本文介绍了一种在实际真实环境中利用母亲自身乳汁的微生物群重建巴氏消毒供体乳微生物群的方案。该方法可实现有效的细菌生长和微生物组调控，支持在产科医院及其关联人乳库的常规护理中可行地应用此操作流程。
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摘要
摘要
母亲的乳汁（MOM）是新生儿最完整的营养来源。当母亲无法产生足够的乳汁或无法进行母乳喂养时，首选替代方案是经过巴氏消毒的捐赠人乳（PDM），该乳品通常由人乳库常规提供。与任何市售配方奶相比，PDM 提供更全面的营养和免疫成分。然而，为确保生物安全性，PDM 需经过巴氏消毒处理，该过程会灭活共生微生物群，并降低某些生物活性化合物的含量。本研究提出了一种利用 MOM 作为微生物来源恢复 PDM 微生物群的实验方案，并将该方法适配于真实的临床环境。
该方案已在一家妇产医院及其附属人乳库开展的临床试验中实施，旨在为因母亲乳汁分泌不足而无法获得足够母乳的早产儿提供个性化的捐赠乳。该方法包括将捐赠乳（PDM）接种10%的母亲亲源乳（MOM），随后在37 °C条件下孵育4小时。微生物学分析显示，接种后的人乳（IM）在孵育后实现了细菌的有效增殖，且重构乳（RM）的微生物群谱与母亲亲源乳（MOM）高度相似，表明微生物群得到了有效重建。这些结果提示，该重构方案在新生儿护理中具有可行性，有望提升捐赠乳的营养与免疫品质，从而促进非母乳喂养新生儿的健康与发育。
引言
母乳被广泛认为是新生儿最佳的营养来源，不仅提供必需的宏量和微量营养素，还含有多种复杂的成分，包括各种代谢物以及免疫系统组分，如抗体、细胞因子和细胞1。此外，母乳中的有益特性还来源于其共栖微生物群落。母乳中的所有这些成分在新生儿的发育过程中均发挥着至关重要的作用1。这一微生物群落被称为微生物组，其组成受多种因素共同影响，包括饮食、母亲的生活方式、分娩方式和妊娠年龄，导致每份母乳的微生物组均具有独特的特征2。母乳微生物组促进新生儿发育的机制多种多样，从通过共栖细菌定植保护肠道黏膜，到通过产生与肠道免疫细胞相互作用的代谢物促进免疫系统的成熟3。因此，每位母亲乳汁中独特的微生物谱使其成为一种针对新生儿的个性化医疗形式4。
健康的微生物群有助于保护新生儿，通过占据生态位并支持营养供给，防止潜在致病微生物的定植，这一点对于早产儿尤为重要，因为他们处于医院环境中且免疫系统尚未发育成熟，更容易受到外界影响。此外，早产儿的母亲往往难以产生足量的乳汁来喂养新生儿。通常，妊娠周龄越小，乳汁产量越低5。在这种情况下，喂养新生儿的最佳选择是由人类乳库（Human Milk Banks, HMB）提供的经巴氏消毒的捐赠乳6。
巴西拥有全球规模最大且分布最广的人乳库（HMB）网络7。该网络通过由卫生部管理的国家统一卫生系统（Sistema Único de Saúde），在全国范围内免费收集、制备和分发超过160,000升巴氏消毒供体人乳（PDM）7。巴氏消毒对于确保捐赠乳汁在新生儿使用中的生物安全性至关重要。该过程通常采用Holder法，即将盛有未经处理的供体母乳的容器置于62.5 °C水浴中加热30分钟6,8。所得巴氏消毒乳（PDM）随后在冷藏条件下储存，直至可供使用。然而，巴氏消毒会降低乳汁中共生微生物群的活性，并减少多种生物活性成分的生物可利用度。这是因为巴氏消毒工艺的标准设定旨在防止致病微生物传播给新生儿。在此背景下，Cacho及其同事于2017年提出，可通过将母亲自身乳汁（MOM）以不同比例接种至PDM中，以重建其共生微生物群9。他们的研究结果表明，使用10%浓度的母亲自身乳汁（MOM）是维持MOM微生物组原始构成的最佳比例。该方法可降低特定细菌过度生长的风险，这些细菌虽通常为共生菌，但在重建乳汁中比例失衡时可能产生危害。具体而言，研究发现1:10稀释比例（10% MOM + 90% PDM）在4小时孵育后，细菌负荷达到良好平衡——约为未稀释MOM中细菌含量的60%——表明该方法更安全且更有效。相比之下，较高比例（如3:10）的稀释会导致细菌过度增殖，凸显了为确保安全性而严格控制浓度与条件的必要性。
