方法文章

高通量观察运动表型的方法 铜绿假单胞菌

DOI：

10.3791/67761

⸱

2025年6月20日

 , 
1Département de biologie, Faculté des sciences, Université de Sherbrooke

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本方案介绍了一种快速高效的方法，用于鉴定铜绿假单胞菌中参与多种运动类型的遗传因子。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

运动行为通常在细菌利用其环境中可用资源的能力方面发挥着重要作用。这对于多功能病原体Pseudomonas aeruginosa尤为如此，该菌可表现出多种运动方式，包括群集运动和抽搐运动，这些是重要的致病特征，有助于表面定植、生物膜形成以及逃避免疫防御。本文介绍了一种高通量运动性实验方案，用于研究P. aeruginosa的运动行为。该方案可同时检测来自全基因组突变文库的多种P. aeruginosa菌株，例如用于鉴定和分析参与其运动性的遗传因子。该方法能够全面研究细菌运动性，并深入揭示P. aeruginosa运动背后的分子机制。本文所述方案还可进行调整，以适用于不同类型的运动性检测以及其他细菌物种，从而为深入理解各种情境下细菌行为提供一个强大的研究平台。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pseudomonas aeruginosa 是一种机会性病原体，由于其显著的代谢多功能性，能够定植于多种环境1,2。这种多功能性对于其从浮游生长模式向生物膜转变至关重要，从而使其能够在从水体到人体等多种生态位中旺盛生长3,4,5。这些生长模式之间的转换得益于其广泛的运动能力，可通过多种运动方式在环境中迁移，包括游动、群集运动和抽搐运动1,6。每种运动方式均由不同的机制和细胞结构介导，使 P. aeruginosa 能够响应环境信号7,8。游动运动由单一极生鞭毛驱动，例如可用于在液体培养基中向营养物质移动9。群集运动是一种由鞭毛和生物表面活性剂产生所介导的协调性运动，可使菌落在半固体表面扩散10,11。最后，抽搐运动不依赖鞭毛，而是由 IV 型菌毛（T4P）介导，用于在表面进行移动12,13。抽搐运动还通过提供初始表面附着，参与 P. aeruginosa 生物膜形成的早期阶段。在初始附着之后，抽搐运动使细菌能够在表面移动并形成微菌落，进而发育为成熟的生物膜1,4,13。

传统上，细菌运动性实验通常一次只针对一个菌株进行，使用软琼脂平板或显微镜方法6,14,15。半固体培养基已被用于细菌运动性研究多年。如今，这些技术仍被用于鉴定细菌的运动表型。例如，传统上通过将2.5 µL的P. aeruginosa培养物接种到含有M9培养基且琼脂浓度为0.5%-0.8%的培养皿中央来观察群体运动（swarming motility）16。抽搐运动（twitching motility）通常通过观察细菌在琼脂（1%浓度）与培养皿底部界面处的扩散情况来测定，方法是用穿刺法将P. aeruginosa接种穿过培养基。接种后经48小时培养，可观察到明显的菌落间扩展晕圈，而无抽搐运动能力的菌株则不会形成此类扩展区域1,17,18。

最近，转座子诱变方法已发现了一些参与运动性或生物膜形成的新的基因 P. aeruginosa19,20,21例如，利用高密度转座子突变体文库发现了参与抽搐运动的新基因 在铜绿假单胞菌中19功能基因组学中的另一个有用工具是有序突变体文库的应用22,23. Keio文库24，包含所有非必需基因的单基因缺失 大肠杆菌，可能是最著名的突变体集合，已被用于鉴定影响在不同培养基中生长等多种表型的基因25 细胞形态学26 以及更多内容。此类合集也可用于 肠炎沙门氏菌 血清型鼠伤寒沙门氏菌27, 枯草芽孢杆菌28, P. aeruginosa29 以及许多其他物种。这些菌株集合也非常适合以全基因组范围的方式研究运动性，从而推动了一种高通量方法的发展，用于研究运动性 P. aeruginosa在此，通过评估突变体的贡献对该方法进行了测试 P. aeruginosa 在高密度平板上，该方法可同时检测抽搐运动和群集运动。这种高通量方法适用于多种运动表型的研究，也可用于其他细菌运动能力的分析。

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方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

