本方案介绍了如何使用FLICK检测法评估药物反应，包括利用该检测法计算药物诱导的细胞生长速率和死亡速率，以及评估药物诱导细胞死亡机制的详细操作步骤。
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摘要
摘要
为了理解药物疗效，一个关键需求是表征药物诱导细胞死亡的程度。由于存在十余种分子机制不同的程序性死亡形式，每种死亡方式具有独特的激活时序和生化标志特征，因此对药物诱导细胞死亡水平的定量工作面临挑战。此外，对于某些坏死性死亡亚型，其标志性特征仅短暂出现，并会因细胞破裂而迅速消失。因此，即使联合使用多种针对特定死亡通路的检测方法，也难以准确量化细胞死亡的总量或各死亡亚型的相对贡献。另一个问题是，许多特异性检测方法忽略了药物对细胞增殖的影响，导致难以判断经药物处理的细胞群体是在扩张还是在减少。FLICK 检测法能够在刺激后以特异性针对细胞死亡但基本不依赖所激活死亡类型的方式，量化细胞死亡的总体水平。此外，FLICK 检测法还能保留关于细胞总群体大小和细胞增殖速率的信息。在本文中，我们描述了 FLICK 检测法的基本操作流程，如何在使用不同类型生物材料时对该检测进行故障排查，以及如何利用 FLICK 检测法来量化各类细胞死亡对观察到的药物反应所作的贡献。
引言
对于抗癌药物，临床前的药物敏感性评估通常涉及测试药物对培养细胞活力的影响1。药物处理后的细胞活力由至少两种独立效应共同决定：药物诱导的细胞增殖抑制和细胞死亡的激活2。然而，尽管细胞死亡是实现持久药物应答所必需的关键特征，常规方法却无法明确揭示药物激活细胞死亡的程度3。
常见的药物反应检测方法包括直接计数细胞的方法（例如库尔特计数器、流式细胞术或显微镜的某些应用）、量化细胞增殖能力的方法（例如克隆形成实验），或量化代谢活性的方法（例如CellTiter-Glo、基于四唑盐的MTT或MTS检测）。这些检测方法的一个共同特征是所产生的数据与活细胞数量成正比。由于不同药物在协调生长抑制和细胞死亡方面存在显著差异，药物处理后活细胞数量并不能可靠地反映药物诱导的细胞死亡程度3。此外，由于癌细胞在细胞培养中通常增殖迅速，即使未引起任何细胞死亡，药物处理组的活细胞数量也可能相对于未处理组显著减少4。因此，这类方法的一个核心缺陷在于：若不同时测定活细胞和死细胞的数量，则无法准确量化细胞死亡的程度。
在药物处理后准确量化死亡细胞数量具有挑战性，原因有多个2。首先，目前已知存在十余种受调控的细胞死亡通路5,6,7,8。尽管通常存在可用于识别每种受调控细胞死亡类型的生化标志物，但这些标志物的特异性各不相同，且尚无单一检测方法能够同时量化所有死亡亚型。其次，不同形式的细胞死亡其激活时间在不同条件下差异显著，因此除非在多个时间点进行死亡量化，否则难以获得完整的动态图景9,10。许多用于量化细胞死亡的生化检测方法仅提供终点测量结果，因此获取动力学数据较为困难，且常受限于成本。第三个复杂因素在于，死亡细胞本身是活细胞状态与解离的细胞碎片之间的一个短暂中间状态。死亡细胞的稳定性因死亡亚型而异，某些类型（如凋亡）产生的细胞残骸相对稳定，而其他类型的死亡则导致细胞迅速裂解。因此，依赖收集和计数死亡细胞的方法也会导致对细胞死亡情况的片面理解。最后，第四个局限性在于，用于量化细胞死亡程度的生化检测通常无法提供药物如何影响细胞增殖的任何信息。因此，无法准确解读细胞群体的总体规模，以及更重要的是，该群体是在扩张还是在缩小。
一些基于显微镜的检测方法（如 STACK 和 SPARKL）能够有效随时间测量活细胞和死细胞，这些检测可提供关于药物诱导细胞死亡的全面信息10,11。然而，这些检测需要专用仪器（如 Incucyte 显微镜），从而限制了通量以及对这些方法的可及性。此外，基于显微镜的技术要求在整个实验过程中死细胞始终保留在显微镜的焦平面内，当细胞从培养板脱落或随着时间推移发生降解时，会削弱对死细胞的定量能力。类似地，当应用于悬浮培养体系时，基于显微镜的检测也面临挑战，因为细胞会不断进出特定的焦平面。
