使用核心鞘 3D 生物打印支架优化细胞外囊泡递送用于慢性伤口管理

Summary

本研究提出了一种制造用于慢性伤口愈合的核心护套 3D 生物打印支架的方案。从间充质干细胞中分离出细胞外囊泡，并用由羧甲基纤维素和海藻酸盐裂解酶制成的鞘装入核心（海藻酸盐）。这种设计允许受控的支架降解和高效的 EV 释放。

Abstract

本研究概述了制造芯鞘 3D 生物打印支架的详细方案，旨在增强慢性伤口愈合。该方案涉及从间充质干细胞 （MSC） 中分离细胞外囊泡 （EV），MSC 以其再生和免疫调节特性而闻名。然后将这些 EV 整合到独特的支架结构中。该支架具有一个由载有 EV 的海藻酸盐组成的核心，周围环绕着由羧甲基纤维素和海藻酸盐裂解酶制成的护套。这种创新设计确保了受控的支架降解，同时促进了 EV 在伤口部位的高效和受控释放。该协议涵盖了关键步骤，包括 EV 的制备和表征、用于 3D 生物打印的生物墨水的配方以及打印参数的优化以实现所需的核心鞘结构。通过结合结构完整性和生物活性，该支架旨在解决传统伤口敷料的局限性，提供一种有针对性的方法来加速组织再生并减少慢性伤口的炎症。该方法为开发具有潜在临床应用在慢性伤口管理中的先进生物材料提供了一种可重复和可扩展的策略。该方案还强调了获得一致结果的关键考虑因素，确保对未来治疗应用的适应性。

Introduction

慢性伤口通常与过度炎症有关，需要及时处理以防止感染和组织坏死等严重并发症，这可能导致截肢。尽管取得了进步，但目前的治疗方法仍然昂贵、不方便、有副作用且疗效有限，这凸显了对更多治愈性敷料的需求 ^1,2,3。开发专为慢性伤口设计的新一代伤口敷料对于应对这些挑战至关重要。此外，伤口愈合的复杂性要求敷料材料具有一系列特性，包括保湿性、柔韧性、粘附性、生物活性和生物降解性⁴。本研究旨在开发一种生物工程伤口敷料，将细胞外囊泡 （EV） 与核心鞘 3D 生物打印支架相结合，以提供受控的治疗环境并加速慢性伤口愈合。

源自干细胞的 EV 通过促进抗炎反应、细胞生长、迁移和血管形成来帮助慢性伤口愈合⁵。此外，EV 可以递送生物活性分子，包括用于慢性伤口管理的生物活性分子、基因和蛋白质构建^{体 6}。此外，它们保护货物免受酶降解的能力提高了治疗剂的稳定性和生物利用度，与传统生长因子和小分子药物相比具有明显的优势，后者通常在体内迅速降解⁷。尽管有这些优势，但将 EV 高效、持续地递送到靶组织仍然是一个重大挑战。

3D 生物打印支架可以作为 EV 的递送平台，以提高其治疗效果⁸。这些支架模拟自然细胞环境，并允许 EV 的受控释放 ^9,10。它们还可以保护 EV 免于降解，增强其 microRNA 和蛋白质的稳定性¹¹。Han 等人证明，EV 可以从 3D 生物打印的 GelMA 支架中有效释放。这种释放导致细胞粘附得到改善，并增强了与接种到支架上的人口腔脂肪垫间充质干细胞 （hBFP-MSCs） 中的机械转导途径相关的基因表达¹²。Born 等人通过优化交联剂的浓度，实现了 EV 的受控释放。这种方法已被证明在促进血管生成方面有效，并为 EV 的调节递送提供了一种有前途的方法¹³。

芯鞘 3D 生物打印通过打印包裹在鞘中的芯材，可以创建复杂的多材料结构。核心可以包括细胞、生长因子或药物，而护套提供机械支撑和保护或充当屏障。该方法在组织工程和再生医学中具有应用，例如开发血管网络、模拟自然组织结构和创建药物递送系统。它允许精确控制材料分布和组成，增强结构的功能和生物学相关性。与其他技术相比，芯鞘 3D 生物打印提供了对材料分布和组成的精确控制，从而提高了结构的功能和生物学相关性^14,15。

