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抗氧化与驱虫特性的评价 Tithonia diversifolia 使用提取物对抗胃肠道线虫卵 体外 检测方法

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DOI：

10.3791/67760

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2025年8月1日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Multidisciplinary Center for Technological Research, National University of Asunción (CEMIT - UNA), 2Centre of Marine Sciences (CCMAR/CIMAR LA), University of Algarve, 3Department of Food Biochemistry, Biodiversity, Food and Health Group (BIOALSA), Faculty of Chemical Sciences, National University of Asunción (FCQ - UNA), 4Carleton College

本文内容

摘要

本研究评估了以下生物学活性 Tithonia diversifolia 使用基于自由基的方法提取并分析 体外 通过卵孵化试验（EHA）评估其对小型反刍动物胃肠道线虫的影响。文中描述了实验方法与关键研究结果，凸显了这些提取物在寄生虫防控方面的潜力。

摘要

由胃肠道线虫（GIN）引起的寄生虫病被认为是全球范围内限制畜牧业生产的重要因素，因其显著损害动物福利并增加生产成本。多年来，寄生虫防控主要依赖于合成药物的使用。然而，全球范围内关于GIN对商用驱虫药产生耐药性的报道日益增多。因此，针对家畜GIN的防控已出现多种替代策略，包括探索具有生物活性潜力的植物资源。 Tithonia diversifolia 可全年采收，其植物各部分已在民间医学中用于治疗多种疾病。本研究评估了 体外 水和70%水性丙酮提取物的抗氧化特性 T. diversifolia 地上部分（包括叶片、枝条和花朵）的提取物，采用基于自由基的方法制备，并通过寄生虫模型评估其驱虫潜力，使用水提物进行虫卵孵化试验（EHA）。此外，测定了提取物的总多酚含量。这些结果表明 T. diversifolia 作为一种有前景的天然抗氧化剂和驱虫化合物来源。

引言

由胃肠道线虫（GIN）引起的寄生虫病被认为是全球范围内限制畜牧业生产的重要因素，因为它们显著损害动物福利并增加生产成本1。寄生虫与家畜之间的关系受到多种宿主相关因素的影响，包括动物的抗性和耐受性遗传特征、动物的营养状况、寄生水平以及所涉寄生虫种群的致病性2。

多年来，寄生虫控制完全依赖于合成抗寄生虫药物。然而，长期且单一的使用已导致耐药性的出现，降低了药物的有效性，促使人们迫切寻求替代策略3。全球范围内，线虫对多种驱虫药物产生耐药性的现象日益增多，这一情况令人担忧，尤其是在热带地区4。此外，消费者对减少动物肉类及环境中抗寄生虫药物残留的意识也不断增强5。因此，针对家畜线虫寄生虫的替代防控方法应运而生6。

Tithonia diversifolia 是一种原产于中美洲的热带灌木，具有独特的特性，使其在反刍动物生产体系中具有重要价值。该植物可全年采收，其各个部分传统上被土著社区用于民间医学，以治疗多种疾病。外用时，可用于缓解腹痛、伤口、皮炎和肌肉疾病；口服则可用于治疗感染、疟疾、发热、肝炎和糖尿病。这些多样的治疗用途凸显了其广泛的药用潜力7。

氧化应激在寄生虫感染的发生和发展过程中起着重要作用，不仅影响宿主生物体，也影响为生存而挣扎的寄生生物体8。因此，检测抗氧化活性对于评估具有驱虫潜力的药用植物提取物的生物活性至关重要。由于寄生虫感染，宿主体内抗氧化剂的浓度降低，而细胞成分的氧化产物浓度则升高。对于寄生虫而言，维持氧化平衡对其延长与宿主的相互作用以及抵御宿主体内产生的氧化应激至关重要9。