为解决上述问题，我们开发了一种名为FLICK（基于荧光与裂解依赖的细胞死亡动力学推断）12,13的检测方法。FLICK检测的目标是测定药物诱导的细胞死亡水平，而无需考虑细胞死亡的具体方式。该方法采用细胞膜不通透性染料，其荧光信号依赖于与DNA的结合。FLICK的一个关键特征是利用这些荧光染料标记因DNA暴露而累积的死亡细胞；在检测结束时，通过机械性去垢剂裂解使所有存活细胞膜通透。结合数学建模对这些数据进行分析，可实现对活细胞和死细胞群体的定量，具有连续的时间分辨率，且无需收集或单独处理死亡细胞。此外，使用酶标仪检测死亡细胞的荧光信号，使得即使死亡细胞破裂也能被准确评估，从而避免了对导致细胞破裂的坏死性死亡形式的检测偏差。最后，FLICK检测所需板孔操作极少，能够快速获得动力学数据，适用于高通量药物筛选。在本实验方案中，我们将重点介绍FLICK检测的应用，包括如何利用FLICK推断药物诱导的细胞生长速率、死亡速率及细胞死亡机制。
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方案
1. 针对每种目标细胞系优化透化时间
注意：所述体积和用量适用于优化一种细胞系。根据拟测试的细胞系数量，应相应扩大这些数值。
- 在96孔黑色壁、光学底板的每孔中接种所需数量的细胞。加入100 µL完全培养基，使细胞过夜贴壁。
注意：接种细胞数量应根据细胞的生长速率、最佳密度以及检测持续时间进行优化。对于贴壁性癌细胞系，在72 h内检测的典型起始细胞数量为每孔1500–5000个细胞。例如，U2OS细胞可在含10%胎牛血清（FBS）、2 mM谷氨酰胺和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基中，以每孔2000个细胞的密度接种，并在标准条件下（5% CO2、37 °C、湿度环境）培养过夜。 - 在15 mL圆锥形离心管中，配制1.5 mL含1.5% Triton-X的磷酸盐缓冲液（PBS）溶液。以最大速度涡旋震荡1.5% Triton-X溶液5秒，随后置于37 °C水浴中至少30分钟。
- 通过短时间涡旋震荡数秒，肉眼检查确认Triton-X已完全溶解，确保溶液均匀一致。
- 向接种细胞的每孔中加入10 µL 1.5% Triton-X溶液。不要混匀。
注意：此步骤中不宜通过反复移液混匀，以免产生气泡。 - 将细胞放回5% CO2、37 °C、湿度环境的细胞培养孵箱中孵育至少1 h。
注意：加入Triton-X溶液后，大多数细胞系在2–3 h内可完全裂解。若使用SYTOX Green等染料，孵育时间延长至24 h对荧光信号的影响极小。提高Triton-X浓度可缩短难裂解细胞系所需的孵育时间。 - 使用10倍物镜在光学显微镜下观察细胞形态。每隔1小时检查一次，直至细胞体不再可见。记录细胞通透化所需时间。
注意：若有荧光显微镜，可通过细胞不可通透性DNA染料（如SYTOX Green）观察裂解过程。可将染料以终浓度10倍加入Triton-X溶液中，并通过荧光显微镜确认通透化效果。
2. DNA染色剂的选择与校准
注意：FLICK 检测法需要使用一种细胞非渗透性荧光染料，该染料在与 DNA 结合后可发出信号，且不影响细胞活力，其信号强度与细胞数量呈线性关系。本方案使用 SYTOX Green。其他具有类似特性的染料也可能适用于 FLICK 检测法，但每种染料均需进行评估和校准。参见表 1中的示例。
- 针对所选的DNA染料，根据制造商的建议确定待测试的浓度范围。
- 对于每个待测试的浓度，将40,000个细胞以180 µL细胞培养基的形式，每组三个复孔，接种于96孔黑色侧壁、光学底板的微孔板最左侧一列。向其余各孔中加入90 µL培养基。