伤口敷料中的工程降解具有减少变化期间的不适感、用于愈合和感染控制的潮湿环境、及时的治疗输送以及最佳的组织再生等好处 16,17,18。海藻酸盐 （Alg） 和羧甲基纤维素 （CMCh） 水凝胶具有生物相容性，可有效将细胞外囊泡 （EV） 输送到伤口，通过细胞通讯和减少炎症来促进愈合¹⁸。在这项研究中，EV 被整合到 Alg 的核心中，而 CMCh 和 AlgLyase （AlgLyase） 的鞘被用于实现快速敷料降解和 EV 递送。这种核心鞘设计有助于响应支架降解而快速释放 EV，增强其治疗效果并解决现有慢性伤口治疗的局限性。本研究的主要目的是开发一种生物工程敷料，通过将受控的 EV 释放与响应性可降解的支架相结合来促进伤口愈合，最终改善慢性伤口的治疗结果。

Protocol

动物研究完全按照国家生物伦理委员会和尼兹瓦大学动物伦理委员会制定的道德标准进行。本研究的伦理批准是在许可 ID：VCGSR， AREC/01/2023 下授予的。所有动物都被饲养在标准的实验室条件下，确保最佳的环境控制、适当的营养和全面的照顾，以在整个研究过程中保护它们的福利。所有涉及动物的程序都严格遵守机构政策、国际动物护理标准和 ARRIVE 指南。

1. 细胞培养

1. 从液氮储存中取出一小瓶 MSC（传代 #2），并使用无菌技术处理以防止污染。在 37 °C 水浴中快速解冻细胞，确保在有小冰碎片残留时立即将其取出。
2. 制备完全培养基，包括 MSC SFM 基础培养基，补充有 1% （v/v） MSC SFM XenoFree 补充剂、1% （v/v） GlutaMAX 和 0.01% （v/v） 庆大霉素。以每 5 秒 3 至 5 滴的速率向样品瓶中加入 1 mL 预热 （37 °C） 完全培养基，然后轻轻混合。在无菌条件下，将 MSC 样品瓶的全部内容物转移到 II 级生物安全柜中，放入装有 4 mL 预热完全培养基的 15 mL 锥形管中。
3. 在室温下以 200 x g 离心细胞 5 分钟。确保离心机平衡正确。
4. 吸出上清液，并将细胞重悬于 1 mL 预热的完全培养基中。然后，将细胞转移到含有 4 mL 完全培养基的 T25 培养瓶中。
5. 轻轻倾斜培养瓶以确保细胞均匀分布。将培养瓶在 37 °C 和 5% CO₂ 下孵育。
6. 每 2 天更换一次培养基，换上新鲜的、预热的完全培养基。使用轻柔的移液以避免细胞破裂。达到 70%-80% 汇合度后，从 T25 培养瓶中吸出用过的培养基。
7. 用 3 mL 新鲜 PBS 洗涤细胞以去除残留物。确保在洗涤过程中完全覆盖培养瓶。
8. 向 T25 培养瓶中加入 1 mL 0.25% 胰蛋白酶溶液，在 37 °C 下孵育 3-7 分钟，并在显微镜下以 4 倍放大倍率仔细监测分离。
9. 如果需要，轻轻敲击培养瓶以确保细胞完全分离。将预热的完全培养基加入培养瓶中，并在表面上下移液以帮助分离细胞。然后，将细胞悬液转移到 15 mL 离心管中。
10. 在室温下以 200 x g 离心管 5 分钟。将细胞沉淀悬浮在新鲜的完全培养基中，并使用 Neubauer 血细胞计数器对细胞进行计数。将细胞转移到 T75 培养瓶中。确保接种密度为 5,000 个细胞/cm² 以实现最佳生长。
11. 将细胞在 37 °C 和 5% CO₂ 下孵育。细胞孵育 72 小时后，从细胞中收集条件培养基用于 EV 分离。采集后立即使用。