抗寄生虫药物耐药性的产生及其快速传播的证据表明，常用治疗手段可能会变得无效。因此，常采用一种名为虫卵孵化试验（egg hatch assay, EHA）的体外检测方法，用于评估胃肠道线虫对苯并咪唑类（benzimidazole, BZ）药物的敏感性或耐药性。该试验也常用于评价植物提取物对虫卵的驱虫活性，并比较其剂量依赖性效应。该方法的主要局限性之一是不同试验间虫卵孵化率存在变异性。虫卵的活性最长仅为3小时，因此需要迅速回收并立即开始试验。尽管如此，孵化率仍可能存在波动。因此，通常规定对照组中至少有70%的虫卵成功孵化，结果才被视为有效10,11。该方法具有成本低、速度快、操作简便且可重复性强等优点12,13,14。

利用植物提取物探索控制胃肠道线虫（GIN）的替代方法，是基于植物中次生代谢产物及其生物活性潜力。该研究领域的一个挑战是次生代谢产物的含量和稳定性，因为这些成分会受到生物和非生物因素的影响，同时也受提取过程所引发的化学应激的影响15,16,17。

本研究假设，根据提取所用溶剂种类的不同，可能会导致生物活性（抗氧化和驱虫作用）存在差异，这可能与多酚类物质的组成变化及其相应的生物活性有关。本文旨在概述采用以下方法对提取物进行评价的实验步骤 体外 可轻松复制的模型

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方案

所有涉及动物操作的实验均经 CEMIT 动物伦理委员会批准。提供虫卵的动物来自与 CEMIT 合作的农场，这些农场为预防性诊断目的提供粪便样本。这些动物为绵羊或山羊（无特定品种），雌雄不限，年龄在一年以上，且在采样前 15 天内未进行过驱虫处理。所有参与的农场均已被告知样本将用于科研目的，并同意参与本研究。在采集虫卵前，首先通知附近的养殖场，获得许可后组织实地访问以收集新鲜粪便样本，并确保在三小时内完成处理。本研究中使用的试剂和设备列于材料表中。

1. 植物材料的制备

  1. 选择适合的地点采集该植物物种。
  2. 采集至少两份 Tithonia diversifolia 标本，用于分类学鉴定和标本馆制备。
  3. 采集不少于 1000 g 的 T. diversifolia 地上部分。
  4. 将采集的生物材料在室温下（约 26  °C；见图 1）干燥。
  5. 使用电动研磨机研磨干燥后的生物材料。
  6. 将研磨后的材料储存于 4 °C 冰箱中。

2. 提取物的制备

  1. 制备水提取物：
    1. 将10 g干燥生物质与100 mL蒸馏水在100 °C下混合。
    2. 在120 rpm持续振荡条件下浸泡24 h。
    3. 用滤纸（Whatman no. 5或同等型号）过滤提取液。
    4. 将滤过的提取液进行冷冻干燥。
  2. 制备丙酮提取物：
    1. 将10 g干燥植物材料与70%水性丙酮按1:3的比例混合。
    2. 在120 rpm持续振荡条件下浸泡24 h。
    3. 用滤纸（Whatman no. 5或同等型号）过滤提取液。
    4. 将滤过的提取液进行冷冻干燥。
      注意：为更好保存，应将冻干提取物储存在-20 °C（见图2）。确保获得至少5 g冻干提取物。

3. 储备液的制备

  1. 进行抗氧化实验：
    1. 将干燥的提取物溶于相应的溶剂（蒸馏水或70%水性丙酮）中，配制成终浓度为10 mg/mL的溶液。
  2. 进行虫卵孵化实验：
    1. 将12 mg冻干提取物溶于5 mL蒸馏水中，配制成2.4 mg/mL的储备液。
    2. 配制五个浓度梯度：1.2 mg/mL、0.6 mg/mL、0.3 mg/mL和0.15 mg/mL（见图3）。
      注意：根据所使用的孔数和板数调整储备液体积。例如，若使用48孔而非12孔，则相应减少体积；此时可将6 mg提取物溶于2.5 mL水中，而不是12 mg溶于5 mL水中。

