使用纳米纤维膜建立上皮细胞的三维共培养模块

摘要

在这里，我们展示了在基于纳米纤维膜的两层系统中用成纤维细胞培养的上皮细胞如何稳定地粘附并在膜上生长。

摘要

上皮细胞培养的技术障碍包括去分化和功能丧失。仿生三维 （3D） 细胞培养方法可以提高细胞培养效率。本研究介绍了一种先进的两层培养系统，旨在将上皮细胞培养为组织样层，并在 3D 环境中培养成纤维细胞。聚乙烯醇 （PVA） 和聚 （ε-己内酯） （PCL） 纳米纤维膜 （NMs） 通过静电纺丝制备，并分别用作上皮细胞和成纤维细胞培养的生理相关细胞外基质。在上插入孔中，肺上皮细胞在 PVA NM 上培养，在下腔室中，成纤维细胞在 PCL NM 上培养。这种配置消除了细胞间的直接接触，并有助于检查由可溶性因子介导的旁分泌信号传导。采用共聚焦显微镜分析细胞内蛋白质的分布、生长模式和表达，包括上皮细胞中的带闭塞带。Z 轴堆叠技术实现了详细的 3D 重建，从而提供了对上皮层内紧密连接和空间组织的完整性的精确见解。扫描电子显微镜 （SEM） 评估了纳米纤维膜上细胞类型的形态学特征。SEM 成像揭示了复杂的细胞表面结构和与纳米纤维的相互作用，为细胞结构和细胞与纳米纤维结构的相互作用提供了全面的视角。细胞计数试剂盒 8 （CCK-8） 测定是一种测量上皮细胞和成纤维细胞生长速率随时间变化的简单方法。它提供了这些细胞共培养的增殖行为和潜在的协同效应。这些发现强调了简单的插入共培养系统对同时培养成纤维细胞和上皮细胞的有效性，这在各种生理和药理学环境中至关重要，包括上皮组织再生、肿瘤微环境与内皮细胞、免疫细胞和其他基质细胞、毒性测定和药物活性测试。

引言

几十年来，经典的二维 （2D） 单层培养对于了解感染、药理学和毒理学至关重要 ^1,2。然而，重要的是要考虑复杂性、多成分之间的动态相互作用以及组织微环境的三维 （3D） 结构。因此，2D 细胞培养在模拟组织样结构方面存在局限性 ^3,4。例如，缺乏细胞间和细胞间细胞外基质 （ECM） 信号传导，这对于体内微环境中的细胞分化、增殖和细胞功能至关重要。由于这些原因，已经开发了 3D 细胞培养系统⁵。3D 培养中的细胞生长并与周围的细胞外基质进行三维相互作用。此外，已经开发了一种由多种细胞类型组成的 3D 共培养方法，以弥合简单的单细胞类型体外模型与体内发生的动态细胞相互作用之间的差距 ⁶。3D 共培养系统在细胞间通讯和细胞间基质 （ECM） 相互作用的研究中越来越受欢迎 ^7,8,9,10。当前的 3D 共培养系统有多种形式，可分为直接和间接共培养 ^8,9。在直接共培养中，培养细胞中的各种细胞功能主要受直接接触而不是旁分泌效应的影响。相比之下，间接共培养通过使用屏障或层来分离不同的细胞类型，在研究旁分泌相互作用方面具有更大的优势。

使用各种材料和方法制造模拟 ECM 的仿生支架，使用生物相容性和可生物降解的物质¹⁰。纳米纤维支架结构模拟生物组织中天然 ECM 的构型，为细胞培养提供 3D 架构^11,12。静电纺丝纳米纤维膜 （NMs） 已用于不同类型细胞的直接和间接共培养 13,14,15。

上皮细胞形成主要器官的物理屏障，而成纤维细胞是介导 ECM 重塑和调节邻近上皮细胞的主要基质细胞 ^6,16,17。上皮细胞和成纤维细胞分别通过细胞表面的整合素受体与基底膜中的层粘连蛋白和间质基质中的纤连蛋白相互作用¹⁸。当上皮细胞在直径为 150 - 250 nm 和微孔的聚乙烯醇 （PVA） NM 上培养时，它们会形成多层而不是细胞聚集体和球状体，并且它们的生长模式与上皮组织中细胞的生长模式相似¹⁹。相比之下，直径为 400-1,500 nm 和 10-50 μm 微孔的聚己内酯 （PCL） NM 为培养的成纤维细胞的生长提供了与间质基质相似的空间维数^13,14。由于它们的生物相容性，PVA 和 PCL 膜是组织工程中常用的聚合物^20,21。

本研究介绍了一种先进的两层培养系统，该系统使用多孔静电纺丝 NM 将上皮细胞培养为组织状层和 3D 结构内的成纤维细胞。该方案可分为五个关键阶段:纳米纤维制造、纤维后交联和质量评估、膜附着培养孔的制备、细胞接种和 3D 共培养以及 3D 培养细胞的测定。

