本研究提出了一种用于慢性伤口愈合的核-壳结构3D生物打印支架的制备方案。从间充质干细胞中分离提取细胞外囊泡，并将其载入由海藻酸盐构成的芯层，壳层则由羧甲基纤维素和海藻酸盐裂解酶组成。该设计可实现支架的可控降解及细胞外囊泡的高效释放。
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摘要
摘要
本研究概述了一种用于制备核-壳结构3D生物打印支架的详细方案，旨在促进慢性伤口愈合。该方案包括从间充质干细胞（MSCs）中分离细胞外囊泡（EVs），这类囊泡因其具有再生和免疫调节特性而备受关注。随后将这些EVs整合到一种独特的支架结构中。该支架由负载EVs的海藻酸盐核心构成，外层包裹由羧甲基纤维素和海藻酸盐裂解酶组成的壳层。这种创新设计可在促进EVs在伤口部位高效且可控释放的同时，实现支架的可控降解。本方案涵盖了多个关键步骤，包括EVs的制备与表征、适用于3D生物打印的生物墨水配制，以及打印参数的优化，以获得理想的核-壳结构。通过结合结构稳定性与生物活性，该支架旨在克服传统伤口敷料的局限性，为加速慢性伤口的组织再生和减轻炎症提供靶向性策略。该方法为开发具有潜在临床应用价值的先进生物材料提供了一种可重复且可放大的策略。此外，本方案还强调了获得稳定实验结果的关键注意事项，确保其在未来治疗应用中的可适应性。
引言
慢性伤口常与过度炎症相关，需要及时处理以防止感染和组织坏死等严重并发症，这些并发症可能导致截肢。尽管已有进展，目前的治疗方法仍存在成本高、使用不便、副作用多以及疗效有限等问题，凸显出对更具治愈效果的敷料的迫切需求1,2,3。开发专为慢性伤口设计的新一代伤口敷料对于应对这些挑战至关重要。此外，伤口愈合过程的复杂性要求敷料材料具备多种特性，包括保湿性、柔韧性、黏附性、生物活性和可生物降解性4。本研究旨在开发一种生物工程伤口敷料，将细胞外囊泡（EVs）与核-壳结构的三维生物打印支架相结合，以提供可控的治疗环境并加速慢性伤口的愈合。
干细胞来源的细胞外囊泡通过促进抗炎反应、细胞增殖、迁移和血管生成，有助于慢性伤口的愈合5此外，细胞外囊泡（EVs）可递送包括小分子药物、基因和蛋白质载体在内的生物活性分子，用于慢性伤口的管理。6此外，它们能够保护载荷物质免受酶降解，从而提高治疗剂的稳定性和生物利用度，相较于常迅速降解的传统生长因子和小分子药物具有显著优势 体内7尽管具有这些优势，细胞外囊泡向靶组织....
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方案
动物实验完全遵循阿曼纳兹瓦大学生物伦理国家委员会和动物伦理委员会制定的伦理标准进行。本研究已获得伦理批准，批准编号为：VCGSR, AREC/01/2023。所有动物均饲养在标准实验室条件下，确保环境控制适宜、营养合理，并提供全面的护理，以保障其在整个研究期间的福利。所有涉及动物的操作均严格遵守机构政策、国际动物护理标准以及ARRIVE指南。
1. 细胞培养
- 从液氮储存中取出一管间充质干细胞（MSCs，第2代），并采用无菌技术操作以防止污染。在37 °C水浴中快速解冻细胞，当仅剩少量冰晶时立即取出。
- 准备完全培养基：以MSC SFM基础培养基为基础，添加1%（v/v）MSC SFM XenoFree补充剂、1%（v/v）GlutaMAX和0.01%（v/v）庆大霉素。向冻存管中逐滴加入1 mL预热至37 °C的完全培养基，每5秒加入3至5滴，随后轻轻混匀。在II级生物安全柜内的无菌条件下，将冻存管中的全部内容物转移至含有4 mL预热完全培养基的15 mL锥形离心管中。
- 在室温下以200 × g离心5分钟。确保离心机配平正确。
- 吸除上清液，并将细胞沉淀重悬于1 mL预热的完全培养基中。随后将细胞转移至含有4 mL完全培养基的T25培养瓶中。
- 轻轻倾斜培养瓶，确保细胞均匀分布。将培养瓶置于37 °C、5% CO2
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结果
的 体内 Alg-EVs/CMCh 和 Alg-EVs/CMCh-AlgLyase 支架中EVs的释放情况如图所示 图1B，C正如预期，Alg-EVs/CMCh-AlgLyase支架在2小时和4小时时间点表现出比Alg-EVs/CMCh更快的释放速率。水凝胶中EVs的释放受多种理化机制共同调控，包括扩散、溶胀、侵蚀和降解。20通过利用Alglyase，该支架可促进Alg的降解，从而加速EVs的释放，有效调控伤口愈合早期阶段的慢性炎症。EVs的早期释放对于减轻过度炎症反应至关重要，而过度炎症可能延缓愈合进程。21,22,23为排除非特异性聚集或胶束形成的潜在影响，同时分析了对照组，结果显示荧光信号可忽略不计。该结果证实所检测到的信号主要来源于标记的细胞外囊泡。
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讨论
该方案的一个关键方面是核-壳支架的设计，这对于实现细胞外囊泡（EVs）的高效递送至关重要。该设计采用海藻酸盐（Alg）作为核心材料，以羧甲基壳聚糖（CMCh）与Alglyase的组合物作为外壳。这种结构可实现EVs的可控且快速释放。核心材料Alg包裹EVs，确保其稳定性及局部递送；外壳由CMCh和Alglyase组成，能够加速Alg核心的降解，这对于EVs的及时释放至关重要。在我们先前的发表文献中18，我们评估了 体外 从类似支架系统中释放细胞外囊泡（EVs）的动力学研究表明，该系统可在较长时间内实现可控释放，凸显了该方法在实现持续治疗效果方面的潜力。这种可控的降解与释放通过精确的配方设计和包封技术实现。这些数据将有助于关联EVs释放动力学与伤口愈合进程，从而更深入地揭示该支架的临床应用潜力。
在治疗应用中，缓慢释放系统具有优势，因为持续且较低浓度的药物或生长因子可能在降低副作用风险的同时提高疗效。例如，缓慢释放可确保在较长时间内持续刺激细胞过程26，避免可能引起毒性的.......