注意：此步骤用于在微孔板的行方向上建立线性细胞梯度。首列各孔的最终细胞浓度为20,000个细胞/孔。对于从孔上方读取荧光信号的酶标仪，无需使用光学底板。细胞培养基应与待测细胞日常培养所用的培养基相同。例如，若使用U2OS细胞，则应将40,000个细胞重悬于180 µL DMEM中。 - 使用多通道移液器，通过将90 µL液体从最左侧列转移至右侧相邻列，进行1:2的连续稀释。移液15次以充分混匀。
- 重复步骤2.3，依次从第二列转移至第三列，再从第三列转移至第四列，依此类推，直至完成倒数第二列的稀释。最后一列不加细胞，用于获取细胞培养基的背景信号。
- 对于倒数第二列，移除90 µL液体，使所有孔中均含有90 µL含不同数量细胞的培养基。将细胞置于37 °C细胞培养箱中贴壁6小时。
- 针对每种待测试的染料浓度，用目标细胞所用的完全生长培养基配制10x浓度的DNA染料溶液。同时，按照步骤1的方法，配制1.5 mL含1.5% Triton-X的PBS溶液。
- 向96孔板的每个孔中加入10 µL 10x DNA染料溶液。再向每个孔中加入10 µL 1.5% Triton-X溶液以通透细胞。将细胞在此溶液中孵育步骤1中确定的最佳时间。
注意：加入Triton-X后，DNA染料的终浓度略低于1x，但此差异可忽略不计。孵育结束后，整个微孔板中的细胞应完全裂解。该手动细胞梯度将用于确定最佳的DNA染料浓度及最佳荧光检测参数。 - 测量细胞梯度板上的荧光强度。根据DNA染料制造商提供的指南，在一系列不同的检测参数下定量荧光信号。根据所用酶标仪的性能，调整激发波长、发射波长和/或数字增益。
- 通过减去不含细胞列的平均信号值，从每个测量值中扣除背景信号。这些值可在连续稀释板最右侧一列的孔中获得。
- 针对每种DNA染料浓度和每种检测参数，评估其线性关系。可通过绘制细胞数量与荧光信号的关系图并进行线性回归分析来确定线性。决定系数（r2）用于反映荧光信号与细胞数量之间的线性相关程度。
- 选择线性关系与动态范围结合最佳的检测参数和DNA染料浓度。
注意：应综合考虑0至20,000个细胞的整个范围。确保在低细胞数量（0至1,000个细胞）范围内，增益和DNA染料浓度仍具有良好的线性。尽管多个仪器设置或染料浓度在整个范围内可能表现出较强的相关性，但必须保证低浓度端的灵敏度足够稳健，以便能够准确检测死细胞的微小变化。
3. 细胞铺板、孔内加药及药物处理板中随时间变化的死细胞荧光检测
注意：药物稀释板可根据实验需求灵活设计。通常，药物稀释板将包含一种或多种药物的对数或半对数稀释系列。
- 考虑实验的最佳包板布局。为降低因生长差异带来的噪声，应避免使用96孔板外周孔进行测量，因为外周孔的温度、氧气供应和蒸发情况与板内中间孔存在差异。
注意：在整个培养板的布局中设置对照组可提高生长数据的可靠性。建议在培养板的中央和边缘区域均设置对照孔。 - 确定实验所需的培养板数量。额外增加一个培养板，用于在实验开始时进行裂解，以确定给药时每孔的平均细胞数量（即 T0 对照板）。
- 在完全培养基中制备细胞悬液。
- 根据实验所需的培养板数量（在步骤 3.2 中计算），确定所需细胞悬液的体积。若以指定密度接种培养板，则需 90 µL 每孔约需 10 mL，每块板亦同。将所需板数乘以 10 mL 计算总体积。
注意：建议增加此体积以补偿储液槽的死体积以及移液过程中的体积损失。例如，可将计算出的体积乘以1.2。 - 计数细胞，并根据每孔所需的细胞数量制备细胞稀释液。例如，若目标为每孔接种2000个细胞， 90 µL 每块96孔板每孔的培养基体积，共3块板，按下述方法计算实验所需的总细胞数量：
![细胞计数公式：\( \frac{2000 \text{ cells/well}}{0.09 \text{ mL/well}} \times [(3 \text{ plates} \times 10 \text{ mL}) \times 1.2] = 800,000 \text{ cells} \)；定量细胞生长计算。](/files/ftp_upload/67768/67768eq1v4.jpg "figure-protocol-1")