4. 植物化学成分

  1. 提取物总酚含量（TPC）
    1. 混合 5 µL 样品与 100 µL 的福林-酚试剂（F-C 试剂）稀释 10 倍× 在96孔透明塑料板中的蒸馏水中
    2. 室温（RT）孵育10分钟。
    3. 加入100 µL 碳酸钠溶液（75 g/L 水溶液）。
    4. 室温孵育90分钟。
    5. 在650 nm处测定吸光度。
      注意：以没食子酸当量（GAE）表示总多酚含量。使用至少五个浓度的没食子酸建立标准曲线。
  2. 总黄酮含量（TFC）
    1. 混合50 µL 的提取物与 50 µ在96孔透明塑料板中加入2%甲醇氯化铝溶液L。
    2. 室温孵育10分钟。
    3. 在405 nm处测定吸光度。
      注意：以槲皮素当量（QE）表示总黄酮含量（TFC）。使用至少五个浓度的槲皮素建立标准曲线。
  3. 总单宁含量（TTC）
    1. 混合10 µL 的提取物与 200 µL 1% DMACA 甲醇溶液和 100 µ37% 盐酸的 L，在 96 孔透明塑料板中。
    2. 室温孵育15分钟。
    3. 在640 nm处测定吸光度。
      注意：以儿茶素（mg/mL）表示TTC。

5. 抗氧化活性检测 - ABTS

  1. 将0.003514 g过硫酸钾和0.0203 g ABTS加入5 mL蒸馏水中。
  2. 用铝箔包裹溶液，并在4 °C冰箱中孵育12–16小时。
  3. 在734 nm处测定吸光度，并通过添加乙醇将其调整至约0.7。初始步骤：将5 µL ABTS溶液与195 µL乙醇混合。
  4. 在96孔透明塑料板中，将10 µL提取物与190 µL ABTS溶液混合。
  5. 对于阳性对照（C+），将10 µL Trolox（根据样品吸光度使用标准曲线确定浓度）与190 µL ABTS溶液混合。
  6. 对于阴性对照（C-），将10 µL用于溶解提取物的溶剂（水或70%丙酮水溶液）与190 µL ABTS溶液混合。
  7. 在室温（RT）下孵育6分钟。
  8. 在734 nm处测定吸光度。
    注：图4展示了ABTS测定的一个示例。

6. 寄生虫学实验步骤

  1. 从自然感染的山羊直肠内直接采集粪便样本。
    注意：为确保样本新鲜并避免环境污染，应从自然感染的山羊和绵羊直肠内直接采集粪便样本。由经过培训的人员轻柔地保定动物，以尽量减少应激反应。佩戴清洁的一次性手套，将润滑后的戴手套手指插入直肠，取出约5-10 g粪便材料。将样本放入洁净并标记好的塑料容器中，于4-8 °C保存。所有样本应在采集后3小时内处理，以维持寄生线虫卵的活力。遵循机构动物福利指南，并获得农场主的知情同意。
  2. 确定每个样本所对应的动物种类。
  3. 将每份粪便样本30 g与50 mL饱和盐溶液（密度 = 1.2）混合，用于制备粪便学检测样本。
  4. 使用麦克马斯特计数板（McMaster slide）对虫卵进行计数。
    1. 将3 g粪便样本与50 mL饱和氯化钠溶液充分混匀。用纱布过滤混合液，将滤液注入计数板的两个计数室，静置5分钟。
    2. 在显微镜下以10×倍数观察并计数圆形线虫类（strongyle-type）虫卵。使用公式计算每克粪便中的虫卵数（EPG）：EPG = （虫卵计数）× 50。该方法可标准化对小型反刍动物胃肠道线虫的定量评估。
  5. 将虫卵数量表示为每克粪便虫卵数（EPG）。
  6. 选择EPG不低于800的粪便样本用于粪便培养制备。
  7. 从粪便培养物中获取第三期幼虫（L3），并鉴定其属或种。
    注意：胃肠道线虫卵在其生命周期中会沉积于草上（见图5）。家畜小型反刍动物通常表现为多重寄生感染。图6展示了进行粪便学分析的步骤。

