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方法文章

利用同轴3D生物打印支架优化细胞外囊泡递送以管理慢性伤口

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DOI：

10.3791/67764

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2025年2月28日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory for Stem Cell and Regenerative Medicine, Natural and Medical Sciences Research Center, University of Nizwa, 2Doctoral Programme in Biomedicine, Faculty of Medicine, University of Helsinki

本文内容

摘要

本研究提出了一种用于慢性伤口愈合的核-壳结构3D生物打印支架的制备方案。从间充质干细胞中分离提取细胞外囊泡，并将其载入由海藻酸盐构成的芯层，壳层则由羧甲基纤维素和海藻酸盐裂解酶组成。该设计可实现支架的可控降解及细胞外囊泡的高效释放。

摘要

本研究概述了一种用于制备核-壳结构3D生物打印支架的详细方案，旨在促进慢性伤口愈合。该方案包括从间充质干细胞（MSCs）中分离细胞外囊泡（EVs），这类囊泡因其具有再生和免疫调节特性而备受关注。随后将这些EVs整合到一种独特的支架结构中。该支架由负载EVs的海藻酸盐核心构成，外层包裹由羧甲基纤维素和海藻酸盐裂解酶组成的壳层。这种创新设计可在促进EVs在伤口部位高效且可控释放的同时，实现支架的可控降解。本方案涵盖了多个关键步骤，包括EVs的制备与表征、适用于3D生物打印的生物墨水配制，以及打印参数的优化，以获得理想的核-壳结构。通过结合结构稳定性与生物活性，该支架旨在克服传统伤口敷料的局限性，为加速慢性伤口的组织再生和减轻炎症提供靶向性策略。该方法为开发具有潜在临床应用价值的先进生物材料提供了一种可重复且可放大的策略。此外，本方案还强调了获得稳定实验结果的关键注意事项，确保其在未来治疗应用中的可适应性。

引言

慢性伤口常与过度炎症相关，需要及时处理以防止感染和组织坏死等严重并发症，这些并发症可能导致截肢。尽管已有进展，目前的治疗方法仍存在成本高、使用不便、副作用多以及疗效有限等问题，凸显出对更具治愈效果的敷料的迫切需求1,2,3。开发专为慢性伤口设计的新一代伤口敷料对于应对这些挑战至关重要。此外，伤口愈合过程的复杂性要求敷料材料具备多种特性，包括保湿性、柔韧性、黏附性、生物活性和可生物降解性4。本研究旨在开发一种生物工程伤口敷料，将细胞外囊泡（EVs）与核-壳结构的三维生物打印支架相结合，以提供可控的治疗环境并加速慢性伤口的愈合。

干细胞来源的细胞外囊泡通过促进抗炎反应、细胞增殖、迁移和血管生成，有助于慢性伤口的愈合5此外，细胞外囊泡（EVs）可递送包括小分子药物、基因和蛋白质载体在内的生物活性分子，用于慢性伤口的管理。6此外，它们能够保护载荷物质免受酶降解，从而提高治疗剂的稳定性和生物利用度，相较于常迅速降解的传统生长因子和小分子药物具有显著优势 体内7尽管具有这些优势，细胞外囊泡向靶组织的有效且持续递送仍然是一个重大挑战。

3D生物打印支架可作为细胞外囊泡（EVs）的递送平台，以增强其治疗效果8。这些支架能够模拟天然细胞环境，并实现EVs的可控释放9,10。同时，它们还能保护EVs免于降解，提高其microRNA和蛋白质的稳定性11。Han等人证明，EVs可从3D生物打印的GelMA支架中有效释放，该释放过程促进了细胞黏附，并增强了接种于支架上的人颊脂垫间充质干细胞（hBFP-MSCs）中与机械转导通路相关基因的表达12。Born等人通过优化交联剂浓度，实现了EVs的可控释放。该方法在促进血管生成方面已显示出有效性，为EVs的调控递送提供了一种有前景的策略13。

同轴3D生物打印技术通过将核心材料包裹在壳层中进行打印，从而实现复杂多材料结构的构建。核心部分可包含细胞、生长因子或药物，而壳层则提供机械支撑与保护作用，或作为屏障。该技术在组织工程与再生医学领域具有广泛应用，例如构建血管网络、模拟天然组织结构以及开发药物递送系统。该方法能够精确控制材料的分布与组成，从而提升所构建结构的功能性与生物学相关性。相较于其他技术，同轴3D生物打印可更精确地调控材料分布与组分，进一步增强构建物的功能性与生物学意义14,15。

