观察铜绿假单胞菌运动表型的高通量方法

Summary

该方案提供了一种快速有效的方法，用于鉴定参与铜绿假单胞菌中各种类型运动的遗传因子。

Abstract

运动行为通常在细菌利用其环境中可用资源的能力中起着重要作用。对于多功能病原体铜 绿假单胞菌尤其如此，它可以表现出多种类型的运动，包括蜂群和抽搐，这是导致表面定植、生物膜形成和逃避宿主防御的重要致病性状。本手稿提出了一种高通量运动方案来研究 铜绿假单胞菌的运动行为。例如，该协议允许同时测试来自全基因组突变文库的多种铜 绿假单 胞菌菌株，以识别和分析参与其运动的遗传因素。该方法为全面研究运动和深入了解 铜绿假单 胞菌运动的分子机制提供了可能性。此处描述的方案也可以进行修改以适应不同类型的运动测定以及其他细菌种类，从而为促进对各种情况下细菌行为的理解提供了一个强大的平台。

Introduction

铜绿假单胞菌是一种机会性病原体，由于其卓越的代谢多功能性，可以在各种环境中定植 ^1,2。这种多功能性对于从浮游生长模式过渡到生物膜至关重要，这有助于其在从水到人体的广泛生态位中茁壮成长的能力 ^3,4,5。这些生长模式之间的过渡得益于使用各种类型的运动在这些环境中移动的广泛能力，包括游泳、蜂群和抽搐 ^1,6。每种类型的运动都由不同的机制和细胞结构介导，并允许铜绿假单胞菌对环境线索做出反应 ^7,8。游泳运动由单个极性鞭毛驱动，用于通过液体介质向营养物质移动，例如⁹。蜂群运动是由鞭毛和生物表面活性剂的产生促进的协调运动，并允许菌落在半固体表面上传播^10,11。最后，抽搐运动与鞭毛无关。相反，抽搐是由 IV 型菌毛 （T4P） 介导的，并用于在表面^12,13 的顶部移动。抽搐运动还通过提供初始表面附着来促进铜绿假单胞菌生物膜形成的早期步骤。在最初的附着之后，抽搐使细菌能够在表面移动并产生微菌落，然后发展成成熟的生物膜 ^1,4,13。

传统上，细菌运动测定是在软琼脂平板上或使用显微镜方法单独进行，一次一个菌株 ^6,14,15。半固体培养基多年来一直用于细菌运动的研究。如今，这些技术仍用于鉴定细菌的运动表型。例如，传统上，通过在含有 0.5%-0.8% 琼脂浓度的 M9 培养基的培养皿中心接种 2.5 μL 铜绿假单胞菌培养物来观察蜂群运动¹⁶。抽搐运动通常是通过观察细菌在琼脂（1%）和培养皿底部之间的界面表面的传播来测量的，因为刺伤了铜绿假单胞菌。孵育 48 小时后获得一个大的间质菌落扩展光晕，而非抽搐菌株不产生这样的菌落扩展区 ^1,17,18。

最近，转座子诱变方法发现了参与铜绿假单胞菌运动或生物膜形成的新基因 19,20,21。例如，使用铜绿假单胞菌 ¹⁹ 中的高密度转座子突变文库发现了参与抽搐运动的新基因。功能基因组学中另一个有用的工具是使用有序突变体集合^22,23。庆应义塾集合²⁴ 包含大肠杆菌中所有非必需基因的单基因缺失，可能是最著名的突变体集合，已用于定义影响各种表型的基因，从不同培养基中的生长²⁵ 到细胞形态²⁶ 等。此类收集也可用于鼠伤寒沙门氏菌血清型²⁷、枯草芽孢杆菌²⁸、铜绿假单胞菌 ²⁹ 以及许多其他物种。这些集合也非常适合以全基因组方式研究运动性，从而开发出一种高通量方法来研究铜绿假单胞菌的运动性。在这里，通过评估铜绿假单胞菌突变体对高密度板上抽搐和蜂群运动的贡献，对该方法进行了测试。这种高通量方法可用于各种运动表型，也适用于研究其他细菌的运动。