7. 体外 检测 - 虫卵孵化试验（EHA）

  1. 采集新鲜的粪便样品。
  2. 使用无菌纱布将粪便过滤两次。
  3. 将所得悬液再次过滤并转移至筛网中。
  4. 用蒸馏水冲洗筛网上的物质。
  5. 将冲洗后的悬液收集到15 mL离心管中。
  6. 使用配备摆动桶转子的台式离心机，在室温下以约4800 × g 离心5分钟。用蒸馏水离心两次，再用饱和盐水溶液离心一次，以将虫卵浓缩至管底（虫卵形态见图7）。
  7. 用PBS重悬虫卵。
  8. 将虫卵浓度调整为100个/mL，用于实验设置。
  9. 通过将噻苯咪唑 (TBZ) 溶解于PBS中配制成0.025 mg/mL的溶液，作为阳性对照。
  10. 使用PBS中的虫卵悬液作为阴性对照。
  11. 采用48孔多孔板进行实验。
  12. 每孔加入提取物与虫卵悬液按50/50（v/v）比例混合的溶液，最终体积为250 µL。
  13. 每孔加入约100个虫卵/mL。
  14. 每个浓度设置四个复孔（四次重复）。
  15. 在倒置显微镜下以40×放大倍数计数虫卵。
  16. 仅使用孵化率≥70%的实验孔。
  17. 对每个浓度分别计数幼虫（L1）、未孵化虫卵（UnE）、含幼虫虫卵（LFE）和桑葚期虫卵（ME）。
    注：代表性虫卵孵化实验流程总结见图8。

8. 统计分析

  1. 使用 Excel 进行描述性统计分析。
  2. 采用单因素方差分析（ANOVA）和 t检验 在显著性水平0.05下评估不同浓度间的差异。
  3. 使用基于对数的Probit分析计算50%有效浓度（EC50）10-转换后的浓度数据（参见 补充文件 1).

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结果

总酚含量（TPC）、总黄酮含量（TFC）和总单宁含量（TTC）
Tithonia diversifolia 的 TPC、TTC、TFC 和 ABTS 测定结果如表1所示。TPC 以每克干物质所含没食子酸当量毫克数（mg GAE/g DM）表示；TFC 以每克干物质所含槲皮素当量毫克数（mg QE/g DM）表示；TTC 以每克干物质所含儿茶素当量毫克数（mg CE/g DM）表示。抗氧化能力以 ABTS 法测定的半数最大抑制浓度（IC50, µg/mL）表示。

驱虫活性
不同消化道线虫（GIN）种类对提取物的驱虫效应（AH）表现不同：某些提取物可阻断幼虫发育（杀卵效应：较高的% OE/ME），而另一些则抑制L1幼虫孵化（幼虫孵化失败：较高的% LFE）。结果以平均百分比（%）±标准差（SD）表示。LFE指未能孵化的幼虫；OE指桑葚期卵或未能发育成幼虫的卵。PBS对照组在两种虫种中均显示孵化率>70%。噻苯唑（TBZ）作为...

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讨论

本文概述了推进药用植物研究的若干关键步骤。体外实验（如虫卵孵化试验，EHA）具有显著优势，因其可在受控的实验室条件下进行。EHA旨在评估不同浓度的植物提取物对线虫虫卵的活性，并将结果与阳性和阴性对照组进行比较。所得结果为植物来源化合物在开发新型驱虫药物方面的潜力提供了重要依据，尤其是在胃肠道线虫（GINs）对常规药物耐药性日益增强的背景下18,19,20。由于EHA能够高效评估化合物在不同浓度下的活性，特别是在与适当对照进行比较时，因此被广泛应用于驱虫药物的筛选21。

关键步骤
卵的制备：卵的质量和活力对于获得可靠结果至关重要。制备不当可能导致结果不一致，因为卵的孵化率可能因存放时间和操作方式不同而变化。确保卵处于正确的发育阶段，是获得一致数据的关键。环境条件：环境温度和湿度在卵孵化过程...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

