我们开发了一个开源的 Micro-Manager 插件，可在结构光照明显微镜上实现荧光偶极子的实时观测。该插件支持二维和三维偶极子取向的观测。
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本文内容
摘要
摘要
荧光偏振显微镜（FPM）能够对荧光团的位置及其偶极子取向进行成像。尽管超分辨率荧光偏振显微镜已取得诸多成果，但其依赖于采集后的图像处理，限制了实时观测能力。偏振化结构光照明显微镜（pSIM）可实现荧光偶极子的超分辨率成像，具有较快的成像速度，非常适合活细胞应用。我们开发了一种开源方案，用于偏振图像的实时重建及荧光偶极子的实时显示。此外，我们将该方法扩展至实现三维取向图谱（3DOM），从而拓展其在复杂生物学研究中的应用。同时，我们系统地介绍了如何将现有的SIM显微镜系统扩展用于偏振成像，并提供了Micro-Manager 2.0的详细配置指南以控制显微镜，实现偏振成像的实时预览。此外，我们还提供了涵盖pSIM和3DOM的完整重建MATLAB代码。本综合指南旨在帮助初学者快速掌握并轻松上手相关操作。
引言
荧光偏振显微镜（FPM）已成为一种强大的技术，可同时成像荧光团的位置和偶极取向，为生物成像提供了深刻见解1,2。通过实现对生物分子取向的直接观测，FPM揭示了肌动蛋白3,4,5、微管5、septin6、DNA细丝7-9、核孔复合物10以及膜蛋白11等大分子的复杂排列结构。其高速、无创且兼容活细胞的特性，使得FPM能够以高时间分辨率追踪分子旋转动力学11,12。当与生物力探针结合时，FPM不仅能以亚细胞分辨率绘制力的大小分布图，还可测量力的方向，从而通过揭示力的作用方向，推动了对生物力学过程的理解13。
近几十....
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方案
1. 扩展现有的结构光照明显微镜以实现偏振成像
- 准备一台SIM显微镜。
注意： 我们假定读者已具备一定的显微镜搭建基础，并已拥有结构光照明显微镜。如果您缺乏相关经验，请参考这篇论文，其中详细描述了如何构建一台SIM显微镜16。在我们的pSIM工作中，"HWP+WQP+LCVR"偏振控制单元可由披萨形涡旋波片5或披萨形半波片17替代。 - 通过在空间光调制器（SLM）上加载不同图案，测量三个条纹方向的偏振消光比。在物镜后方放置一个偏振片并旋转，使用功率计测量激光功率。对于pSIM，需旋转波片以维持三个方向s偏振的消光比> 10。
- 对于3DOM，旋转HWP2以维持六个方向p偏振的偏振状态。 将SIM空间掩模替换为3DOM空间掩模，使六个方向的一级衍射光束能够通过（见图1B）。
注意：pSIM需要s偏振，而3DOM需要p偏振。pSIM5和3DOM15的详细装置设置在其他文献中已有描述。
2. Mic....
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结果
pSIM 方法可在基于s偏振激光束干涉的SIM显微镜上实施。s偏振干涉是目前应用最广泛的SIM类型，可产生高对比度的照明条纹。显微镜装置的学术原型已在pSIM的原始研究中给出5。如图1简要所示，空间光调制器（SLM）生成±1级衍射光束，而披萨形半波片则维持三个方向上的s偏振状态。尽管其他SIM方案可能使用光栅来生成衍射光束，或采用其他偏振调制方法来保持s偏振，这些显微镜同样可扩展用于偏振成像。
3DOM 显微镜采用类似的光学成像系统（图1A），但存在两点不同。首先，3DOM 不需要两束激光的干涉，而是仅利用 +1 级衍射光束来控制激发光的偏振方向。如原始研究15所示，3DOM 至少需要六个方向的数据才能计算出三维偶极子取向。因此，3DOM .......
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讨论
在本研究中，我们开发了一种插件，可实现实时预览两种偏振成像技术：pSIM 和 3DOM。这两种技术均可在现有的 SIM 系统上通过轻微改造实现。我们提供了安装 pSIM 和 3DOM 显微镜的详细步骤，并介绍了如何设置 Micro-Manager 以控制显微镜，以及如何获取实时偏振成像结果。实验结果包括 pSIM 成像的肌动蛋白丝和 3DOM 成像的 λ-DNA。鬼笔环肽偶极子的取向大致与肌动蛋白丝的方向平行，而 STOYOX Orange 荧光染料的取向则垂直于 DNA 轴。结构光照明显微镜还可实现高尔基体、微管网络18 和内质网19 的高时空分辨率成像。
我们为 pSIM 和 3DOM 均开发了定制化插件；用户可根据其拍摄模式选择合适的预览程序。在运行实时预览插件的过程中，若插件未能正常启动，用户必须首先检查配置文件中关于读取虚拟相机图像的路径设置，确保该路径已准确修改为图像实际存储的位置。随后，还需确保实时预览插件中读取校准图像的路径也已相应更新。不同版本的 Micro-Manag.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作得到中国国家重点研发计划（2022YFC3401100）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 100 nm 荧光微球 | Invitrogen | F8801 | |
| 4% 甲醛溶液 | Invitrogen | R37814 | |
| 相机 | Tucsen | Dhyana 400BSI V3 | https://www.tucsen.com/download-software/ |
| 义齿基托材料（I型热固化型，液体） | 新世纪牙科 | N/A | |
| 杜尔贝科’s 改良伊格尔’s 培养基 | Gibco | C11995500BT | |
| Eclipse TE2000 倒置显微镜 | 尼康 | TE2000 E | |
| 胎牛血清 | Gibco | 10099141C | |
| MATLAB R2019b | MathWorks | 版本 R2019b | https://ww2.mathworks.cn/downloads/ |
| MetroCon V4.0 | Kopin | 版本 4.0 | 空间光调制器软件 |
| Micro-Manager 2.0 | μΜ经理 | 版本 2.0 | 下载 Micro-Manager 最新版本 |
| MS-2000 XYZ 自动载物台 | 应用科学仪器公司 | MIM3 | https://www.asiimaging.com/support/downloads/usb-support-on-ms-2000-wk-controllers/ |
| myDAQ | 国家仪器公司 | 781325-01 | 软件与驱动下载 - NI |
| OBIS 561 nm LS 20 mW 激光器 | 相干的 | 1325777 | |
| Phalloidin-AF568 | Invitrogen | A12380 | |
| 磷酸盐缓冲液 | 康宁 | 21-040-CV | |
| 聚甲基丙烯酸甲酯 | Solarbio | M9810 | |
| ProLong Diamond | Invitrogen | P36980 | |
| 空间光调制器 | Kopin | SXGA-12 | |
| SYTOX 橙色核酸染料 | Invitrogen | S11368 | |
| Triton X-100 | Invitrogen | HFH10 | |
| 胰蛋白酶 | Gibco | 25200056 | |
| λ-DNA | Invitrogen | S11368 |
参考文献
- Zhanghao, K., Gao, J., Jin, D., Zhang, X., Xi, P. Super-resolution fluorescence polarization microscopy. J Innov Opt Health Sci. 11 (01), 1730002(2018).
- Alonso, M. A., Brasselet, S. Polarization microscopy: from ensemble structural imaging....
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重印与许可
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