注意：本实验流程的总体工作流程如图1所示。

运动性检测工作流程：铜绿假单胞菌转座子文库，96/384孔板，表型分析。
图1：实验工作流程。（1）根据实验中关注的运动类型，制备相应数量的运动性培养基。（2）使用手动或自动复制系统，以适当密度制备铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）转座子插入突变体文库的源板，重点确保接种的精确性和各孔之间接种量的一致性。（3）将突变体文库源板中的样品转移至运动性检测平板。（4）培养后，观察并分析运动性表型，并利用高质量图像鉴定与目标运动性相关的基因。（5）通过传统运动性检测方法验证高通量运动性实验中发现的阳性结果。图片由BioRender生成。请点击此处查看该图的放大版本。

群集平板 - M9 培养基抽搐平板 - LB 培养基接种平板 - LB 培养基
200 mL 的 5x M9 盐溶液10 g NaCl 10 g NaCl 
10 mL 的 20% 葡萄糖10 g 胰蛋白胨 10 g 胰蛋白胨 
25 mL 酪蛋白氨基酸5 g 酵母提取物 5 g 酵母提取物 
1 mL 的 1M MgSO410 g 琼脂 15 g 琼脂 
500 mL 的 1% 琼脂加 dH2O 至 1L加 dH2O 至 1L
加 dH2O 至 1L庆大霉素（终浓度 15 µg/mL）

表1：实验中所用各种培养皿的培养基成分。

1. 准备培养基平板

注意：请参见材料表以准备储备溶液和储存条件。平板应在水平表面上加样。干燥时，平板应平放于表面（即不可堆叠），以确保平板内的培养基均匀干燥。任何具有标准 footprint 的单孔板均可使用，但内部尺寸较大（无内壁）的平板（如 Singer Instruments Plus 板或 VWR 未处理单孔组织培养板）可支持每板更高密度的菌落生长，便于操作。

  1. 根据表1中的配方，准备实验所需适量的培养基。将培养基保持在约45 ˚C–50 ˚C，以防止琼脂凝固。
    1. 对于来源平板，准备59个含有1.5%琼脂和15 µg/mL庆大霉素的LB（溶菌肉汤）平板，用于扩增完整的PA14文库——59 × 25 mL ≈ 1500 mL。另准备15个LB 1.5%琼脂加15 µg/mL庆大霉素的平板，用于在384密度格式下扩增文库——15 × 25 mL = ~400 mL。
    2. twitching平板：若采用96密度格式，准备59个twitching平板（LB 1%琼脂）；若采用384密度格式，则准备15个twitching平板。
    3. swarming平板：准备15个（384密度格式）或59个（96密度格式）swarming平板（M9-葡萄糖 0.5%琼脂）。
  2. 打开平板盖，每板倒入25 mL培养基。通过依次轻轻抬起平板的每个角，使培养基均匀分布于平板表面。重复此晃动动作2–3次。然后将盖子重新盖好。
  3. 让平板在室温（RT）下静置过夜，使其凝固并干燥。若平板不能立即使用，请将其放入密封袋中，并储存在干燥处，可保存3周。

2. 源板的制备 P. aeruginosa 转座子突变体文库

注意：源板是指含有PA14文库拷贝的LBA-庆大霉素平板，后续用于接种运动性平板。P. aeruginosa 转座子突变文库（PA14文库）包含59块冷冻的96孔板29。以下将分别描述为每种格式制备源板的步骤。本方案适用于不具备Rotor+点样仪的实验室。研究人员可使用手动复制工具成功完成相同的实验操作，例如本实验在第1天用于复制PA14文库冷冻板的弹簧加载式96针复制器（参见材料表），或其他任何96针复制器。手动复制器每次使用前后均需灭菌，并待其冷却后方可再次使用。