向所有信任我们并允许使用其动物进行采样的生产者致以诚挚感谢。Luísa Custódio 获得了葡萄牙科学技术基金会（FCT）通过项目 UIDB/04326/2020（DOI: 10.54499/UIDB/04326/2020）、UIDP/04326/2020（DOI:10.54499/UIDP/04326/2020）、LA/P/0101/2020（DOI:10.54499/LA/P/0101/2020）以及 CEECIND/00425/2017 提供的葡萄牙国家资金支持。Rocio Avila 收到了 Nini's Endowed Internship Fund 的资助，使本项目得以实施，并感谢卡尔顿职业中心提供的专业指导与支持。Griselda Meza 获得了 CONACYT 资助的研究奖学金 Beca de Investigacion BINV02-52 支持。nd 前往葡萄牙进行植物化学检测的资助申请。Ismael Llano 获得了来自 PINV01-306、CONACYT 的 Beca Movility 奖学金，用于在巴西开展卵孵化检测实验。我们还要感谢 Institut Polytechnique UniLaSalle 为拍摄工作提供了设施支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
15 mL 离心管现场提供
48 孔板现场提供
96 孔板VWR 734-0126
ABTSEnzymaticA1088.0005现场提供
学术用光学显微镜和倒置显微镜现场提供
丙酮EnzymaticA/0600/17
氯化铝 Sigma Aldrich6911
DMACA 试剂Sigma Aldrich49825
96% 乙醇EnzymaticVR11202
来自动物的粪便从大学附近的农场收集
福林-酚试剂（Folin Ciocalteau）Sigma AldrichF9252
没食子酸Sigma Aldrich91215
HClSigma Aldrich258148
麦克马斯特计数室（McMaster camera）现场提供
甲醇EnzymaticM/4000/17
PBS现场提供
植物提取物现场提供
过硫酸钾 Sigma Aldrich216224
槲皮素Sigma AldrichQ4951
盐现场提供
碳酸钠 Sigma Aldrich1063920500
噻苯咪唑现场提供
TroloxSigma Aldrich648471现场提供
水现场提供
Whatmann no. 5 滤纸VWR WHAT97039654