在伤口敷料中实现可调控的降解具有诸多优势，例如更换时减轻患者不适、提供利于愈合的湿润环境、控制感染、实现治疗剂的适时递送以及促进最佳的组织再生16,17,18。海藻酸盐（Alg）和羧甲基纤维素（CMCh）水凝胶具有良好的生物相容性，可用于将细胞外囊泡（EVs）有效递送至伤口部位，通过细胞间通讯和减轻炎症反应促进愈合18。在本研究中，将EVs包载于Alg构成的芯层，而鞘层则由CMCh与海藻酸盐裂解酶（AlgLyase）组成，以实现敷料的快速降解及EVs的同步释放。这种芯-鞘结构可在支架降解时快速释放EVs，从而提高其治疗效果，并克服现有慢性伤口治疗手段的局限性。本研究的主要目标是开发一种生物工程敷料，通过将可控的EVs释放与响应性可降解支架相结合，增强伤口愈合能力，最终改善慢性伤口的治疗效果。

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方案

动物实验完全遵循阿曼纳兹瓦大学生物伦理国家委员会和动物伦理委员会制定的伦理标准进行。本研究已获得伦理批准，批准编号为：VCGSR, AREC/01/2023。所有动物均饲养在标准实验室条件下，确保环境控制适宜、营养合理，并提供全面的护理，以保障其在整个研究期间的福利。所有涉及动物的操作均严格遵守机构政策、国际动物护理标准以及ARRIVE指南。

1. 细胞培养

  1. 从液氮储存中取出一管间充质干细胞（MSCs，第2代），并采用无菌技术操作以防止污染。在37 °C水浴中快速解冻细胞，当仅剩少量冰晶时立即取出。
  2. 准备完全培养基：以MSC SFM基础培养基为基础，添加1%（v/v）MSC SFM XenoFree补充剂、1%（v/v）GlutaMAX和0.01%（v/v）庆大霉素。向冻存管中逐滴加入1 mL预热至37 °C的完全培养基，每5秒加入3至5滴，随后轻轻混匀。在II级生物安全柜内的无菌条件下，将冻存管中的全部内容物转移至含有4 mL预热完全培养基的15 mL锥形离心管中。
  3. 在室温下以200 × g离心5分钟。确保离心机配平正确。
  4. 吸除上清液，并将细胞沉淀重悬于1 mL预热的完全培养基中。随后将细胞转移至含有4 mL完全培养基的T25培养瓶中。
  5. 轻轻倾斜培养瓶，确保细胞均匀分布。将培养瓶置于37 °C、5% CO2的培养箱中孵育。
  6. 每2天更换一次培养基，替换为新鲜的预热完全培养基。使用轻柔的移液操作以避免细胞损伤。当细胞融合度达到70%–80%时，吸除T25培养瓶中的旧培养基。
  7. 用3 mL新鲜PBS洗涤细胞以去除残留物。洗涤过程中确保培养瓶表面完全覆盖PBS。
  8. 向T25培养瓶中加入1 mL 0.25%胰蛋白酶溶液，在37 °C孵育3–7分钟，并在显微镜下以4倍物镜密切观察细胞脱落情况。
  9. 如需要，可轻敲培养瓶以促进细胞完全脱落。向培养瓶中加入预热的完全培养基，并反复吹打瓶壁表面以帮助细胞脱离。随后将细胞悬液转移至15 mL离心管中。
  10. 在室温下以200 × g离心5分钟。将细胞沉淀重悬于新鲜完全培养基中，使用Neubauer血细胞计数板进行细胞计数。将细胞接种至T75培养瓶中。确保接种密度为5,000个细胞/cm2，以获得最佳生长状态。
  11. 将细胞置于37 °C、5% CO2条件下孵育。细胞孵育72小时后，收集细胞条件培养基用于细胞外囊泡（EVs）的分离。收集后应立即使用。