2. 电动汽车隔离

1. 将收集的 13 mL 条件培养基以 800 x g 离心 15 分钟以去除细胞碎片。使用 0.22 μm 注射器过滤器轻轻过滤上清液以去除大颗粒。
2. 向过滤后的调节培养基中加入 5 mL 沉淀缓冲液，并充分涡旋混合。确保溶液是均匀的。
3. 将混合物在 4 °C 下孵育过夜，以使 EV 沉淀。将混合物在 20 °C 下以 3,220 x g 离心 30 分钟。 检查管子的平衡。
4. 小心丢弃上清液，不要干扰沉淀。将沉淀再次以 3,220 x g 离心 5 秒以去除残留液体。
5. 在 200 μL PBS 中轻轻移液 EV 沉淀，以避免损坏 EV。按照制造商的说明（BCA 蛋白质测定试剂盒）测量 EVs 蛋白浓度。
6. 进行蛋白质印迹以检测 EV 特异性标志物（CD63、CD81 和 CD9），以验证 EV 表型¹⁸。分析证实了这些标记的存在，验证了 EV 的身份¹⁹。
7. 为了最大限度地降低 RNase 污染的风险，建议直接使用，无需额外储存。如果需要，请将 EV 储存在 -80 °C 以备进一步使用。将 EV 悬浮液分装成 40 μL 体积，以避免重复冻融循环。

3. 使用 PKH-26 标记 EV

1. 缓冲液制备
   1. 将 0.238 g HEPES 溶于无菌容器中约 90 mL 的无菌超纯水中。使用新鲜制备的 HEPES 溶液。向 HEPES 溶液中加入 0.85 g NaCl。
   2. 根据需要，使用校准的 pH 计，使用 1 M NaOH 或 HCl 将 pH 调节至 7.4。加入去离子水，使总体积达到 100 mL。通过 0.22 μm 过滤器过滤溶液以对其进行消毒。
2. 在 1 mL 制备的缓冲液中稀释 4 μL PKH-26 染料。用移液管充分混合以确保均匀性。
3. 将纯化的 EV 重悬于 1 mL 浓度为 700 μg/mL 的 PBS 中。将 1 mL EVS 悬浮液添加到 1 mL 制备的 PKH-26 溶液中。对于仅染料对照组，将 1 mL 不含 EV 的完全培养基添加到 1 mL PKH-26 溶液中。对对照组执行所有后续步骤，以考虑潜在的非特异性聚集或胶束形成。
4. 通过轻轻将试管倒置 10 倍至 15 倍，将 EV 彻底混合。在室温下将混合物孵育 3-5 分钟，确保 EV 均匀暴露于染料中。
5. 使用无菌超纯水制备 2 mL 新鲜的 1% BSA 溶液，并将其添加到 2 mL 所得混合物中以淬灭标记反应。轻轻混合以防止聚集。
6. 根据上述方案（步骤 2.2-2.7）浓缩 PKH-26 标记的 EV。将标记的 EV 重悬于 300 μL PBS 中。将 PKH-26 标记的 EV 样品移液到 30 kDa 过滤管中。
7. 将样品在 4 °C 下以 3,220 x g 离心 30 分钟。 在此步骤中，游离的 PKH-26 染料和小分子将穿过膜进入滤液，而 PKH-26 标记的 EV 将保留在截留物中。
8. 初次离心后，弃去滤液，向截留物中加入 300 μL PBS。通过上下移液轻轻地将 EV 重悬于 PBS 中。
9. 在 4 °C 下以 3,220 x g 再次离心样品 30 分钟，以洗去任何残留的游离染料或小分子。
10. 通过荧光显微镜确认滤液溶液中缺乏 PKH-26。如果检测到任何染料，请重复洗涤步骤。
11. 用微量移液器收集顶部溶液，并从收集管中取出过滤器。小心地反转过滤器（将其倒置）。
12. 将倒置过滤器在 4 °C 下以 800 x g 离心 5 分钟。 这将有助于将保留的 PKH-26-EV 从滤膜收集到新的收集管中。直接使用 PKH-26-EV 进行下一步。

