高通量观察运动表型的方法 铜绿假单胞菌

摘要

本方案介绍了一种快速高效的方法，用于鉴定铜绿假单胞菌中参与多种运动类型的遗传因子。

摘要

运动行为通常在细菌利用其环境中可用资源的能力方面发挥着重要作用。这对于多功能病原体Pseudomonas aeruginosa尤为如此，该菌可表现出多种运动方式，包括群集运动和抽搐运动，这些是重要的致病特征，有助于表面定植、生物膜形成以及逃避免疫防御。本文介绍了一种高通量运动性实验方案，用于研究P. aeruginosa的运动行为。该方案可同时检测来自全基因组突变文库的多种P. aeruginosa菌株，例如用于鉴定和分析参与其运动性的遗传因子。该方法能够全面研究细菌运动性，并深入揭示P. aeruginosa运动背后的分子机制。本文所述方案还可进行调整，以适用于不同类型的运动性检测以及其他细菌物种，从而为深入理解各种情境下细菌行为提供一个强大的研究平台。

引言

Pseudomonas aeruginosa 是一种机会性病原体，由于其显著的代谢多功能性，能够定植于多种环境^1,2。这种多功能性对于其从浮游生长模式向生物膜转变至关重要，从而使其能够在从水体到人体等多种生态位中旺盛生长^3,4,5。这些生长模式之间的转换得益于其广泛的运动能力，可通过多种运动方式在环境中迁移，包括游动、群集运动和抽搐运动^1,6。每种运动方式均由不同的机制和细胞结构介导，使 P. aeruginosa 能够响应环境信号^7,8。游动运动由单一极生鞭毛驱动，例如可用于在液体培养基中向营养物质移动⁹。群集运动是一种由鞭毛和生物表面活性剂产生所介导的协调性运动，可使菌落在半固体表面扩散^10,11....

方案

注意：本实验流程的总体工作流程如图1所示。

图1：实验工作流程。（1）根据实验中关注的运动类型，制备相应数量的运动性培养基。（2）使用手动或自动复制系统，以适当密度制备铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）转座子插入突变体文库的源板，重点确保接种的精确性和各孔之间接种量的一致性。（3）将突变体文库源板中的样品转移至运动性检测平板。（4）培养后，观察并分析运动性表型，并利用高质量图像鉴定与目标运动性相关的基因。（5）通过传统运动性检测方法验证高通量运动性实验中发现的阳性结果。图片由BioRender生成。

结果

我们采用该方案来表征基因失活对细胞运动性的影响 P. aeruginosa 高通量条件下。本文详细描述了其在全基因组敲除文库中用于研究群集运动和抽搐运动的方法。 P. aeruginosa 菌株PA14（PA14文库）。该方案具有高度的灵活性和易用性，可对不同步骤进行修改，例如使用不同的培养基或突变体文库。

根据突变体的运动区域对其进行评分。平板上大多数突变体不会影响铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）的运动能力，因此将平板上所有突变体的运动能力平均值视为野生型（WT）。运动区域与平均值存在显著差异的突变体被认为具有运动缺陷。对所测试的突变体进行排序后，选取排名后15%的突变体以确保筛选的严格性。随后，部分这些突变体通过传统实验方法进行了验证。在本分析中未发现运动表型高于平均值的突变体。该方法在鉴定运动能力降低的突变体方面尤为有效，因为此类表型更易于观察。

首先使用高通量运动性实验方案检测PA14文库中突变株的抽搐运动能力（

讨论

本文所述的高通量运动性实验方案使我们能够精确且可重复地处理和分析大量菌落的运动表型。与传统的手动方法相比，这种半自动化方法提高了运动性检测的可扩展性和通量，从而实现对细菌运动性的全基因组水平评估。该方案已针对PA14文库进行了优化，但也可用于其他有序突变体文库，例如大肠杆菌（E. coli）的Keio文库²⁴或伤寒沙门菌（Salmonella enterica）鼠伤寒血清型的SGD文库²⁷。此外，该方案还可进一步优化，以适用于菌株文库而非突变体文库。例如，该方案可用于分析从囊性纤维化患者中分离的一组铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）菌株的运动表型。针对特定菌株或实验条件，可能需要对该方法进行适当修改和故障排查。例如，通过调整运动性实验中琼脂的浓度，可评估铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）的不同运动类型（如群集运动和抽搐运动）（图3、图4<.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
96孔板	康宁	3701
琼脂	Fisher Scientific	BP1423-2	分别用于群集运动的终浓度为0.5%，或用于抽搐运动的终浓度为1%。
酪蛋白氨基酸	Fisher Scientific	223050	配制20%的水溶液，用0.22 μm滤膜过滤除菌 μm 滤膜过滤并于 4 ℃ 保存 °C. 在M9最小培养基中终浓度为0.5%。
结晶紫	Bio Basic	CB0331	配制1%的水溶液。
D-葡萄糖	Bio Basic	GB0219	配制20%（1.1 M）水溶液，经高压灭菌。在M9最小培养基中的终浓度为0.2%。
Filtropur S 0.2	Sarstedt	83.1826.001
硫酸庆大霉素	Bio Basic	GB0217	配制30 mg/ml的水溶液母液，使用0.22 μm滤膜过滤除菌 μm 滤膜过滤并于 4 ℃ 保存 °C – 孔板中的终浓度为15 µg/mL
接种环与接种针	Fisher Scientific	22363597
5X M9 最小培养基盐溶液	Fisher Scientific	248510	配制1M水溶液，经高压灭菌。在M9最小培养基中的终浓度为1 mM。
硫酸镁（MgSO4）	Fisher Scientific	M63-500	配制 1 M MgSO4 水溶液储备液。使用 0.22 μm 滤膜过滤除菌。 μm 滤膜过滤并在室温下保存。终浓度
PA14 转座子插入突变体文库		Liberati 等，2006（见参考文献 29）	59 块 96 孔板用于完整保藏，每孔含有溶于含 25% 甘油 LB 培养基中的单个突变株。
培养皿 92x16 mm	Sarstedt	82.1473.001
PhenoBooth+	Singer Instruments	https://www.singerinstruments.com/solution/phenobooth/specification/	将11.3 g粉末溶解于200 mL纯化水中。121℃高压灭菌 °15 分钟，C
10 mL 塑料注射器	Fisher Scientific	14955459
转子+	Singer Instruments	https://www.singerinstruments.com/resource/rotor-hda/
短针 RePads 384 密度	Singer Instruments	REP-004
短针 RePads 96 密度	Singer Instruments	REP-002
氯化钠（NaCl）	Fisher Scientific	BP358-212
弹簧加载式96针复制器	EnzyScreen	CR1000
手术刀片 不锈钢 No. 25	Fisher Scientific	08-918-5F
胰蛋白胨	Oxoid	LP0042B
Uniwell 板	Singer Instruments	PlusPlates：PLU-003	板尺寸：54 × 34 × 38 厘米——无内壁结构，可提供更大的内部尺寸。
Uniwell 板	VWR	单孔组织培养板：75780-348	与 PlusPlates 具有相同的尺寸。
酵母提取物	Fisher Scientific	248510