Protocol

注意：此过程的一般工作流程如图 1 所示。

图 1：实验工作流程。 （1） 根据实验中感兴趣的运动类型准备必要数量的运动培养基。（2） 使用手动或自动复制器系统，以适当的密度为突变体集合的铜 绿假单 胞菌转座子插入突变文库准备源储备板，强调板所有孔的精确和均匀接种。（3） 将样品从突变体集合的源板转移到运动板。（4） 孵育后，观察和分析运动表型，并使用高质量图像鉴定参与目标运动的基因。（5） 进行传统的运动测定，以验证通过高通量运动实验鉴定的命中。使用 BioRender 创建。 请单击此处查看此图的较大版本。

蜂群板 - M9 媒体	抽搐板 - LB media	源板 - LB 培养基
200 mL 的 5x M9 盐溶液	10 克氯化钠	10 克氯化钠
10 mL 20% 葡萄糖	10 克胰蛋白胨	10 克胰蛋白胨
25 mL 酪蛋白氨基酸	5 克酵母提取物	5 克酵母提取物
1 毫升 1M 硫酸镁4	10 克琼脂	15 克琼脂
500 mL 1% 琼脂	将 dH2O 添加到 1L 中	将 dH2O 添加到 1L 中
将 dH2O 添加到 1L 中		庆大霉素（终浓度 15 μg/mL）

表 1：检测中使用的各种板的培养基组成。

1. 制备培养基板

注：参见 材料表 以制备储备溶液和储存条件。板应填充在水平面上。干燥时，板应在表面上平放（即不要堆叠）。这确保了板中的培养基均匀干燥。任何具有典型占地面积的单孔板都可以工作，但内部尺寸较大（无内壁）的板，例如 Singer Instruments Plus 板或 VWR 单孔未处理的组织培养板，有助于处理每个板的高密度菌落。

1. 根据 表 1 中的配方为实验准备适量的培养基。将培养基保持在 ~45 °C- 50 °C 以防止琼脂凝固。
   1. 对于源板，制备含有 1.5% 琼脂和 15 μg/mL 庆大霉素的 59 LB（溶原肉汤）板，这是复制完整 PA14 文库所需的 - 59 x 25 mL =~ 1500 mL。再准备 15 板 LB 1.5% 琼脂和 15 μg/mL 庆大霉素，以 384 密度格式放大文库 - 15 x 25 mL = ~400 mL。
   2. 抽搐板：如果以 96 密度格式工作，请准备 59 个抽搐板（LB 1% 琼脂）。如果以 15 密度格式工作，请准备 384 个抽搐板。
   3. 蜂群板：准备 15 个（384 密度规格）或 59 个（96 密度规格）蜂群板（M9-葡萄糖 0.5% 琼脂）
2. 取下板盖，每板倒入 25 mL 培养基。通过一次轻轻提起板的每个角，将培养基均匀地分布在板上。重复此摆动动作 2 到 3 次。将盖子放回盘子上。
3. 让板固化并在室温 （RT） 下干燥过夜。如果不立即使用板，请将它们放入密封袋中并存放在干燥的地方。它们可以存放 3 周。

2. 铜绿假单胞菌转座子突变文库源板的制备

注意：源板是指含有 PA14 文库副本的 LBA-庆大霉素板，稍后用于接种运动板。 铜绿假单 胞菌转座子突变文库（PA14 文库）是一组 59 个冷冻 96 孔板²⁹.下面将介绍为每种格式准备源板的步骤。该实验方案适用于无法使用 Rotor+ 复制器的实验室。研究人员可以使用手动复制器成功执行相同的实验程序，例如此处用于在第 1 天复制 PA14 文库的冷冻板的弹簧加载 96 针复制器（请参阅 材料表）或任何其他 96 针复制器。手动复制器需要消毒并在每次使用之间冷却。