4. 3D 生物打印

1. 生物墨水制备
   1. 使用无菌超纯水制备新鲜的 4.5% （w/v） Alg 钠溶液。在 60 °C 下搅拌过夜，使溶液完全溶解。
   2. 将 CMCh 溶解在无菌超纯水中，以获得 3.8% （w/v） 的溶液。新鲜准备。在 60 °C 下搅拌过夜以完全溶解。
   3. 将制备好的生物墨水在 25°C 下以 3,220 x g 离心 10 分钟，以去除任何可能干扰打印过程的气泡。
   4. 使用注射器混合器将制备的 3 mL Alg 溶液与标记的 EV 或仅染料对照混合，以达到 0.01% （w/v） 的 EV 浓度。通过温和混合确保均匀分布。
   5. 使用注射器混合器，将 1 mL CMCh 与新鲜制备的 AlgLyase 溶液在无菌超纯水中混合，以达到 0.5 mU/mL 的最终浓度。
2. 如图 1A 所示，同时将 Alg/Exo 生物墨水加载到核心部分，将 CMCh/AlgLyase 生物墨水加载到核心/鞘管注射器设置的护套部分。
3. 打印前让生物墨水静置 15 分钟。
4. 3D 生物打印机设置
   1. 使用 3D-bioprinter 软件，通过选择 具有对角填充图案的圆柱形来创建脚手架结构。为此，请将圆柱体直径和高度分别设置为 20 mm 和 1.1 mm。将孔径配置为 1 mm。
   2. 将核心和护套喷嘴抽速设置为 1 mm/s，每层厚度为 0.25 mm，并将移动速度设置为 6 mm/s。在室温下打印四层，每层厚度为 0.25 毫米。
5. 开始在聚酯薄膜上打印。
6. 在挤出过程中，使用含气雾剂氯化钙 （2.2%） 的加湿器交联支架。将加湿器喷嘴放置在距离挤出头约 20 cm 的位置，以确保在不影响支架结构的情况下有效交联。为了进一步交联，将支架浸入氯化钙溶液 （2.2%） 中 10 分钟。
7. 用无菌超纯水冲洗支架 3 次，以去除任何多余的氯化钙和未结合的生物墨水。
8. 确保将支架存放在 4 °C 的无菌环境中，以保持支架的完整性和功能长达三个月。

5. 跟踪电动汽车的发布

1. 创建圆形皮肤伤口模型
   1. 通过腹膜内注射氯胺酮（70 mg / kg）和甲苯噻嗪（10 mg / kg）麻醉雄性秋田杂合糖尿病小鼠（8周）。通过评估无反射反应（例如，脚趾捏合）来确认适当的麻醉并监测呼吸频率。为防止麻醉期间角膜干燥，请在眼睛上涂抹无菌兽用眼药膏。
   2. 首先使用电动剪刀剃须背侧皮肤区域。避免皮肤刺激或受伤。使用聚维酮碘溶液对剃光区域进行消毒。
   3. 使用无菌 seizer，在每只小鼠的背面创建一个 6 mm 的圆形全层皮肤伤口。
   4. 将含有 PKH 标记的 EV 的 3D 生物打印支架直接轻轻地放在伤口床上。使用无菌镊子轻轻按压，确保支架完全覆盖伤口表面，气穴最小。确保在手术后密切观察动物并保持照料状态，直到它完全恢复意识并可以保持胸骨卧位。
2. 荧光成像
   1. 在植入后 2 小时、4 小时、8 小时、24 小时，使用异氟醚麻醉小鼠。为了诱导麻醉，将小鼠置于 体内 成像系统 （IVIS） 的腔室中，并将它们暴露于 2%-3% 异氟醚的氧气中。在小鼠的眼睛上涂抹眼药膏以防止干燥。麻醉后，将小鼠转移到 IVIS 系统，并用通过鼻通道输送的 1%-2% 异氟醚氧气维持它们。在进行成像之前，请确认动物已完全麻醉且稳定。
   2. 使用 IVIS 系统捕获来自支架释放的 PKH 标记 EV 的荧光信号。在成像向导中，选择 Fluorescence Imaging（荧光成像 ）选项并激活 PKH 染料的激发和发射滤光片。调整相机设置，包括视野和被摄体高度，以优化信号检测。确保所有成像时间点的定位一致，以实现准确的比较。开始采集图像并保存结果数据。
   3. 使用 IVIS 软件量化荧光信号强度。这将允许跟踪 EV 随时间的释放。

Results

Alg-EVs/CMCh 和 Alg-EVs/CMCh-AlgLyase 支架的 EV 在体内释放如图 1B、C 所示。正如预期的那样，与 Alg-EVs/CMCh 相比，Alg-EVs/CMCh-AlgLyase 支架表现出更快的释放曲线，尤其是在 2 h 和 4 h 时间点。EV 从水凝胶中释放受物理化学机制的组合控制，包括扩散、溶胀、侵蚀和降解²⁰。通过利用 Alglyase ，支架促进 Alg 的分解，加速 EV 的释放，从而在伤口愈合的早期阶段有效控制慢性炎症。EV 的早期释放对于减轻过度炎症至关重要，过度炎症会延迟愈合 21,22,23。为了解释潜在的非特异性聚集或胶束形成，还分析了对照组，揭示了可忽略不计的荧光信号。这一观察结果证实，检测到的信号主要来自标记的 EV。