2. 细胞外囊泡（EVs）的分离

  1. 将收集的13 mL条件培养基在800 × g 下离心15分钟，以去除细胞碎片。使用0.22 µm注射器滤膜轻轻过滤上清液，以去除大颗粒物质。
  2. 向过滤后的条件培养基中加入5 mL沉淀缓冲液，并充分涡旋混匀。确保溶液均匀一致。
  3. 在4 °C下孵育混合物过夜，使细胞外囊泡（EVs）沉淀。在20 °C下以3,220 × g 离心30分钟。检查离心管的平衡。
  4. 小心弃去上清液，避免扰动沉淀物。再次以3,220 × g 短暂离心5秒，以去除残留液体。
  5. 用200 µL PBS轻柔吹打重悬EV沉淀，避免损伤EV。根据制造商说明书（BCA蛋白检测试剂盒）测定EV的蛋白浓度。
  6. 进行Western blot检测EV特异性标志物（CD63、CD81和CD9），以验证EV表型18。分析证实这些标志物的存在，验证了EV的身份19。
  7. 为尽量减少RNase污染风险，建议直接使用，避免额外储存。如需保存，应将EV储存在-80 °C以备后续使用。将EV悬液分装为40 µL每份，避免反复冻融循环。

3. 使用PKH-26标记EVs

  1. 缓冲液制备
    1. 在无菌容器中，将 0.238 g HEPES 溶解于约 90 mL 无菌超纯水中。使用新鲜配制的 HEPES 溶液。向 HEPES 溶液中加入 0.85 g NaCl。
    2. 根据需要使用 1 M NaOH 或 HCl，借助校准过的 pH 计将 pH 值调节至 7.4。加入去离子水定容至 100 mL。通过 0.22 µm 滤膜过滤溶液以实现灭菌。
  2. 将 4 µL PKH-26 染料用 1 mL 上述制备的缓冲液稀释。用移液器充分混匀，确保溶液均一。
  3. 将纯化的 EVs 重悬于 1 mL PBS 中，浓度为 700 µg/mL。将 1 mL EVs 悬液加入 1 mL 制备好的 PKH-26 溶液中。对于仅含染料的对照组，将 1 mL 不含 EVs 的完全培养基加入 1 mL PKH-26 溶液中。后续所有步骤均需同时对对照组进行操作，以排除可能的非特异性聚集或胶束形成。
  4. 通过轻轻翻转离心管 10–15 次，充分混匀 EVs。室温孵育 3–5 分钟，确保 EVs 均匀接触染料。
  5. 使用无菌超纯水配制 2 mL 新鲜的 1% BSA 溶液，并将其加入 2 mL 反应混合物中以终止标记反应。轻柔混匀，防止聚集。
  6. 按照上述方案（步骤 2.2–2.7）浓缩 PKH-26 标记的 EVs。将标记后的 EVs 重悬于 300 µL PBS 中。用移液器将 PKH-26 标记的 EVs 样品转移至 30 kDa 滤膜管中。
  7. 在 4 °C 条件下，以 3,220 × g 离心 30 分钟。在此步骤中，游离的 PKH-26 染料和小分子将穿过滤膜进入滤液，而 PKH-26 标记的 EVs 将保留在截留液中。
  8. 初次离心后，弃去滤液，并向截留物中加入 300 µL PBS。通过上下吹打轻柔重悬 EVs。
  9. 再次在 4 °C 条件下，以 3,220 × g 离心 30 分钟，以洗去残留的游离染料或小分子。
  10. 使用荧光显微镜检测滤液中是否含有 PKH-26。若检测到染料残留，需重复洗涤步骤。
  11. 用微量移液器收集上层溶液，并从收集管中取出滤膜装置。小心地将滤膜装置倒置（即翻转朝下）。
  12. 将倒置的滤膜装置在 4 °C 条件下，以 800 × g 离心 5 分钟。此步骤有助于将滤膜上保留的 PKH-26 标记 EVs 收集至新的收集管中。标记完成的 PKH-26-EVs 可直接用于下一步实验。