1. 第 1 天：将 59 个冷冻 96 孔板的 PA14 文库复制到源板上
   1. 将弹簧加载的 96 针复制器放在最高温度下的热板上 8 分钟，对其进行消毒。灭菌后，让复制器充分冷却（~10 分钟）以避免杀死细菌。
   2. 抓取一个源板。使用无菌 96 针复制器，小心地将复制器针浸入一个 96 孔板中，然后将细胞直接转移到源板的表面。重复直到 PA14 文库的所有 59 个冷冻 96 孔板都复制到源板上。
   3. 将 96 密度源板在 37 °C 下孵育 16-18 小时。
      注：如果使用 96 密度格式的方法，则这些源板可用于接种运动板。
2. 第 2 天：从 96 密度格式升级到 384 密度格式
   注意：如果在 96 密度下工作，则可以跳过第 2 天。
   1. 孵育后，将板（平放在表面上，不要堆叠）在室温 （~1 h） 下冷却。如果盖子上有冷凝水，请使用精细的任务擦拭布去除冷凝水，以防止水滴落到板上，这可能会导致菌落之间的交叉污染。
   2. 使用以下参数配置复制器，以确保准确的菌落转移。 打开复制 器。在 Select an operate mode 部分中，选择 Select and Run Stored Programs。
   3. 在“选择源板”部分中，选择 PlusPlate 96 琼脂。在“选择靶标板”部分中，选择 PlusPlate 384 琼脂。在 Select pads 部分中，选择 Short Pin 96。
   4. 在 复制程序选项 部分中，选择 常规 并单击 回收 > 无。
   5. 在 Source （源） 部分中，选择 Offset （偏移）， 然后单击 Random > Default Radius （默认半径）。在 Target 部分中，选择 Pinning 并将压力调整为 20%。将所有其他设置保留为默认值。
   6. 将短针 RePads 96 插入相应的隔间。
   7. 将源板和目标板放置在复制器的指定平台上。将 96 密度源板（板 1、2、3 和 4）和新的空源板（LBA 板）放在平台上。使用所选参数，微生物阵列固定机器人会将菌落从 96 密度板转移到新的 384 密度板。按 Run。
   8. 更换平台上的所有板（接下来的四个 96 密度源板和一个新的空源板）并重复，直到所有板都放大。对于最后一组板，使用板 57、58、59 和 1。每个 384 密度板将由来自四个 96 密度板的交替菌落组成（参见 图 2）。将 384 密度 LBA 板在 37 °C 下孵育 16-18 小时。
      注意：然后可以使用这些 384 密度源板接种运动板以在 384 密度下执行方案。在孵育后的任何步骤中，板都可以在 4 °C 下储存长达 3 周。

图 2：从 96 密度板放大到 384 密度板。 将来自四个 96 密度源板的克隆转移并合并到单个 384 密度板中。384 密度板的每个象限对应于原始 96 孔板（红色、蓝色、黄色和绿色）之一，保留每个突变体的位置。使用 BioRender 创建。 请单击此处查看此图的较大版本。

3. 高通量运动实验

注意：该协议在此处以 384 密度格式执行，但相同的协议可以通过修改复制器上的参数以适应 96 密度格式，以使用 96 选择而不是 384 从源板转移到运动板。

1. 孵育后，将板（平放在表面上，不要堆叠）在室温 （~1 h） 下冷却。如果盖子上出现冷凝水，请使用精细的任务擦拭布将其清除，以防止水滴落到板上，这可能会导致菌落之间的交叉污染。
2. 为所需的检测选择适当数量的板（96 密度规格为 59 个，384 密度规格为 15 个）用于所需的检测：用于蜂群的 M9-葡萄糖 0.5% 琼脂板，LB 和用于抽搐的 1% 琼脂板。
3. 使用以下参数配置复制器，以确保准确的菌落转移。
   1. 打开复制器。在 Select an operate mode 部分中，选择 Select and Run Stored Programs。在“选择源板”部分中，选择 PlusPlate 384 琼脂。
   2. 在“选择靶标板”部分中，选择 PlusPlate 384 琼脂。在 Select pads 部分中，选择 Short Pin 384。在 复制程序选项 部分中，选择 常规 > 回收 > 无。
   3. 在 Singer 程序中，选择 复制多个。
   4. 在 Source 部分中，选择 Offset > Random > Default Radius。在 Target 部分中，选择 Pinning 并将压力调整为 2%。将所有其他设置保留为默认值。
4. 将短针 RePads 384 插入适当的隔间中。
5. 将源板和目标板放置在复制器的指定平台上。将 384 密度源板和空运动板放在平台上。按 使用所选参数运行，微生物阵列固定机器人会将菌落从 384 密度源板转移到运动板。每个 384 密度板将包含一个 384 密度源板的副本。
6. 确保转移均匀，并且所有菌落都适当地固定在运动板的琼脂表面上。将接种的运动板放入塑料袋中。小心地将装有板的袋子放入设置为 37 °C 的培养箱中 18 小时。
   注意：将板放在袋子中以保持湿度并防止干燥不均匀。将板放入培养箱中，盖子朝上。
7. 孵育后，检查运动板是否集落生长均匀且无污染。
8. 第 3 天：成像运动板
   注意：胜家乐器 PhenoBooth 用于捕获运动板的高分辨率图像。它使用科学级相机并生成 23MP 的图像。它包括 5 个照明通道，用于从培养皿和矩形板中捕获菌落的高分辨率图像。其他高质量的成像器也可以工作。
   1. 孵育期后，运动板已准备好进行成像过程。 打开 Phenobooth 并单击与 Phenobooth 软件对应的 图标 。
   2. 此时将打开 Select Project 页面;点击 New Project > Colony Counting。选择 Desired File Path 以将图像存储在 Location 字段中。在 Resolution （分辨率） 字段中，选择 5626 x 4220。点击 OK，设备现在可以拍照了。
   3. 取下盖子后，将板插入读数仪，培养基面朝上。在关闭酶标仪之前，请确保板的位置正确，以避免卡住板。
   4. 在 Lighting 选项卡中将参数设置为 white light。单击 Preview。在 PhenoBooth 设置选项卡中调整曝光设置，以获得观察运动表型的最佳参数。
   5. 点击 Acquire;捕获的图像将出现在屏幕左侧。完成后，关闭软件（所有捕获的图像将保存在 Location 选项卡中先前选择的文件中）。
      注意：Phenobooth 以 JPEG 格式保存图像，但对于下游分析步骤，图像可以是 TIFF、JPEG 或 PNG 格式。