同样，如果计数后的细胞悬液浓度为 400,000 个细胞/mL，则实验所需的细胞悬液体积为：
- 通过减去待添加的已计数细胞悬液体积，校正铺板所用细胞培养基的体积。
36 mL 培养基 2 mL 细胞悬液 = 34 mL 校正后培养基体积
- 根据实验所需的培养板数量（在步骤 3.2 中计算），确定所需细胞悬液的体积。若以指定密度接种培养板，则需 90 µL 每孔约需 10 mL，每块板亦同。将所需板数乘以 10 mL 计算总体积。
- 用移液管将计数后的细胞悬液与适量培养基混匀，然后将该细胞悬液转移至V型底试剂储液槽中。
- 使用多通道移液器，加入 90 µL 将细胞悬液加入到96孔板的每个孔中。使用刻度移液管反复吹打试剂储液器中的细胞悬液，以充分混匀，确保单位体积内的细胞浓度保持恒定。
- 让细胞在培养皿中贴壁过夜 37 °C 细胞培养箱（通常为12-24小时）。
- 用 PBS 配制 1.5% Triton-X 溶液，具体方法见步骤 1。该溶液的体积应足以裂解所有培养板。约 1.5 mL 的 1.5% Triton-X PBS 溶液足以裂解一块 96 孔板。
注意：PBS 中的 1.5% Triton-X 溶液可稳定保存一周以上，可根据需要预先配制。 - 确定配制药物稀释板所需的细胞培养基体积。在U型或V型底96孔透明板中配制药物稀释板。
- 为确保稀释药物的体积足以满足实验需求，应增加最低所需体积以补偿移液过程中的体积损耗。例如，若需添加药物时 10 µL 向96孔板的每个孔中加入，并且实验包括三块板， 30 µL 每孔需要稀释的药物量。准备 40-50 µL 每孔加入含药物的培养基以补偿体积损失。为补偿T0对照组培养板所需的培养基，应在所需培养基体积基础上增加1.5 mL。
- 在完全培养基中配制所选DNA染料的10倍浓度溶液。该浓度依据步骤2.11中选定的浓度确定。此溶液的总体积在步骤3.8中计算得出。
- 使用步骤 3.9 中的 DNA 染料 + 生长培养基，配制待测每种药物的 10 倍浓度储备液。仅在药物稀释板中制备每种药物的最高剂量浓度，然后使用多通道移液器进行梯度稀释，在每孔之间混合 15 次。
注意：在药物稀释板中配制某种药物的最高浓度时，应考虑药物本身的体积，以确保浓度准确。 - 使用多通道移液器，加入 10 µL 将步骤3.10中的药物+DNA染料溶液加入含细胞的培养板中。
注意：对于已进行系列稀释的药物稀释板，若从最低药物浓度开始向最高浓度依次向细胞中添加药物，则无需更换多通道移液器的吸头。但是，每次更换药物稀释板时，以及每次使用过的吸头接触过含有不同药物或更高药物浓度的孔时，均应更换多通道移液器的吸头。 - 读取所有添加药物的培养板的荧光值。此荧光读数为 T0 读数（即时间为 0 小时时的死亡细胞数）。
- 在采集 T0 荧光读数后，将培养板放回培养箱。
- 添加 10 µL 步骤3.9中制备的10x DNA染料溶液 10 µL 将步骤3.7中的1.5% Triton-X溶液加入T0对照孔板中。将该孔板放回培养箱，孵育时间按照步骤1.8中选定的时间进行。
- 在细胞完全裂解后，按照步骤1.6所述方法读取T0对照板。
4. 测定药物处理孔板随时间变化的死细胞荧光信号
注意：尽量减少培养板在培养箱外的时间。长时间的温度变化可能影响细胞活力，暴露于光照下可能破坏DNA荧光染料（如SYTOX Green）的性能。
- 在给药后每3-4小时对所有药物处理的孔板进行一次荧光读数。除非需要非常精确的死亡动力学数据，否则无需在夜间进行读数。
注意：时间点无需固定或按标准间隔采集。通常情况下，仅在正常工作时间内采集时间点数据，不会对后续的死亡动力学分析造成误差。只要在死亡发生前、死亡上升期以及死亡饱和/平台期均有部分测量数据，即可推断出动力学曲线。 - 在设定的最终时间点采集荧光读数，随后立即向每孔加入10 µL在步骤3.7中配制的1.5% Triton-X溶液，以裂解细胞。