4. 三维生物打印

  1. 生物墨水制备
    1. 使用无菌超纯水配制新鲜的4.5% (w/v) 海藻酸钠（sodium Alg）溶液。在60 °C下搅拌过夜，以确保溶液完全溶解。
    2. 将CMCh溶于无菌超纯水中，配制成3.8% (w/v) 的溶液。需新鲜配制，并在60 °C下搅拌过夜以确保完全溶解。
    3. 将配制好的生物墨水在25°C下以3,220 x g离心10分钟 ，以去除可能干扰打印过程的气泡。
    4. 使用注射器混合器将3 mL已配制的Alg溶液与标记的EVs或仅含染料的对照混合，使EVs终浓度达到0.01% (w/v)。通过轻柔混合确保均匀分布。
    5. 使用注射器混合器将1 mL CMCh与新配制的AlgLyase溶液在无菌超纯水中混合，使AlgLyase终浓度为0.5 mU/mL。
  2. 如图1A所示，将Alg/Exo生物墨水装入同轴注射装置的内核部分，同时将CMCh/AlgLyase生物墨水装入外壳部分。
  3. 打印前让生物墨水静置15分钟。
  4. 3D生物打印机设置
    1. 通过3D生物打印机软件，选择具有对角线填充模式的圆柱形结构来构建支架结构。设定圆柱体直径为20 mm，高度为1.1 mm，并将孔径设为1 mm。
    2. 设定内核和外壳喷嘴的泵送速度为1 mm/s，每层厚度为0.25 mm，移动速度设为6 mm/s。在室温下打印四层，每层厚度为0.25 mm。
  5. 开始在聚酯薄膜上进行打印。
  6. 使用含有气雾化氯化钙（2.2%）的加湿器，在挤出过程中对支架进行交联。将加湿器喷嘴置于距挤出头约20 cm处，以确保有效交联且不破坏支架结构。为进一步交联，将支架浸入2.2%氯化钙溶液中10分钟。
  7. 用无菌超纯水冲洗支架3次，以去除多余的氯化钙及未结合的生物墨水。
  8. 确保将支架储存在4 °C的无菌环境中，以维持其完整性和功能，可保存长达三个月。

5. 追踪细胞外囊泡（EVs）的释放

  1. 构建圆形皮肤伤口模型
    1. 通过腹腔注射 Ketamine（70 mg/kg）和 Xylazine（10 mg/kg）对雄性 Akita 杂合子糖尿病小鼠（8 周龄）进行麻醉。将麻醉后的小鼠置于加热垫或保温毯上。通过检测反射反应（如脚趾夹捏）是否消失并监测呼吸频率，确认麻醉效果充分。为防止麻醉期间角膜干燥，需在小鼠眼部涂抹无菌兽用眼膏。
    2. 使用电动剪刀剃除背部皮肤区域的毛发以进行准备，注意避免皮肤刺激或损伤。随后使用碘伏溶液和酒精交替擦拭三次，对剃毛区域进行消毒。
    3. 使用无菌皮肤活检打孔器在皮肤上标记一个直径 6 mm 的圆形区域，然后用手术剪将标记组织切除，从而在每只小鼠背部表面制造一个全层皮肤伤口。
    4. 将含有 PKH 标记 EVs 的 3D 生物打印支架轻柔地直接放置于伤口床上。使用无菌镊子轻轻按压，确保支架完全覆盖伤口表面且气泡最少。术后应密切观察动物状态，并持续看护直至其完全恢复意识并能维持胸卧位。
  2. 荧光成像
    1. 在植入后 2 h、4 h、8 h 和 24 h，使用异氟烷对小鼠进行麻醉。诱导麻醉时，将小鼠放入 in vivo 成像系统（IVIS）的麻醉室中，并以氧气为载体通入 2%–3% 的异氟烷。为防止眼部干燥，需在小鼠眼睛上涂抹眼膏。麻醉成功后，将小鼠转移至 IVIS 系统中，并通过鼻罩持续供给 1%–2% 的异氟烷以维持麻醉状态。在开始成像前，确认动物已完全麻醉且生命体征稳定。
    2. 使用 IVIS 系统采集从支架释放出的 PKH 标记 EVs 所产生的荧光信号。在成像向导中选择 荧光成像 选项，并激活适用于 PKH 染料的激发和发射滤光片。调整相机设置，包括视野范围和样本高度，以优化信号检测效果。确保所有时间点的成像位置保持一致，以便进行准确比较。开始采集图像，并保存所得数据。
    3. 使用 IVIS 软件定量分析荧光信号强度，从而实现对 EVs 随时间释放情况的追踪。

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结果

的 体内 Alg-EVs/CMCh 和 Alg-EVs/CMCh-AlgLyase 支架中EVs的释放情况如图所示 图1B，C正如预期，Alg-EVs/CMCh-AlgLyase支架在2小时和4小时时间点表现出比Alg-EVs/CMCh更快的释放速率。水凝胶中EVs的释放受多种理化机制共同调控，包括扩散、溶胀、侵蚀和降解。20通过利用Alglyase，该支架可促进Alg的降解，从而加速EVs的释放，有效调控伤口愈合早期阶段的慢性炎症。EVs的早期释放对于减轻过度炎症反应至关重要，而过度炎症可能延缓愈合进程。21,22,23为排除非特异性聚集或胶束形成的潜在影响，同时分析了对照组，结果显示荧光信号可忽略不计。该结果证实所检测到的信号主要来源于标记的细胞外囊泡。

