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (40), 17298-17303 (2010).
  14. Stromal induction and specification of morphogenesis and cytodifferentiation of the epithelia of the mullerian ducts and urogenital sinus during development of the uterus and vagina in mice. J Exp Zool. 196 (3), 361-369 (1976).">Cunha, G. R. Stromal induction and specification of morphogenesis and cytodifferentiation of the epithelia of the mullerian ducts and urogenital sinus during development of the uterus and vagina in mice. J Exp Zool. 196 (3), 361-369 (1976).
  15. Long-term organoid culture reveals enrichment of organoid-forming epithelial cells in the fimbrial portion of mouse fallopian tube. Stem Cell Res. 32 (1873-5061), 51-60 (2018).">Xie, Y., Park, E. -S., Xiang, D., Li, Z. Long-term organoid culture reveals enrichment of organoid-forming epithelial cells in the fimbrial portion of mouse fallopian tube. Stem Cell Res. 32 (1873-5061), 51-60 (2018).
  16. Primary culture and immortalization of human fallopian tube secretory epithelial cells. Nat Protoc. 7 (9), 1755-1764 (2012).">Karst, A. M., Drapkin, R. Primary culture and immortalization of human fallopian tube secretory epithelial cells. Nat Protoc. 7 (9), 1755-1764 (2012).
  17. Protocol to generate mouse oviduct epithelial organoids for viral transduction and whole-mount 3D imaging. STAR Protocols. 3 (1), 101164(2022).">Ford, M. J., Harwalkar, K., Yamanaka, Y. Protocol to generate mouse oviduct epithelial organoids for viral transduction and whole-mount 3D imaging. STAR Protocols. 3 (1), 101164(2022).
  18. Microdissection and dissociation of the murine oviduct: Individual segment identification and single cell isolation. J Vis Exp. (177), e63168(2021).">Radecki, K. C., Lorenson, M. Y., Carter, D. G., Walker, A. M. Microdissection and dissociation of the murine oviduct: Individual segment identification and single cell isolation. J Vis Exp. (177), e63168(2021).
  19. Protocol for the detection of organoid-initiating cell activity in patient-derived single fallopian tube epithelial cells. Methods Mol Bio. 2429, 445-454 (2022).">Feng, L., et al. Protocol for the detection of organoid-initiating cell activity in patient-derived single fallopian tube epithelial cells. Methods Mol Bio. 2429, 445-454 (2022).
  20. The Notch and Wnt pathways regulate stemness and differentiation in human fallopian tube organoids. Nat Commun. 6 (1), 8989(2015).">Kessler, M., et al. The Notch and Wnt pathways regulate stemness and differentiation in human fallopian tube organoids. Nat Commun. 6 (1), 8989(2015).
  21. Ex vivo culture of primary human fallopian tube epithelial cells. J Vis Exp. (51), e2728(2011).">Fotheringham, S., Levanon, K., Drapkin, R. Ex vivo culture of primary human fallopian tube epithelial cells. J Vis Exp. (51), e2728(2011).

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

RNA EpCAM

相关文章