- 将孔板放回培养箱，使细胞按照步骤1中确定的时间进行通透处理。
- 通透处理完成后，再次采集荧光读数。该荧光值与每个孔中的细胞总数（即活细胞+死细胞）成正比。
5. 计算致死分数动力学
注意：本方案中描述的计算可在任意格式或软件中进行分析。然而，使用 MATLAB、R 或 Python 等编程环境将实现更快速且更灵活的分析。
- 使用50%截尾均值法计算T0对照板的平均荧光值。该值与加药前细胞总数成正比。
- 通过曲线拟合和指数生长函数，计算实验中所有孔的群体生长动力学。每个孔的初始群体大小为第5.1步计算得到的T0平均荧光值；每个孔的最终群体大小为第4.4步计算得到的透化后荧光值；实验持续时间为从0 h至第4.4步选定的实验终点。
- 利用第5.2步确定的生长参数，计算每个孔在实验中每个测量时间点的总细胞数量。通过从第5.2步计算得到的总细胞数中减去死亡细胞测量值，确定每个测量时间点的活细胞数量。
注：由于实验中存在少量噪声，偶尔活细胞数可能为微小的负数。此时可手动将其设为0，因为活细胞数量不可能为负，该情况极可能表示该孔中所有细胞均已死亡。 - 通过将每个时间点的死亡细胞荧光信号除以该时间点的总细胞信号，计算每个时间点的致死分数（LF）。
- 将Lag Exponential Death（LED）方程拟合至致死分数的时间过程数据10。为避免对未引起显著致死效应的药物剂量拟合出任意的动力学参数，应拟合斜率为0的线性模型。根据实验噪声水平或未加药条件下的LF值判断显著致死水平。
- 从LED方程中记录死亡起始时间（DO）。LED方程包含四个参数：初始LF（LFi）、平台期LF（LFp）、初始死亡速率（DR）和DO。通过非线性回归（即曲线拟合）从数据中推导这些参数。
- 计算每种药物在每个剂量下实验终点的相对存活率（FV）。用1减去终点LF值，或用活细胞数除以总细胞数。
注：FV可在任意时间点计算，不仅限于实验终点。这些数据用于评估药物剂量-效应关系（如药物IC50或EC50）。
6. 计算 GR 值
- 确定实验开始时每个孔中活细胞的平均数量。使用步骤 3.15 中计算的通透处理后 T0 读数，减去步骤 3.12 中采集的各孔 T0 读数，来计算该值。在下方的 GR 方程（步骤 6.3）中，该值记为 x0。
注意：有时药物的最高浓度可能会干扰 DNA 染料的荧光读数。此时可考虑使用对照孔的数据来计算时间 0 时活细胞的平均数量。 - 对于对照孔（xctrl），确定实验终点时每个孔中活细胞的平均数量；对于每种药物处理条件（x(c)），确定其在实验终点时活细胞的平均数量。
注意：根据平板上细胞生长的变异情况，可采用不同的 xctrl 值对每个孔进行归一化处理。例如，若 xctrl 值在平板上呈现系统性变化，则使用最近的 xctrl 值可能优于使用整块板的平均 xctrl 值。 - 对于每个药物处理孔，使用以下公式计算归一化的生长抑制率（GR）值4：
采用四参数逻辑回归进行曲线拟合。GR 的取值范围为 -1 至 1。
7. 使用 GRADE 方法计算药物诱导的生长和死亡速率
注意：GR 表示净种群增长率，而非真实的细胞增殖率。药物诱导的种群生长率和死亡率可通过 GR 与致死分数（LF）的组合来计算。
- 使用 T0 对照组读数中的平均活细胞数（x0）、实验终点对照组条件下的平均活细胞数（xctrl）以及实验持续时间（小时，t），代入以下公式计算实验过程中细胞系的倍增时间（τ）：
注：准确计算细胞倍增时间（τ）的前提是细胞在整个实验期间持续呈指数倍增。对于存在接触抑制的细胞，应以起始接种密度确保在目标实验时间内不会达到汇合状态。例如，U2OS 细胞的平均倍增时间为 24 小时，在 72 小时的实验中，每孔接种 2000 个细胞最有利于准确评估其生长速率。 - 确定生长/死亡速率与群体大小之间的关系。为此，使用出生/死亡模型，并以所有合理的生长速率与死亡速率的两两组合初始化模拟。该模拟需要 T0 对照板的平均活细胞数（x0）、实验持续时间（t），以及用户定义的合理增殖速率范围（p）和死亡速率范围（d）。