Discussion

该协议的一个关键方面是核心护套支架设计，这对于实现高效的电动汽车交付至关重要。该设计以 Alg 为核心材料，将 CMCh 与 Alglyase 相结合作为鞘。这种设置有助于 EV 的受控和快速释放。核心材料 Alg 封装了 EV，确保其保护和本地化交付。该鞘由 CMCh 和 Alglyase 组成，能够加速 Alg 核心的降解，这对于及时释放 EV 至关重要。在我们之前的出版物¹⁸ 中，我们评估了来自类似支架系统的 EV 的 体外 释放动力学，并证明了长时间的控释曲线，突出了这种方法获得持续治疗效果的潜力。这种受控的降解和释放是通过精确的配方和封装技术实现的。这些数据将使 EV 释放动力学与伤口愈合进展相关联，从而更深入地了解支架的临床潜力。

较慢的释放系统在治疗应用中具有优势，在这些应用中，持续、较低浓度的药物或生长因子可以提高疗效，同时降低副作用的风险。例如，逐渐释放可以确保在较长时间内持续刺激细胞过程²⁶

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
23 G 紫色精密锥形喷嘴	Cellink	KT0000002000	为了提供生物墨水的精确挤出，
堵塞的海藻酸盐裂解酶 （AlgLyase）	Sigma Aldrich	A1603-100MG	Algyase 是一种降解海藻酸盐的酶。
Amicon 超离心过滤器，30 kDa MWCO	Merck	UFC9030	用于洗涤 PKH-26 标记的 EV
BCA 测定试剂盒	Thermo Scientific	10678484	测定蛋白质/EV 浓度
生物打印系统	Regemat	V1	制造核心鞘支架
牛血清白蛋白 （BSA）	sigma-aldrich	05470-5G	停止 PKH 26 反应
氯化钙	Sigma Aldrich	C3306-100G	用于组织工程中的生物墨水交联和稳定
心机	Sigma	2-16P	用于 EV 分离
心机 5810 R	Eppendorf	22625101	用于细胞培养
II 类生物安全柜	Telstar	Bio II Advance	细胞培养
CryoCube F570 系列 - 超低温冰箱	Eppendorf	F571240035	用于存放电动汽车荧
光显微镜	OLYMPUS	IX73P1F	检查滤液中残留的PKH-26
庆大霉素 （50 mg/mL）	Thermofisher	15750	用于细胞培养基的抗生素
GlutaMAX-I CTS，（100X），液体	Thermofisher	A12860	细胞培养基补充剂
HCl	Sigma Aldrich	7647-01-0	缓冲液制备
HEPES	卡尔·罗斯	艺术。编号 6763.3	缓冲液制备
高粘度羧甲基纤维素 （CMCh）	BDH	27929 4T	CMCh 是一种水溶性纤维素衍生物。
新不伦瑞克省	孵化器	NB-170R	细胞培养
Invivo 成像	PerkinElmer	IVIS Lumina XRMS 系列 III	电动汽车的发布，在体内
磁力搅拌器	SalvisLAB	MC35	用于生物墨水制备
miRCURY 外泌体试剂盒用于外泌体分离	Qiagen	76743	Evs 分离
NaOh	Daejung	1310-73-2	缓冲液制备
磷酸盐缓冲盐水（PBS）	Thermo Scientific	J61196。AP	细胞培养
PKH 26	MCE	154214-55-8	用于标记EV的红色荧光染料
藻酸钠（Alg）	Sigma Aldrich	A0682-100G	自褐藻的天然多糖。
氯化钠（NaCl）	Carl Roth	Art-Nr-P029.1	缓冲液制备
StemPro BM 间充质干细胞	Thermofisher	A1382901	充质干细胞
StemPro MSC SFM XenoFree	Thermofisher	A1067501	细胞培养基
胰蛋白酶 0.25%	Thermofisher	25050014	细胞解离
混合器	Daihan Scientific	VM-10	用于将沉淀缓冲液与条件培养基混合