参考文献

  1. Vineer, H. R., et al. Increasing importance of anthelmintic resistance in European livestock: Creation and meta-analysis of an open database. Parasite. 27, 69(2020).
  2. Ribeiro, W. L. C., Vilela, V. L. R. Editorial: Alternatives for the control of parasites to promote sustainable livestock. Front Vet Sci. 9, 1097432(2023).
  3. Hodgkinson, J. E., et al. Refugia and anthelmintic resistance: Concepts and challenges. Int J Parasitol Drugs Drug Resist. 10, 51-57 (2019).
  4. Molento, M. B. Parasite control in the age of drug resistance and changing agricultural practices. Vet Parasitol. 163 (3), 229-234 (2009).
  5. Morgan, E. R., van Dijk, J. Climate and the epidemiology of gastrointestinal nematode infections of sheep in Europe. Vet Parasitol. 189 (1), 8-14 (2012).
  6. Hoste, H., Torres-Acosta, J. F. J. Non-chemical control of helminths in ruminants: Adapting solutions for changing worms in a changing world. Vet Parasitol. 180 (1-2), 144-154 (2011).
  7. Mabou Tagne, A., Marino, F., Cosentino, M. Tithonia diversifolia (Hemsl.) A. Gray as a medicinal plant: A comprehensive review of its ethnopharmacology, phytochemistry, pharmacotoxicology and clinical relevance. J Ethnopharmacol. 220, 94-116 (2018).
  8. Pawłowska, M., Mila-Kierzenkowska, C., Szczegielniak, J., Woźniak, A. Oxidative stress in parasitic diseases-reactive oxygen species as mediators of interactions between the host and the parasites. Antioxidants. 13 (1), 38(2024).
  9. Maldonado, E., Rojas, D. A., Morales, S., Miralles, V., Solari, A. Dual and opposite roles of reactive oxygen species (ROS) in Chagas disease: Beneficial on the pathogen and harmful on the host. Oxid Med Cell Longev. 2020, 8867701(2020).
  10. Adamu, M., Naidoo, V., Eloff, J. N. Efficacy and toxicity of thirteen plant leaf acetone extracts used in ethnoveterinary medicine in South Africa on egg hatching and larval development of Haemonchus contortus. BMC Vet Res. 9, 38(2013).
  11. Molan, A. L. Effect of purified condensed tannins from pine bark on larval motility, egg hatching and larval development of Teladorsagia circumcincta and Trichostrongylus colubriformis (Nematoda: Trichostrongylidae). Folia Parasitol. 61 (4), 371-376 (2014).
  12. Eguale, T., Tadesse, D., Giday, M. In vitro anthelmintic activity of crude extracts of five medicinal plants against egg-hatching and larval development of Haemonchus contortus. J Ethnopharmacol. 137 (1), 108-113 (2011).
  13. von Samson-Himmelstjerna, G., et al. Standardization of the egg hatch test for the detection of benzimidazole resistance in parasitic nematodes. Parasitol. Res. 105, 825-834 (2009).
  14. Robles-Pérez, D., Martínez-Pérez, J. M., Rojo-Vázquez, F. A., Martínez-Valladares, M. Screening anthelmintic resistance to triclabendazole in Fasciola hepatica isolated from sheep by means of an egg hatch assay. BMC Vet Res. 11, 5(2015).
  15. War, A. R., Paulraj, M. G., War, M. Y., Ignacimuthu, S., Sharma, H. C. Mechanisms of plant defense against insect herbivores. Plant Signal Behav. 7, 1306-1320 (2012).
  16. Veeresham, C. Natural products derived from plants as a source of drugs. J Adv Pharm Technol Res. 3, 200-201 (2012).
  17. Barthwal, R., Mahar, R. Exploring the significance, extraction, and characterization of plant-derived secondary metabolites in complex mixtures. Metabolites. 14, 119(2024).
  18. Vargas-Magaña, J. J., et al. Anthelmintic activity of acetone-water extracts against Haemonchus contortus eggs: Interactions between tannins and other plant secondary compounds. Vet Parasitol. 206, 199-206 (2014).
  19. Gertrude, M., et al. In vitro anthelmintic activity of Bidens pilosa Linn. (Asteraceae) leaf extracts against Haemonchus contortus eggs and larvae. Eur J Med Plants. 4, 1325-1333 (2014).
  20. Castañeda-Ramírez, G. S., et al. Bio-guided fractionation to identify Senegalia gaumeri leaf extract compounds with anthelmintic activity against Haemonchus contortus eggs and larvae. Vet Parasitol. 270, 13-19 (2019).
  21. Chan-Pérez, J. I., et al. In vitro susceptibility of ten Haemonchus contortus isolates from different geographical origins towards acetone:water extracts of two tannin-rich plants. Vet Parasitol. 217, 53-60 (2016).
  22. Alonso-Díaz, M. A., Torres-Acosta, J. F. J., Sandoval-Castro, C. A., Hoste, H. Comparing the sensitivity of two in vitro assays to evaluate the anthelmintic activity of tropical tannin-rich plant extracts against Haemonchus contortus. Vet Parasitol. 181 (2-4), 360-364 (2011).
  23. Meza Ocampos, G., et al. Two in vitro anthelmintic assays of four Paraguayan medicinal plants for proof of concept of the role of polyphenols in their biological activities and LC-HRMS analysis. J Ethnopharmacol. 312, 116453(2023).
  24. Babják, M., Königová, A., Urda Dolinská, M., Vadlejch, J., Várady, M. Anthelmintic resistance in goat herds-In vivo versus in vitro detection methods. Vet Parasitol. 254, 10-14 (2018).
  25. Elfawal, M. A., et al. High-throughput screening of more than 30,000 compounds for anthelmintics against gastrointestinal nematode parasites. ACS Infect Dis. 11 (1), 1-11 (2025).
  26. de Araújo Sanchez, C., et al. In vivo anthelmintic activity of hydroethanolic extract of Piper cubeba fruits in sheep naturally infected with gastrointestinal nematodes. Vet Parasitol. 333, 110348(2025).
  27. Hördegen, P., Cabaret, J., Hertzberg, H., Langhans, W., Maurer, V. In vitro screening of six anthelmintic plant products against larval Haemonchus contortus with a modified methyl-thiazolyl-tetrazolium reduction assay. J Ethnopharmacol. 108 (1), 85-89 (2006).

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