- 为确定合理的生长速率取值范围，以未处理组细胞群体每小时倍增数（1/T）作为最高生长速率，0 作为最低生长速率，将此区间划分为 500 个等间距段。死亡速率也可采用类似方法，测试从 0 到 1 的范围。
注：所有 500 个速率的两两组合可在任意编程环境中实现，但某些软件可能因计算量过大而难以完成。可将组合数减少至 50 个生长速率与 50 个死亡速率的两两组合，以降低计算负担，但会相应降低推断精度。本实验方案已提供相应的电子表格模板。
- 为确定合理的生长速率取值范围，以未处理组细胞群体每小时倍增数（1/T）作为最高生长速率，0 作为最低生长速率，将此区间划分为 500 个等间距段。死亡速率也可采用类似方法，测试从 0 到 1 的范围。
- 针对每一对模拟的增殖（p）和死亡（d）速率，计算相应的 GR 和 LF 值（如上所述）。
注：步骤 7.2–7.3 将生成一个表格，其中包含每一对理论上的增殖与死亡速率，以及对应计算出的 GR 和 LF 值。该表格将作为查找表，用于将实验测得的 GR/LF 值对与理论上的药物诱导增殖和死亡速率对进行匹配。测试超过 500 个离散的增殖和死亡速率值可提高数值精度，但该精度可能已超出实验本身的测量精度范围。 - 计算每个实验测得的 GR/LF 值对与查找表中每个理论 GR/LF 值对之间的成对距离。将与实验观测值对距离最小的理论值对推断为真实的药物诱导增殖速率和死亡速率。
8. 使用通路选择性化学抑制剂确定死亡通路
注意：仅使用化学抑制剂不足以明确确定某种药物诱导死亡的具体机制。死亡通路的化学抑制剂应用于确定在后续实验中应进一步探索的生化或表型反应，这些实验可能包括形态学评估、通路特异性的生化标志物检测以及遗传依赖性的分析。
- 通过在感兴趣的细胞死亡通路的经典激活剂条件下，测试不同浓度梯度的细胞死亡抑制剂，优化目标细胞系中每种抑制剂的剂量（表2）。理想情况下，所选抑制剂剂量本身不应影响细胞活力（通过GR指标进行验证）。
注意：并非所有细胞系都能激活全部类型的细胞死亡通路。在测试不同死亡通路的激活剂/抑制剂时，可能需要进行生化或表型验证。 - 设计抑制剂筛选实验的最佳铺板布局。为尽量减少批次效应，应将每种药物与其正在评估的抑制剂置于同一块板上，并在不同的板上设置重复。
- 按照步骤3.3的方法，将所需数量的细胞接种至96孔黑色侧壁、光学底板的培养板中各孔，但接种体积减少至80 µL，以预留抑制剂和药物的添加体积。
- 用完全培养基配制待测抑制剂的10倍浓度储备液，每孔加入10 µL。用细胞死亡通路抑制剂预处理细胞2–4小时。随后加入目标药物，并按照步骤3–5的方法进行荧光信号检测。
- 评估死亡起始时间（DO）和/或最大致死分数的变化，以判断抑制剂的效果。DO是基于滞后指数死亡（LED）模型推导出的参数。参见步骤5.6–5.7。
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结果
采用本方案，我们探究了U2OS细胞对HDAC抑制剂Belinostat的敏感性。实验中使用2 µM SYTOX Green标记死细胞（图1A）。使用荧光酶标仪在增益设为130的条件下进行动力学读数（图1B）。在检测结束时，用含1.5% Triton-X的PBS溶液裂解细胞，处理2小时（图1C-D）。
FLICK 协议可提供关于群体生长速率和药物诱导细胞死亡速率的信息。这些信息可单独查看，也可通过药物 GRADE 可视化与分析框架进行整合观察（图 1E）。使用 GR 值评估贝利司他（Belinostat）的敏感性显示，1 µM 贝利司他处理后的 GR 值约为 0（图 2A）。在 GR 尺度上，正值表示群体扩增速率，负值表示群体缩小速率。因此，GR 值为 0...