本文展示了在产科医院及其附属人乳库的常规护理中，可在真实世界条件下实现将母乳微生物群重新构建于捐赠人乳中的这一操作过程。
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方案
本方案作为本研究团队开展的一项临床试验流程的一部分实施（巴西临床试验注册中心，ReBEC RBR-729kr8x），已获得伦理委员会批准（编号 CAAE nº 41063520.4.0000.0121），并在随机分组和样本采集前获取了所有参与者的知情同意。
重建牛奶微生物群的过程分为三个步骤：
1. 获取母亲的生乳
注意：获取牛奶的步骤可参见其他文献10,11。
- 操作前，应根据伦理委员会要求获得母亲的知情同意，并向其详细说明将要进行的所有步骤，解答其关于该操作的任何疑问、顾虑、恐惧和焦虑，以确保母亲处于放松状态。
- 在产科病房护士长的监督下，指导母亲使用电动吸乳器将乳汁挤入无菌容器中，并遵循各产科病房既定的本地卫生标准。
- 采集完成后，使用母亲的个人信息、采集日期和时间对盛装乳汁的容器进行标记。母亲自体乳汁（MOM）应在 -4 °C 或更低温度下保存，最长不超过 12 小时。
2. 巴氏消毒供体乳（PDM）的解冻
注意：HMBs 拥有其自备的 PDM 储备，需在低于 -4 °C 的温度下冷冻保存，最长保存时间可达 6 个月，该程序在其他文献中已有详细描述12,13,14。
- 将储存于带塑料盖的无菌玻璃容器中的生乳或巴氏消毒人乳（PDM）置于40 °C水浴中解冻，以确保温度恒定并缩短处理时间。
注意：切勿在室温或冷藏温度（冰箱内）下解冻PDM，因为在此类条件下解冻时间延长，会促进微生物的暴露与生长。 - 在瓶内乳汁温度升至5 °C以上之前，将其从水浴中取出。
3. 通过母体微生物组移植对PDM进行接种以实现微生物组重建
注意：使用母乳（MOM）接种PDM的标准体积比为90%:10%（v/v）。操作步骤如下：
- 指导技术人员穿戴实验服、口罩、帽子和手套。
- 根据当地机构规程，使用表面清洁液清洁工作台面。
- 摆放所需材料并准备仪器设备。将水浴孵育箱中的水预热至 37 °C。
- 规划最终接种乳的总体积，并选择合适大小的容器。将装有新鲜人乳（MOM）和液态巴氏消毒乳（PDM）的容器放置于工作台面上。
- 使用无菌器械取最多 1 mL 的人乳（MOM）作为分装样品，用于后续的 16S 测序和细菌计数。将该样品分装至无 DNase/RNase 的冻存管中，并于 -80 °C 保存。
- 使用无菌量具（如注射器、移液器）将相当于最终所需乳体积 10% 的剩余人乳（MOM）转移至食品级容器中，随后将该容器浸入 37 °C 水浴中孵育 4 小时。
- 使用无菌器械取 1 mL 的巴氏消毒乳（PDM）作为分装样品，用于后续的 16S 测序和细菌计数。将该样品分装至无 DNase/RNase 的冻存管中，并于 -80 °C 保存。
- 使用无菌量具（如注射器、移液器）将相当于最终所需乳体积 90% 的巴氏消毒乳（PDM）转移至前一步骤中含人乳（MOM）的容器中，混合后形成接种母乳（IM）。
- 用可防止外部液体渗入的盖子密封容器，并将其浸入 37 °C 水浴中孵育 4 小时，以使接种至乳中的微生物增殖。
- 孵育 4 小时后，从水浴中取出容器，此时内容物称为复原乳（RM）。
- 使用无菌器械保留最多 1 mL 的复原乳（RM）作为分装样品，用于后续的 16S 测序和细菌计数。将该样品分装至无 DNase/RNase 的冻存管中，并于 -80 °C 保存。
- 将剩余体积转移至已消毒的容器中，用于喂养新生儿。
4. 通过平板细菌培养验证方法
注意：所有操作均须在无菌条件下进行，以防止污染并确保稀释的准确性。细菌生长可通过其他文献所述方法进行估算9,15。
- 将每种乳汁样本（PDM、MOM、IM、RM）用无菌生理盐水进行连续稀释，制备成 10-1、10-2、10-3 和 10-4 浓度的稀释液。充分混匀每种稀释液，以确保细菌分布均匀。