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讨论

该方案的一个关键方面是核-壳支架的设计，这对于实现细胞外囊泡（EVs）的高效递送至关重要。该设计采用海藻酸盐（Alg）作为核心材料，以羧甲基壳聚糖（CMCh）与Alglyase的组合物作为外壳。这种结构可实现EVs的可控且快速释放。核心材料Alg包裹EVs，确保其稳定性及局部递送；外壳由CMCh和Alglyase组成，能够加速Alg核心的降解，这对于EVs的及时释放至关重要。在我们先前的发表文献中18，我们评估了 体外 从类似支架系统中释放细胞外囊泡（EVs）的动力学研究表明，该系统可在较长时间内实现可控释放，凸显了该方法在实现持续治疗效果方面的潜力。这种可控的降解与释放通过精确的配方设计和包封技术实现。这些数据将有助于关联EVs释放动力学与伤口愈合进程，从而更深入地揭示该支架的临床应用潜力。

在治疗应用中，缓慢释放系统具有优势，因为持续且较低浓度的药物或生长因子可能在降低副作用风险的同时提高疗效。例如，缓慢释放可确保在较长时间内持续刺激细胞过程26，避免可能引起毒性的...

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披露

作者声明不存在利益冲突。

致谢

特别感谢来自 Happy Production 的 Said Al-Hashmi 和 Abdulrahman Almharbi 在拍摄工作中付出的卓越努力。我们还要感谢阿曼高等教育、研究与创新部以及尼兹瓦大学提供的资金支持和所需资源。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
23 G 紫色精密锥形喷嘴CellinkKT0000002000用于实现生物墨水的精确挤出，且不易堵塞
海藻酸盐裂解酶（AlgLyase）Sigma AldrichA1603-100MGAlgLyase 是一种可降解海藻酸盐的酶
Amicon Ultra 离心过滤器，30 kDa 截留分子量MerckUFC9030用于洗涤 PKH-26 标记的细胞外囊泡（EVs）
BCA 蛋白检测试剂盒Thermo Scientific10678484用于测定蛋白/细胞外囊泡（EVs）浓度
生物打印系统RegematV1用于制备核-壳结构支架
牛血清白蛋白（BSA）sigma-aldrich05470-5G用于终止 PKH 26 反应 
氯化钙Sigma AldrichC3306-100G用于组织工程中生物墨水的交联与稳定
离心机Sigma2-16P用于细胞外囊泡（EVs）的分离
Centrifuge 5810 REppendorf22625101用于细胞培养
II 级生物安全柜TelstarBio II Advance用于细胞培养
CryoCube F570 系列 - 超低温冰箱EppendorfF571240035用于储存细胞外囊泡（EVs）
荧光显微镜OLYMPUS IX73P1F 用于检测滤液中残留的 PKH-26 荧光信号
庆大霉素（50 mg/mL）Thermofisher15750细胞培养基中的抗生素
GlutaMAX-I CTS（100X），液体ThermofisherA12860细胞培养基添加剂
HClSigma Aldrich7647-01-0用于缓冲液配制 
HEPESCarl RothArt. No. 6763.3用于缓冲液配制 
高黏度羧甲基纤维素（CMCh）BDH27929 4TCMCh 是一种水溶性纤维素衍生物
培养箱New Brunswick NB-170R用于细胞培养
活体成像系统PerkinElmerIVIS Lumina XRMS Series III 用于在活体中追踪细胞外囊泡（EVs）的释放
磁力搅拌器SalvisLABMC35用于生物墨水的制备
miRCURY 外泌体分离试剂盒Qiagen76743用于细胞外囊泡（EVs）的分离
NaOHDaejung1310-73-2用于缓冲液配制 
磷酸盐缓冲液（PBS）Thermo ScientificJ61196.AP用于细胞培养
PKH 26MCE154214-55-8用于标记细胞外囊泡（EVs）的红色荧光染料
海藻酸钠（Alg）Sigma AldrichA0682-100G一种源自褐藻的天然多糖
氯化钠（NaCl）Carl RothArt-Nr-P029.1用于缓冲液配制 
StemPro BM 间充质干细胞ThermofisherA1382901间充质干细胞
StemPro MSC SFM XenoFreeThermofisherA1067501细胞培养基
0.25% 胰蛋白酶Thermofisher25050014用于细胞解离
涡旋混合器Daihan ScientificVM-10用于将沉淀缓冲液与条件培养基充分混合

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