4. 运动表型分析

注意：按照 French 等人 ^30,31 的详细描述进行图像分析。31（ImageJ Macro） 提供了执行数据分析的脚本。

1. 简而言之，图像在 ImageJ³² 中处理，它为运动板上的每个菌落生成一个值。首先，将图像转换为 8 位格式，并使用 threshold 命令从背景中分割菌落及其相关的运动区域。在每个菌落周围绘制感兴趣区域 （ROI） 并测量运动区域。这将生成一个表，其中包含每个孔的积分密度值，并按行组织。此表可以保存为 CSV 文件以供进一步分析。
   1. 在 ImageJ 中运行宏并打开包含图像的文件夹。
   2. 出现提示时，通过使用 Preview 选项修改板的角度来调整板的旋转，使板是直的。满意后，单击 OK 按钮。
   3. 接下来，在菌落周围移动矩形，并使用它来裁剪包含菌落的板部分。准备好后，单击 OK 按钮。
   4. 下一个提示将定义用于在每个菌落周围绘制 ROI 并测量运动区域的网格。选择合适的菌落密度。如果需要，调整各种参数，使每个圆圈都围绕一个菌落。准备就绪后，激活 Okay？框，然后单击 OK 按钮。这将测量每个菌落的运动区域，并将 CSV 文件保存到包含数据的文件夹中。
2. 将此 CSV 文件与板图例（也按行组织）相结合，以识别具有相应突变体的每个运动区域。较低的积分密度值对应于非运动或运动性降低的突变体。

5. 用于验证命中的传统运动分析

注：在高通量运动方案中观察具有影响运动的突变体后，单独验证获得的命中非常重要。单个运动方案与用于高通量测试的方案不同，但使用的介质相同。

1. 蜂群运动测定
   注意：按照 Ha 等人 ¹⁶ 的详细描述进行蜂群运动。
   1. 简而言之，用 M9（0.5% 琼脂）、葡萄糖、酪蛋白氨基酸和 MgSO₄ 高压灭菌琼脂溶液。将冷却的混合琼脂倒入培养皿中（每板 25 mL）。
   2. 接种 2.5 μL 过夜细菌培养物。在 37 °C 下孵育 18 小时，盖子朝上以观察运动表型。
2. 抽搐运动试验
   注意：抽搐运动按照 Haley 等人 ^33,34 的详细描述进行。
   1. 简而言之，高压灭菌 LB 1% 琼脂（见 表 1）。将冷却的混合 LB 1% 琼脂倒入培养皿中（每板 25 mL）。
   2. 将细菌接种到抽搐板的底部（1% 琼脂）。将板在 37 °C 下孵育 48 小时，然后在室温下再孵育 48 小时。从板中取出琼脂，并通过用 1% 结晶紫对培养皿染色来观察抽搐区。
   3. 使用 PhenoBooth 以步骤 3 中描述的相同参数拍摄培养皿。

Results

我们使用此方案来表征基因失活对高通量铜 绿假单 胞菌运动的影响。在这里，我们详细介绍了它用于研究 P 全基因组缺失集合中的蜂群和抽搐运动。 铜绿假单 胞菌菌株 PA14 （PA14 文库）。该方案具有很强的多功能性和易用性，允许修改方案的不同步骤，例如使用不同的培养基或突变体集合。