- 使用无菌涂布棒或玻璃涂布器，将每种稀释后的样本各 100 µL 分别涂布于 Man-Rogosa-Sharpe（MRS）和甘露醇盐琼脂（MSA）平板上，每种稀释度设三个重复。确保液体均匀覆盖整个琼脂表面。
- 将 MRS 琼脂平板置于厌氧罐中培养，以创造低氧环境，促进乳酸菌生长。
- 将甘露醇盐琼脂（MSA）平板在有氧条件下培养，以支持葡萄球菌属的生长。
- 将所有平板在 37 ± 2 °C 条件下培养 48–72 小时。
- 选择在每种琼脂类型上菌落数量可计的稀释度（25–250 个菌落）。
- 对所选稀释度的三个重复平板上的可见菌落进行计数。
- 分别计算 MRS 和 MSA 培养基中所选稀释度三个重复平板的平均菌落数。
- 使用以下公式计算每种样本每毫升的菌落形成单位（CFU）数量，并转换为以 10 为底的对数形式（log10），以便于数据分析。随后进行统计学分析。
CFU/mL 数量 = 菌落数 × 总稀释倍数 / 接种体积（mL）
5. 牛奶微生物组分析
注意：乳汁微生物组分析可按照其他文献所述的方法和流程进行16。本分析所用 R 脚本的截图见补充图 S1。
- 将500 µL样品在180 × g 条件下离心15秒，以沉淀细胞和颗粒物。
- 收集350 µL上清液，用于DNA提取。
- 使用分光光度计对提取的DNA进行定量。
- 使用20 ng DNA和引物357F/805R扩增16S核糖体RNA的V3和V4区（见材料表）17。
- 使用磁珠纯化所得扩增子，并使用DNA荧光计对带条形码的扩增子进行定量。
- 以双端250 bp模式对扩增子进行测序。
- 对所得序列进行质量剪切和接头去除处理18。采用Phred33评分的双端模式（PE），并设置最小读长为200 bp，以确保获得高质量的读段。
- 使用清单文件格式和命令“qiime tools import”将双端序列数据导入QIIME 219。
- 使用命令“qiime dada2 denoise-paired”通过DADA2对导入的序列进行去噪、去重复和嵌合体去除。此步骤生成高质量的代表性序列和特征表。
- 使用命令“qiime feature-table filter-features”和“qiime feature-table filter-seqs”对特征和序列进行过滤，仅保留具有足够代表性的特征和序列。
- 通过命令“qiime feature-classifier extract-reads”提取引物扩增区域（V3-V4），构建参考数据库。
- 使用VSEARCH算法，在97%序列一致性阈值下，结合Silva参考数据库进行分类学注释，执行命令：
qiime feature-classifier classify-consensus-vsearch - 使用BIOM工具“biom add-metadata”将分类学注释信息整合至特征表中。
- 按其他文献所述方法进行统计分析20,21。
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结果
通过平板培养进行细菌生长分析
为验证 Cacho 等人9提出的使用 MOM 对 PDM 进行接种的方法而开展的微生物学检测表明，根据每毫升菌落形成单位（CFU/mL）计数，接种后的牛奶样品在 4 小时培养前后无显著差异。然而，在这两个时间点观察到菌落数量存在差异，表明在 MSA 培养基上 Staphylococcus spp. 以及在 MRS 培养基上乳酸菌（LAB）培养期间发生了细菌生长（图 1A 和 图 1B）。如预期所示，PDM 样品未显示细菌生长，证实了巴氏灭菌工艺的有效性。
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讨论
本文介绍了一项适用于与人类乳汁库相关联的产科医院的实验方案，旨在通过特定母亲自身乳汁微生物群的重建，为无法提供足量乳汁的新生儿提供经微生物群重建的人乳。该方案操作简便，主要包含两个步骤。第一步涉及人类乳汁库常规开展的捐献乳汁采集及后续巴氏消毒程序，同时采集该母亲自身的乳汁，用于后续扩增其乳汁微生物群。6,7,8第二步基于所描述的步骤进行 体外 由 Cacho 及其合作者于 2017 年9该方案目前正在我们开展的一项临床研究（ReBEC RBR-729kr8x）中应用，旨在确定接受经母亲自身乳汁微生物群个性化调整的捐赠人乳（PDM）对新生儿的益处。