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讨论
FLICK 检测是一种用于全面评估药物对细胞群体生长和死亡影响的可靠方法。由于该方法不直接计数细胞，因此实验方案中的关键步骤是确保检测的线性关系以及在 Triton 透化步骤中实现完全裂解。正确的透化时间可以通过肉眼观察确定（如本方案中所强调的），也可以通过随时间读取孔板荧光信号并确定信号达到平台期的时间来定量判断。然而根据我们的经验，当存在疑问时，延长透化时间似乎没有任何负面影响：对于我们在 FLICK 检测中使用的 DNA 染料，裂解后信号强度可在数天内保持稳定。我们常规使用 SYTOX Green 核酸染料，尽管我们并未验证 表 1 中提到的每一种荧光染料，但已有其他多个实验方案证明了它们的有效应用13,15,16。通过评估特定的细胞非渗透性 DNA 染料在不同细胞数量和仪器设置下的线性响应，可确保获得可靠且具有定量意义的实验数据。
某些细胞系比其他细胞系更...
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
感谢李实验室所有过去和现在的成员，他们为我们在评估药物反应方面的研究视角做出了贡献。本工作获得了美国国立卫生研究院对MJL的资助（R21CA294000和R35GM152194）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 贝利司他 | ApexBio | A4612 | |
| 喜树碱 | ApexBio | A2877 | |
| 15 mL 圆锥形离心管 | Fisher Scientific | 12-565-269 | |
| DMEM | Corning | 10017CV | 用于细胞接种和药物处理 |
| DMSO | Fisher Scientific | MT-25950CQC | 用于细胞接种和药物处理 |
| Fisherbrand 96 孔细胞培养处理U型底微孔板 | Fisher Scientific | FB012932 | 用于细胞接种和药物处理（针板） |
| Greiner Bio-One CELLSTAR μClear 96 孔细胞培养处理平底微孔板 | Greiner | 655090 | 用于细胞接种和药物处理 |
| IncuCyte S3 | Essen Biosciences | 任何相位显微镜均可使用 | |
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | MATLAB 版本 R2023b，需具备有效许可证 |
| 微孔板荧光读板仪 | Tecan | Spark | 用于检测死细胞荧光信号 |
| 帕博西尼 | ApexBio | A8316 | |
| PBS | Corning | 21-040-CM | 任何 PBS 均可使用 |
| Spark 多功能微孔板读板仪 | Tecan | https://www.tecan.com/spark-overview | SparkControl 软件版本 2.2 |
| 25 mL 无菌储液槽 | Fisher Scientific | 13-681-508 | 用于细胞接种和药物处理 |
| Sytox Green 核酸染料 | Thermo Fisher Scientific | S7020 | 用于检测死细胞荧光的 DNA 染料 |
| Triton-X 100 | Thermo Fisher Scientific | J66624-AP | 用于细胞通透处理 |
| U2OS | ATCC | HTB-96 | 本实验方案中使用的一个示例细胞系 |
| Z-VAD-FMK | ApexBio | A1902 |
参考文献
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- Dixon, S. J., Lee, M. J. Quick tips for interpreting cell death experiments. Nat Cell Biol. 25 (12), 1720-1723 (2023).
- Schwartz, H. R., et al. Drug GRADE: An Integrated Analysis of Population Growth and Cell Death Reveals Drug-Specific and Cancer Subtype-Specific Response Profiles. Cell Rep. 31 (12), 107800(2020).
- Hafner, M., Niepel, M., Chung, M., Sorger, P. K. Growth rate inhibition metrics correct for confounders in measuring sensitivity to cancer drugs. Nat Methods. 13 (6), 1-11 (2016).
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