  1. 第1天：将PA14文库从59个冷冻的96孔板复制到源板
    1. 将弹簧加载的96针复制器置于加热板上，在最高温度下加热8分钟以进行灭菌。灭菌后，让复制器充分冷却（约10分钟），以避免杀死细菌。
    2. 取一个源板。使用无菌的96针复制器，小心地将复制器的针浸入一个96孔板中，然后直接将细胞转移到源板表面。重复此操作，直至将PA14文库中全部59个冷冻保存的96孔板均复制到源板上。
    3. 将96孔源板在37 °C下孵育16–18小时。
      注意：如果采用96孔密度格式进行实验，可直接使用这些源板接种运动性平板。
  2. 第2天：从96孔密度格式扩增至384孔游戏副本
    注意：若以96孔密度培养，可跳过第2天操作。
    1. 孵育结束后，将培养皿平放在台面上（不要叠放），于室温下静置约1小时使其冷却。若皿盖上有冷凝水，需使用精细擦拭纸小心去除，以防止水滴落入培养皿中导致菌落间的交叉污染。
    2. 使用以下参数配置复制器，以确保菌落转移的准确性。开启 开启 复制器。在“选择操作模式”部分，选择 选择并运行存储的程序.
    3. 在“选择源板”部分，选择 PlusPlate 96 琼脂在“选择目标板”部分，选择 PlusPlate 384 琼脂在“选择垫片”部分，选择 短针 96.
    4. 在“重复程序选项”部分，选择 通用 并点击 回收利用 > 无.
    5. 在“源”部分，选择 偏移量 并点击 随机 > 默认半径在“靶标”部分，选择 固定 并将压力调整至20%。其余设置均保持默认。
    6. 将短针 RePads 96 插入相应的隔间中。
    7. 将源板和目标板放置在复制仪的指定平台上。将96孔密度的源板（1、2、3和4号板）以及新的空源板（LBA平板）放置于平台上。根据所选参数，微生物阵列点样机器人将把菌落从96孔密度板转移至新的384孔密度板。按下 运行.
    8. 更换平台上的所有培养板（接下来的四块96孔密度源板和一块新的空源板），并重复此过程，直至所有培养板均完成扩增。对于最后一组培养板，使用第57、58、59和1号板。每块384孔密度培养板将由四块96孔密度培养板的菌落交替组成（参见 图2)。将384孔密度的LBA平板在37 °C孵育16–18小时。
      注意：这些384孔密度的源板可用于接种运动性平板，以在384孔密度下执行本实验方案。在培养后的任何步骤中，平板可在4 °C保存最多3周。

显示颜色编码数据分组的层次聚类图。
图 2：从 96 孔密度板扩增至 384 孔密度板。 来自四个 96 孔密度源板的菌落被转移并合并至一个 384 孔密度板中。384 孔密度板的每个象限对应一个原始的 96 孔板（红色、蓝色、黄色和绿色），以保持每个突变株的位置。由 BioRender 创建。 请点击此处查看该图的放大版本。

3. 高通量运动性实验

注意：此处采用384孔密度格式进行该实验方案，但通过将复制仪的参数调整为从源板向运动性检测板转移时选择96孔模式而非384孔模式，即可将相同方案适配至96孔密度格式。

  1. 孵育结束后，将培养皿平放在台面上（勿叠放），于室温下静置约1小时使其冷却。若皿盖出现冷凝水，需使用精细擦拭纸小心擦除，以防止水滴落入培养皿中导致菌落间的交叉污染。
  2. 根据所需实验，准备相应数量的平板：运动性实验使用含0.5%葡萄糖的M9琼脂平板，LB平板用于一般培养，表面运动实验使用含1%琼脂的LB平板。96孔密度格式需59块平板，384孔密度格式需15块平板。
  3. 使用以下参数配置复制器，以确保菌落转移的准确性。
    1. 转动 开启 复制器。在“选择操作模式”部分，选择 选择并运行存储的程序在“选择源板”部分，选择 PlusPlate 384 琼脂.
    2. 在“选择目标板”部分，选择 PlusPlate 384 琼脂在“选择垫片”部分，选择 短针 384在“复制程序选项”部分，选择 通用 > 回收利用 > 无.
    3. 在 Singer 项目，选择 重复多次.
    4. 在“源”部分，选择 偏移量 > 随机 > 默认半径在“靶标”部分，选择 固定 并将压力调整至2%。其余所有设置保持默认。
  4. 将384孔短针RePads插入相应的隔间中。
  5. 将源板和目标板放置在复制器的指定平台上。将384密度的源板和空的运动性检测板放入平台中。按下 使用选定参数运行微生物阵列针取机器人将从384密度的源板上转移菌落至运动性检测板。每块384密度的板将包含一块384密度源板的复制。
  6. 确保转移均匀，并将所有菌落适当地点种到运动性平板的琼脂表面。将接种好的运动性平板放入塑料袋中。将装有平板的塑料袋小心地置于37 °C培养箱中孵育18 h。
    注意：将培养皿放入袋中以保持湿度，防止不均匀干燥。将培养皿放入培养箱中，皿盖朝上。
  7. 孵育后，检查运动性平板上菌落生长是否均匀，以及有无污染。
  8. 第3天：成像运动性平板
    注意：Singer Instruments PhenoBooth 用于拍摄运动性平板的高分辨率图像。该设备采用科研级相机，可生成2300万像素的图像，并配备五个照明通道，能够从培养皿和矩形平板中获取菌落的高分辨率图像。其他高质量成像系统亦可使用。
    1. 孵育结束后，运动性平板即可进行成像。打开 开启 Phenobooth 并点击 图标 对应于 Phenobooth 软件。
    2. 选择项目页面打开；点击 新项目 > 菌落计数. 选择 期望的文件路径 在“位置”字段中存储图像。在“分辨率”字段中选择 5626 x 4220. 点击 好的此时，设备已准备就绪，可以拍照。
    3. 将培养板去盖后，培养基面朝上放入读板仪中。在关闭读板仪前，确保培养板已正确放置，以避免卡板。
    4. 在“照明”选项卡中将参数设置为白光。单击 预览在PhenoBooth设置选项卡中调整曝光参数，以获得观察运动表型的最佳条件。
    5. 点击 获取捕获的图像将显示在屏幕左侧。完成后，关闭软件（所有捕获的图像将保存在位置选项卡中先前选择的文件中）。
      注意：Phenobooth 以 JPEG 格式保存图像，但后续分析步骤中的图像可以采用 TIFF、JPEG 或 PNG 格式。