因此，图1 显示，如预期所示，巴氏杀菌乳中不含细菌，而在接种生乳后可回收到细菌，并在37 °C孵育4小时后进一步增加。此外，
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披露
作者声明不存在任何竞争利益。
致谢
作者们衷心感谢巴西卫生部 SUS 研究计划（PPSUS/2020）提供的经费支持；圣卡塔琳娜州研究与创新支持基金会，资助编号：2021TR000506；巴西科学技术部国家科学技术发展委员会（CNPq）普遍研究计划，资助编号：420996/2023-0；2022–2024 年度科研启动奖学金项目，资助编号：120815/2023-0。我们还感谢志愿者提供样本。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 电动吸乳器 | Horigen | XN-2219M2 | Soft pump dual plus |
| Pyrex 培养瓶 | Corning | CLS1395100 | 带塑料盖的玻璃容器 |
| 1000 µL 移液器 Labmate pro | Corning HTL SA | 5666 | 可调体积移液器 |
| 冻存管 | Corning | CLS431417 | 无DNase/RNase的2 mL冻存管 |
| 15 mL 离心管 | Corning | CLS431470 | 无DNase/RNase的15 mL离心管 |
| 水浴锅 | EcoSonics | Q3.0/40A | |
| Man–Rogosa–Sharpe (MRS) | Difco | 288210 | 乳酸菌生长培养基 |
| 甘露醇盐琼脂（MSA） | Himedia | MH118 | 金黄色葡萄球菌 生长培养基 |
| 厌氧罐 | Permution | 为乳酸菌生长提供低氧环境 | |
| Extracta 试剂盒 – DNA 和 RNA | Loccus | MPTA-PV16-B Y | DNA提取试剂盒 |
| Nanodrop | Promega | E6150 | Quantus DNA |
| GoTaqG2 | Promega | M7841 | PCR扩增系统 |
| Quantus荧光计 | Promega | E5150 | DNA / RNA定量试剂盒 |
| MiSeq系统 | Illumina Inc. | M-GL-00006 v4.0 | 测序设备 |
| MiSeq试剂盒v2（300个循环） | Illumina Inc. | MS-102-2002 | 测序试剂盒及试剂 |
| 软件名称 | |||
| Trimmomatic | http://www.usadellab.org/cms/index.php?page=trimmomatic | Illumina NGS数据读长修剪工具 | |
| QIIME 2 | https://docs.qiime2.org/2024.10/ | 微生物组分析软件包 | |
| 引物名称 | 引物序列 | ||
| 16S_357F | TCGTCGGCAGCGTCAGA TGTGTATAAGAGACAGC CTACGGGNGGCWGCAG | ||
| 16S_805R | GTCTCGTGGGCTCGGAG ATGTGTATAAGAGACAGG ACTACHVGGGTATCTAATC |
参考文献
- Szyller, H., et al. Bioactive components of human milk and their impact on child's health and development, Literature Review. Nutrients. 16 (10), 1487(2024).