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披露
作者声明不存在利益冲突。
致谢
特别感谢来自 Happy Production 的 Said Al-Hashmi 和 Abdulrahman Almharbi 在拍摄工作中付出的卓越努力。我们还要感谢阿曼高等教育、研究与创新部以及尼兹瓦大学提供的资金支持和所需资源。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 23 G 紫色精密锥形喷嘴 | Cellink | KT0000002000 | 用于实现生物墨水的精确挤出，且不易堵塞 |
| 海藻酸盐裂解酶（AlgLyase） | Sigma Aldrich | A1603-100MG | AlgLyase 是一种可降解海藻酸盐的酶 |
| Amicon Ultra 离心过滤器，30 kDa 截留分子量 | Merck | UFC9030 | 用于洗涤 PKH-26 标记的细胞外囊泡（EVs） |
| BCA 蛋白检测试剂盒 | Thermo Scientific | 10678484 | 用于测定蛋白/细胞外囊泡（EVs）浓度 |
| 生物打印系统 | Regemat | V1 | 用于制备核-壳结构支架 |
| 牛血清白蛋白（BSA） | sigma-aldrich | 05470-5G | 用于终止 PKH 26 反应 |
| 氯化钙 | Sigma Aldrich | C3306-100G | 用于组织工程中生物墨水的交联与稳定 |
| 离心机 | Sigma | 2-16P | 用于细胞外囊泡（EVs）的分离 |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 22625101 | 用于细胞培养 |
| II 级生物安全柜 | Telstar | Bio II Advance | 用于细胞培养 |
| CryoCube F570 系列 - 超低温冰箱 | Eppendorf | F571240035 | 用于储存细胞外囊泡（EVs） |
| 荧光显微镜 | OLYMPUS | IX73P1F | 用于检测滤液中残留的 PKH-26 荧光信号 |
| 庆大霉素（50 mg/mL） | Thermofisher | 15750 | 细胞培养基中的抗生素 |
| GlutaMAX-I CTS（100X），液体 | Thermofisher | A12860 | 细胞培养基添加剂 |
| HCl | Sigma Aldrich | 7647-01-0 | 用于缓冲液配制 |
| HEPES | Carl Roth | Art. No. 6763.3 | 用于缓冲液配制 |
| 高黏度羧甲基纤维素（CMCh） | BDH | 27929 4T | CMCh 是一种水溶性纤维素衍生物 |
| 培养箱 | New Brunswick | NB-170R | 用于细胞培养 |
| 活体成像系统 | PerkinElmer | IVIS Lumina XRMS Series III | 用于在活体中追踪细胞外囊泡（EVs）的释放 |
| 磁力搅拌器 | SalvisLAB | MC35 | 用于生物墨水的制备 |
| miRCURY 外泌体分离试剂盒 | Qiagen | 76743 | 用于细胞外囊泡（EVs）的分离 |
| NaOH | Daejung | 1310-73-2 | 用于缓冲液配制 |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Thermo Scientific | J61196.AP | 用于细胞培养 |
| PKH 26 | MCE | 154214-55-8 | 用于标记细胞外囊泡（EVs）的红色荧光染料 |
| 海藻酸钠（Alg） | Sigma Aldrich | A0682-100G | 一种源自褐藻的天然多糖 |
| 氯化钠（NaCl） | Carl Roth | Art-Nr-P029.1 | 用于缓冲液配制 |
| StemPro BM 间充质干细胞 | Thermofisher | A1382901 | 间充质干细胞 |
| StemPro MSC SFM XenoFree | Thermofisher | A1067501 | 细胞培养基 |
| 0.25% 胰蛋白酶 | Thermofisher | 25050014 | 用于细胞解离 |
| 涡旋混合器 | Daihan Scientific | VM-10 | 用于将沉淀缓冲液与条件培养基充分混合 |
参考文献
- Falanga, V., et al. Chronic wounds. Nat Rev Disease Primers. 8 (1), 50(2022).
- Tran, H. Q., Shahriar, S. S., Yan, Z., Xie, J. Recent advances in functional wound dressings. Adv Wound Care. 12 (7), 399-427 (2023).
- Shao, M., et al.
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