4. 运动表型的分析

注意：图像分析的详细操作方法由 French 等人30,31进行了描述。用于数据分析的脚本可从31（ImageJ 宏）获取。

  1. 简而言之，图像在 ImageJ32 中进行处理，为运动性平板上的每个菌落生成一个数值。首先，将图像转换为 8 位格式，并使用阈值命令将菌落及其相关的运动区域从背景中分割出来。在每个菌落周围绘制感兴趣区域（Region of Interest, ROI），并测量其运动区域。这将生成一个表格，其中包含按行组织的每个孔的积分密度值。该表格可保存为 CSV 文件以供进一步分析。
    1. 在 ImageJ 中运行宏，并打开包含图像的文件夹。
    2. 当系统提示时，使用“预览”（Preview）选项调整平板的旋转角度，使平板呈水平状态。确认无误后，点击 OK 按钮。
    3. 接下来，移动矩形框围绕菌落区域，用于裁剪出包含菌落的平板部分。准备就绪后，点击 OK 按钮。
    4. 下一个提示将定义用于在每个菌落周围绘制 ROI 并测量运动区域的网格。选择合适的菌落密度。根据需要调整各项参数，确保每个圆圈均围绕一个菌落。准备就绪后，勾选“Okay?”复选框，然后点击 OK 按钮。此操作将测量每个菌落的运动区域，并将数据保存为 CSV 文件至包含原始数据的文件夹中。
  2. 将此 CSV 文件与同样按行组织的平板图例合并，以将每个运动区域对应至相应的突变株。较低的积分密度值代表无运动能力或运动能力下降的突变株。

5. 验证阳性结果的传统运动性检测方法

注意：在高通量运动性实验方案中观察到运动性受影响的突变体后，重要的是对获得的阳性结果进行单独验证。个体运动性实验方案与高通量检测所用的方案不同，但使用的培养基相同。

  1. 群集运动性检测
    注意：群集运动性检测方法详见 Ha 等人16的描述。
    1. 简言之，将含有 M9 培养基（0.5% 琼脂）、葡萄糖、酪蛋白氨基酸和 MgSO4 的琼脂溶液进行高压灭菌。将冷却后的混合琼脂倒入培养皿中（每皿 25 mL）。
    2. 加入 2.5 µL 过夜培养的细菌菌液进行接种。于 37 °C 培养 18 小时，皿盖朝上放置，以观察运动性表型。
  2. 抽搐运动性检测
    注意：抽搐运动性检测方法详见 Haley 等人33,34的描述。
    1. 简言之，将 LB 1% 琼脂培养基（见表 1）进行高压灭菌。将冷却后的 LB 1% 琼脂倒入培养皿中（每皿 25 mL）。
    2. 用接种针将细菌穿刺接种至抽搐运动检测平板（1% 琼脂）底部。于 37 °C 培养 48 小时，随后在室温下继续培养 48 小时。取出琼脂块，用 1% 结晶紫对培养皿染色以观察抽搐运动区域。
    3. 使用 PhenoBooth 按照步骤 3 中所述相同参数拍摄培养皿照片。

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们采用该方案来表征基因失活对细胞运动性的影响 P. aeruginosa 高通量条件下。本文详细描述了其在全基因组敲除文库中用于研究群集运动和抽搐运动的方法。 P. aeruginosa 菌株PA14（PA14文库）。该方案具有高度的灵活性和易用性，可对不同步骤进行修改，例如使用不同的培养基或突变体文库。

根据突变体的运动区域对其进行评分。平板上大多数突变体不会影响铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）的运动能力，因此将平板上所有突变体的运动能力平均值视为野生型（WT）。运动区域与平均值存在显著差异的突变体被认为具有运动缺陷。对所测试的突变体进行排序后，选取排名后15%的突变体以确保筛选的严格性。随后，部分这些突变体通过传统实验方法进行了验证。在本分析中未发现运动表型高于平均值的突变体。该方法在鉴定运动能力降低的突变体方面尤为有效，因为此类表型更易于观察。