- Fernández, L., Rodríguez, J. M. Human milk microbiota: Origin and potential uses. Nestle Nutr Inst Workshop Ser. 94, 75-85 (2020).
- Fernández, L., Ruiz, L., Jara, J., Orgaz, B., Rodríguez, J. M. Strategies for the preservation, restoration and modulation of the human milk microbiota. Implications for human milk banks and neonatal intensive care units. Front Microbiol. 9, 2676(2018).
- Meier, P. P. More evidence: Mothers' own milk is personalized medicine for very low birthweight infants. Cell Rep Med. 3 (8), 100710(2022).
- Fewtrell, M. S., et al. Predictors of expressed breast milk volume in mothers expressing milk for their preterm infant. Arch Dis Child Fetal Neonatal Ed. 101 (6), F502-F506 (2016).
- Abrams, S. A., et al. Donor human milk for the high-risk infant: Preparation, safety, and usage options in the United States. Pediatrics. 139 (1), e20163440(2017).
- Brasil é referência em doação de leite materno. , Serviços e Informações do Brasil. At https://www.gov.br/pt-br/noticias/saude-e-vigilancia-sanitaria/2020/02/brasil-e-referencia-em-doacao-de-leite-materno (2024).
- Landers, S., Updegrove, K. Bacteriological screening of donor human milk before and after holder pasteurization. Breastfeed Med. 5 (3), 117-121 (2010).
- Cacho, N. T., et al. Personalization of the microbiota of donor human milk with mother's own milk. Front Microbiol. 8, 1470(2017).
- Pumping breast milk. , Centers for Disease Control and Prevention - CDC. https://www.cdc.gov/nutrition/infantandtoddlernutrition/breastfeeding/pumping-breast-milk.html (2023).
- Expressing and storing breast milk. , NHS UK. https://www.nhs.uk/conditions/baby/breastfeeding-and-bottle-feeding/breastfeeding/expressing-breast-milk/ (2020).
- Arslanoglu, S., et al. Recommendations for the establishment and operation of a donor human milk bank. Nutr Rev. 81 (Supplement_1), 1-28 (2023).
- Moro, G. E., et al. Processing of donor human milk: Update and recommendations from the European Milk Bank Association (EMBA). Front Pediatr. 7, 49(2019).
- Landers, S., Hartmann, B. T. Donor human milk banking and the emergence of milk sharing. Pediatr Clin North Am. 60 (1), 247-260 (2013).
- Stachelska, M. A. Identification of Lactobacillus delbrueckii and Streptococcus thermophilus strains present in artisanal raw cow milk cheese using real-time PCR and classic plate count methods. Pol J Microbiol. 66 (4), 491-499 (2017).
- Ruiz, L., et al. Comparison of two approaches for the metataxonomic analysis of the human milk microbiome. Front Cell Infect Microbiol. 11, 622550(2021).
- Lopez Leyva, L., Brereton, N. J. B., Koski, K. G. Emerging frontiers in human milk microbiome research and suggested primers for 16S rRNA gene analysis. Comp Struct Biotechnol J. 19, 121-133 (2021).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: A flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
- Bolyen, E., et al. interactive, scalable and extensible microbiome data science using QIIME 2. Nat Biotechnol. 37 (8), 852-857 (2019).
- McMurdie, P. J., Holmes, S. phyloseq: An R package for reproducible iInteractive analysis and graphics of microbiome census data. PLoS ONE. 8 (4), e61217(2013).
- R Core Team. R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. https://www.R-project.org/ (2024).
- Torrez Lamberti, M. F., et al. Metabolomic profile of personalized donor human milk. Molecules. 25 (24), 5783(2020).
- Mallardi, D., et al. Inoculation of mother's own milk could personalize pasteurized donor human milk used for feeding preterm infants. J Transl Med. 19 (1), 420(2021).
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