突变体根据它们的运动区域进行评分。平板上的大多数突变体不会影响 铜绿假单 胞菌的运动，因此平板上所有突变体的运动平均值被认为是 WT。运动区域与平均值显着不同的突变体被认为具有运动缺陷。对测试的突变体进行排名，并选择最低 15% 的突变体为严格突变体。然后，使用传统测定法确认其中一些突变体。在该分析中未鉴定出表现出大于平均值的运动表型的突变体。这种方法对于识别运动表型降低的突变体特别有效，因为它们的可视化更清晰。

首先使用高通量运动方案检查来自 PA14 文库的突变体的抽搐运动（

Discussion

此处描述的高通量运动方案使我们能够精确且可重复地处理和分析许多菌落的运动表型。与传统的手动方法相比，这种半自动方法提高了运动检测的可扩展性和通量，从而可以对细菌运动进行全基因组评估。该方案已针对与 PA14 文库一起使用进行了优化，但该测定可用于任何有序的突变体文库，例如 大肠杆菌²⁴ 的 Keio 集合或鼠伤寒沙 门氏菌 血清型²⁷ 的 SGD 集合。此外，该协议还可以优化为使用菌株库而不是突变体库。例如，该方案将有助于确定从囊性纤维化患者中分离的 铜绿假单 胞菌菌株文库的运动表型。可能需要对方法进行修改和故障排除，以针对特定菌株或实验条件优化方案。例如，在运动测定中调整琼脂的浓度使我们能够评估 铜绿假单 胞菌不同类型的运动（蜂群和抽搐）（图 3、 图 4），但其他类...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
96个井板及nbsp;	康宁	3701
Agar	费舍尔科学公司;	BP1423-2	最终分群运动浓度为0.5%，抽搐运动为1%。
氨基酸	费舍尔科学公司;	223050	准备20%的水汤。滤器用0.22 & mu进行灭菌;m过滤并储存在4 & C。最终浓度为0.5%，M9 最低介质。
水晶紫罗兰	生物基础	CB0331	准备1%溶液于水中。nbsp;
D-葡萄糖	生物基础	GB0219	准备20%高汤（1.1米）在水中，通过高压灭菌消毒。M9最小培养基中最终浓度为0.2%。
Filtropur S 0.2	萨尔斯特特	83.1826.001
硫酸甘他霉素	生物基础	GB0217	准备一壶30毫克/毫升的水汤。滤器用0.22 & mu进行灭菌;M滤波并以4 & deg存储;C & ndash;最终浓度为15号和微量板;g/mL......
接种环和针头;	费舍尔科学公司;	22363597
M9 最低盐，5X	费舍尔科学公司;	248510	准备一桶100万的水，用高压灭菌器灭菌。最终浓度为1 mM，M9最小介质。nbsp;
硫酸镁（MgSO4）和nbsp;	费舍尔科学公司;	M63-500	准备1百万毫克的MgSO4高汤。滤器用0.22 & mu进行灭菌;过滤后室温保存。最终浓度
PA14转座子插入突变体文库		Liberati 等，2006（参见参考文献29）	整个收藏共计59幅96孔板。每口井中含有一个含有25%甘油的突变体。
培养皿 92x16mm	萨尔斯特特	82.1473.001
PhenoBooth+	歌手乐器	https://www.singerinstruments.com/solution/phenobooth/specification/	将11.3克粉末溶解于200毫升纯水中。高压灭菌器，121度及高压;C15分钟，nbsp;
塑料注射器 10 mL	费舍尔科学公司;	14955459
旋翼+	歌手乐器	https://www.singerinstruments.com/resource/rotor-had/
短销Repads 384密度	歌手乐器	REP-004
短销RePads 96密度	歌手乐器	REP-002
氯化钠（NaCl）	费舍尔科学公司;	BP358-212
弹簧加载的96针复制器	EnzyScreen	CR1000
外科刀片不锈钢编号25	费舍尔科学公司;	08-918-5F
色氨酸	氧化物	LP0042B
Uniwell 板	歌手乐器	PlusPlates：PLU-003	板尺寸：54 及;34及以上;38厘米——无内墙，内部尺寸更大。
Uniwell 板	VWR	单孔组织培养板：75780-348	尺寸和PlusPlate一样。
酵母提取物及nbsp;	费舍尔科学公司;	248510