首先使用高通量运动性实验方案检测PA14文库中突变株的抽搐运动能力（

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文所述的高通量运动性实验方案使我们能够精确且可重复地处理和分析大量菌落的运动表型。与传统的手动方法相比，这种半自动化方法提高了运动性检测的可扩展性和通量，从而实现对细菌运动性的全基因组水平评估。该方案已针对PA14文库进行了优化，但也可用于其他有序突变体文库，例如大肠杆菌（E. coli）的Keio文库24或伤寒沙门菌（Salmonella enterica）鼠伤寒血清型的SGD文库27。此外，该方案还可进一步优化，以适用于菌株文库而非突变体文库。例如，该方案可用于分析从囊性纤维化患者中分离的一组铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）菌株的运动表型。针对特定菌株或实验条件，可能需要对该方法进行适当修改和故障排查。例如，通过调整运动性实验中琼脂的浓度，可评估铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）的不同运动类型（如群集运动和抽搐运动）（图3、图4<...

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者声明无利益冲突。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

感谢麦克马斯特大学的Surette实验室提供了PA14文库的副本。感谢Fabrice Jean-Pierre博士对本文手稿提出的宝贵意见。本研究得到了加拿大自然科学与工程研究理事会（RGPIN-2019-06044）以及魁北克健康研究基金会（Fonds de recherche du Québec - Santé，FRQS；#295613）为新研究者提供的启动资助。J.-P.C. 获得了魁北克健康研究基金会（FRQS）授予的青年学者奖学金（Chercheur boursier junior 2）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
96孔板  康宁  3701 
琼脂 Fisher Scientific  BP1423-2 分别用于群集运动的终浓度为0.5%，或用于抽搐运动的终浓度为1%。 
酪蛋白氨基酸  Fisher Scientific  223050 配制20%的水溶液，用0.22 μm滤膜过滤除菌 μm 滤膜过滤并于 4 ℃ 保存 °C. 在M9最小培养基中终浓度为0.5%。 
结晶紫 Bio Basic  CB0331配制1%的水溶液。 
D-葡萄糖  Bio Basic  GB0219 配制20%（1.1 M）水溶液，经高压灭菌。在M9最小培养基中的终浓度为0.2%。 
Filtropur S 0.2 Sarstedt 83.1826.001
硫酸庆大霉素  Bio Basic  GB0217 配制30 mg/ml的水溶液母液，使用0.22 μm滤膜过滤除菌 μm 滤膜过滤并于 4 ℃ 保存 °C – 孔板中的终浓度为15 µg/mL  
接种环与接种针 Fisher Scientific 22363597
5X M9 最小培养基盐溶液 Fisher Scientific 248510配制1M水溶液，经高压灭菌。在M9最小培养基中的终浓度为1 mM。  
硫酸镁（MgSO4）  Fisher Scientific M63-500 配制 1 M MgSO4 水溶液储备液。使用 0.22 μm 滤膜过滤除菌。 μm 滤膜过滤并在室温下保存。终浓度 
PA14 转座子插入突变体文库  Liberati 等，2006（见参考文献 29）59 块 96 孔板用于完整保藏，每孔含有溶于含 25% 甘油 LB 培养基中的单个突变株。 
培养皿 92x16 mm Sarstedt 82.1473.001
PhenoBooth+ Singer Instruments https://www.singerinstruments.com/solution/phenobooth/specification/ 将11.3 g粉末溶解于200 mL纯化水中。121℃高压灭菌 °15 分钟，C 
10 mL 塑料注射器 Fisher Scientific 14955459
转子+   Singer Instruments https://www.singerinstruments.com/resource/rotor-hda/ 
短针 RePads 384 密度 Singer Instruments  REP-004 
短针 RePads 96 密度  Singer Instruments  REP-002 
氯化钠（NaCl）  Fisher Scientific BP358-212 
弹簧加载式96针复制器EnzyScreen  CR1000 
手术刀片 不锈钢 No. 25 Fisher Scientific 08-918-5F
胰蛋白胨 Oxoid  LP0042B 
Uniwell 板Singer Instruments  PlusPlates：PLU-003  板尺寸：54 × 34 × 38 厘米——无内壁结构，可提供更大的内部尺寸。 
Uniwell 板VWR单孔组织培养板：75780-348与 PlusPlates 具有相同的尺寸。
酵母提取物 Fisher Scientific 248510 

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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