观察铜绿假单胞菌运动表型的高通量方法

Summary

该方案提供了一种快速有效的方法，用于鉴定参与铜绿假单胞菌中各种类型运动的遗传因子。

Abstract

运动行为通常在细菌利用其环境中可用资源的能力中起着重要作用。对于多功能病原体铜 绿假单胞菌尤其如此，它可以表现出多种类型的运动，包括蜂群和抽搐，这是导致表面定植、生物膜形成和逃避宿主防御的重要致病性状。本手稿提出了一种高通量运动方案来研究 铜绿假单胞菌的运动行为。例如，该协议允许同时测试来自全基因组突变文库的多种铜 绿假单 胞菌菌株，以识别和分析参与其运动的遗传因素。该方法为全面研究运动和深入了解 铜绿假单 胞菌运动的分子机制提供了可能性。此处描述的方案也可以进行修改以适应不同类型的运动测定以及其他细菌种类，从而为促进对各种情况下细菌行为的理解提供了一个强大的平台。

Introduction

铜绿假单胞菌是一种机会性病原体，由于其卓越的代谢多功能性，可以在各种环境中定植 ^1,2。这种多功能性对于从浮游生长模式过渡到生物膜至关重要，这有助于其在从水到人体的广泛生态位中茁壮成长的能力 ^3,4,5。这些生长模式之间的过渡得益于使用各种类型的运动在这些环境中移动的广泛能力，包括游泳、蜂群和抽搐 ^1,6。每种类型的运动都由不同的机制和细胞结构介导，并允许铜绿假单胞菌对环境线索做出反应 ^7,8。游泳运动由单个极性鞭毛驱动，用于通过液体介质向营养物质移动，例如⁹。蜂群运动是由鞭毛和生物表面活性剂的产生促进的协调运动，并允许菌落在半固体表面上传播^10,11

Protocol

注意：此过程的一般工作流程如图 1 所示。

图 1：实验工作流程。 （1） 根据实验中感兴趣的运动类型准备必要数量的运动培养基。（2） 使用手动或自动复制器系统，以适当的密度为突变体集合的铜 绿假单 胞菌转座子插入突变文库准备源储备板，强调板所有孔的精确和均匀接种。（3） 将样品从突变体集合的源板转移到运动板。（4） 孵育后，观察和分析运动表型，并使用高质量图像鉴定参与目标运动的基因。（5） 进行传统的运动测定，以验证通过高通量运动实验鉴定的命中。使用 BioRender 创建。 请单击此处查看此图的较大版本。

Results

我们使用此方案来表征基因失活对高通量铜 绿假单 胞菌运动的影响。在这里，我们详细介绍了它用于研究 P 全基因组缺失集合中的蜂群和抽搐运动。 铜绿假单 胞菌菌株 PA14 （PA14 文库）。该方案具有很强的多功能性和易用性，允许修改方案的不同步骤，例如使用不同的培养基或突变体集合。

突变体根据它们的运动区域进行评分。平板上的大多数突变体不会影响 铜绿假单 胞菌的运动，因此平板上所有突变体的运动平均值被认为是 WT。运动区域与平均值显着不同的突变体被认为具有运动缺陷。对测试的突变体进行排名，并选择最低 15% 的突变体为严格突变体。然后，使用传统测定法确认其中一些突变体。在该分析中未鉴定出表现出大于平均值的运动表型的突变体。这种方法对于识别运动表型降低的突变体特别有效，因为它们的可视化更清晰。

首先使用高通量运动方案检查来自 PA14 文库的突变体的抽搐运动（

Discussion

此处描述的高通量运动方案使我们能够精确且可重复地处理和分析许多菌落的运动表型。与传统的手动方法相比，这种半自动方法提高了运动检测的可扩展性和通量，从而可以对细菌运动进行全基因组评估。该方案已针对与 PA14 文库一起使用进行了优化，但该测定可用于任何有序的突变体文库，例如 大肠杆菌²⁴ 的 Keio 集合或鼠伤寒沙 门氏菌 血清型²⁷ 的 SGD 集合。此外，该协议还可以优化为使用菌株库而不是突变体库。例如，该方案将有助于确定从囊性纤维化患者中分离的 铜绿假单 胞菌菌株文库的运动表型。可能需要对方法进行修改和故障排除，以针对特定菌株或实验条件优化方案。例如，在运动测定中调整琼脂的浓度使我们能够评估 铜绿假单 胞菌不同类型的运动（蜂群和抽搐）（图 3、 图 4），但其他类.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
96个井板及nbsp;	康宁	3701
Agar	费舍尔科学公司;	BP1423-2	最终分群运动浓度为0.5%，抽搐运动为1%。
氨基酸	费舍尔科学公司;	223050	准备20%的水汤。滤器用0.22 & mu进行灭菌;m过滤并储存在4 & C。最终浓度为0.5%，M9 最低介质。
水晶紫罗兰	生物基础	CB0331	准备1%溶液于水中。nbsp;
D-葡萄糖	生物基础	GB0219	准备20%高汤（1.1米）在水中，通过高压灭菌消毒。M9最小培养基中最终浓度为0.2%。
Filtropur S 0.2	萨尔斯特特	83.1826.001
硫酸甘他霉素	生物基础	GB0217	准备一壶30毫克/毫升的水汤。滤器用0.22 & mu进行灭菌;M滤波并以4 & deg存储;C & ndash;最终浓度为15号和微量板;g/mL......
接种环和针头;	费舍尔科学公司;	22363597
M9 最低盐，5X	费舍尔科学公司;	248510	准备一桶100万的水，用高压灭菌器灭菌。最终浓度为1 mM，M9最小介质。nbsp;
硫酸镁（MgSO4）和nbsp;	费舍尔科学公司;	M63-500	准备1百万毫克的MgSO4高汤。滤器用0.22 & mu进行灭菌;过滤后室温保存。最终浓度
PA14转座子插入突变体文库		Liberati 等，2006（参见参考文献29）	整个收藏共计59幅96孔板。每口井中含有一个含有25%甘油的突变体。
培养皿 92x16mm	萨尔斯特特	82.1473.001
PhenoBooth+	歌手乐器	https://www.singerinstruments.com/solution/phenobooth/specification/	将11.3克粉末溶解于200毫升纯水中。高压灭菌器，121度及高压;C15分钟，nbsp;
塑料注射器 10 mL	费舍尔科学公司;	14955459
旋翼+	歌手乐器	https://www.singerinstruments.com/resource/rotor-had/
短销Repads 384密度	歌手乐器	REP-004
短销RePads 96密度	歌手乐器	REP-002
氯化钠（NaCl）	费舍尔科学公司;	BP358-212
弹簧加载的96针复制器	EnzyScreen	CR1000
外科刀片不锈钢编号25	费舍尔科学公司;	08-918-5F
色氨酸	氧化物	LP0042B
Uniwell 板	歌手乐器	PlusPlates：PLU-003	板尺寸：54 及;34及以上;38厘米——无内墙，内部尺寸更大。
Uniwell 板	VWR	单孔组织培养板：75780-348	尺寸和PlusPlate一样。
酵母提取物及nbsp;	费舍尔科学公司;	248510