方案

1. 制备水稳定的 PVA 纳米纤维

1. 称取 0.02 g 聚丙烯酸 （PAA） 和 1 g PVA，然后将它们加入装有磁棒的干净玻璃瓶中。向瓶中加入 7.8 mL 蒸馏水，将瓶子放在板式搅拌器上，将温度设置为 84 °C，速度为 500 rpm，时间为 12 小时。
2. 让瓶子冷却至室温，然后加入 0.2 mL 戊二醛 （GA）。将瓶子放在板式搅拌器上，将速度设置为 500 rpm，将时间设置为 30 分钟，并将温度设置为室温。
3. 使用 5 mL 注射器进行静电纺丝，将柱塞与桶分开，并清洁桶内和柱塞尖端的小塑料碎屑。
4. 用针头阻止液体流动，然后将 PVA 溶液倒入每个桶中（体积:每个桶 2.5-3 mL）。组装柱塞，然后取出针头。
   注意:溶液中可能有气泡，因此请等待气泡消失。这需要 10-30 分钟。
5. 组装一根新的 27 G 金属针，然后将其放入静电纺丝机中。
6. 用箔纸将收集器包裹好。
7. 让喷油器面板返回到原始位置。对机器使用以下设置:（每个泵）进样体积:2 mL，进样速率:6 μL/min，滚轮速度:100 rpm，吸头到收集器的距离:14 cm。检查每个泵的液体流量。
8. 以大约 12 kV 的电位运行机器。
9. 确保过程开始时的湿度为 40 - 50%，过程结束时的湿度为 25 - 30%。当湿度降低时使用加湿器，并在静电纺丝前一天将装有蒸馏水的盘子放入机器内以增加湿度。
   注意:这是成功制造 PVA 纳米纤维的关键因素。
10. 定期检查流程。如果针被堵塞，请暂时停止机器。使用实验室湿巾去除液滴，并等待新的液滴出现。如果没有，请更换针，然后继续运行机器。
11. PVA 纳米纤维的制造过程需要 ~6 小时才能完成。静电纺丝过程完成后，从收集器上拆下含有纤维毡的箔片，并将纳米纤维毡存放在真空干燥剂中。

2. 用盐酸 （HCl） 蒸汽处理 PVA 纳米纤维膜并评估纤维质量

注:PVA NMs 的水稳定性在 HCl 蒸气后交联反应后得到很好的保留。该工艺针对 NM 的合适厚度、孔径和粗糙度进行了优化。PVA 是一种非常亲水性的聚合物，静电纺丝 PVA 纳米纤维在与水接触和潮湿的条件下不稳定。PVA NM 应在制造 PVA 聚合物后立即用 HCl 蒸气处理。

1. 将纳米纤维垫切成所需大小的碎片，用于 trans-well 插入物。
2. 准备一个装有 1.5 mL 纯 HCl 的小培养皿。将含 HCl 的培养皿和纳米纤维块放入真空室中，然后盖上盖子。
   注:HCl 蒸气用作后交联剂，使纳米纤维具有水稳定性。
3. 打开连接到真空泵的阀门，等待 10 秒，直到 HCl 烟雾上升，然后关闭阀门。用 HCl 烟雾处理膜 2 分钟。
4. 用 HCl 蒸气处理后，向膜中加入几滴蒸馏水 （DW），将它们放在载玻片上，然后从箔上去除膜。风干 20 分钟后，膜自然粘附在载玻片上。
5. 使用自动溅射镀膜机在碳带上涂上一层薄薄的金。获取扫描电子显微镜 （SEM） 图像。
6. 将 PVA NM 与 HCl 交联后，用 1x PBS 洗涤 3 次，并在将它们浸泡在培养基中后检查 pH 值，以确认没有残留的 HCl。

3. PCL 纳米纤维的制造和纳米纤维质量评估

1. 称取 1.5 g PCL 并将其加入干净的玻璃瓶中。向瓶子中加入 8.5 mL 氯仿，将瓶子放在平板搅拌器上，并在室温下将 PCL 溶解在氯仿中 12 小时。
2. 重复步骤 1.3 至 1.9，步骤 1.7 和 1.8 除外，将进样速率设置为 8 μL/min，电压设置为 17.5 kV。
   注意:PCL 制造需要 ~3.5 小时才能完成。
3. 切下一小块膜，并通过自动溅射工艺涂布 5 分钟。获取 SEM 图像。

4. 在反式孔中组装两层膜

注意:在本实验步骤中，我们使用 24 孔板及其各自的插入孔。PVA NM 连接到插入孔，而 PCL NM 连接到底部孔。

1. 将纳米纤维垫切成圆形，PVA 和 PCL NM 的直径分别为 10 毫米和 13 毫米。
2. 使用聚二甲基硅氧烷 （PDMS） Sylgard 184 作为粘合剂，将膜很好地连接到小室和腔室上。使用前，将 Sylgard 184 Base（A 部分）和固化剂（B 部分）以 10:1 的质量比混合在塑料杯中。使用干净的载玻片将 PDMS 溶液剧烈混合 2-3 分钟，直到整个混合物充满气泡。使用前让气泡形成并消失 10 分钟;同时，让载玻片升温至 100 °C。
3. 将 PDMS 铺在载玻片上，然后将插入物的底部边缘轻轻浸入 PDMS 中。将插入物倒置在载玻片加热器上，以使 PDMS 硬化（~10-15 分钟）。用 200 μL 吸头仔细检查，确保 PDMS 不粘。
4. 按照步骤 2.2 至 2.4 中的说明处理 PVA NM 片。
5. 轻轻地将插入孔压在 PVA NM 片上，使插入物的底部孔面向膜片的纳米纤维侧。在井的中心加入一滴蒸馏水，用镊子去除箔纸。将插入孔放入新的 24 孔板中，让膜干燥。
6. 将 PCL NM 片连接到底部孔时，请务必将 200 μL 吸头浸入 PDMS 混合物中，并在四个角和中心精确点缀。
7. 将板放在载玻片加热器上，让 PDMS 硬化 5-7 分钟，以确保组件的质量。
8. 将 PCL NM 片放入含有 PDMS 的井中，将膜的纳米纤维侧连接到 PDMS 上。使用干净的小刷子轻轻按压膜片的铝箔侧，以完成连接。向孔中加入 0.2 mL 的 70% 乙醇，以轻松去除箔片。
9. 在紫外线下对 trans-well 设置中的插入物和底孔消毒过夜。
   注意:混合 PDMS 可以储存在 -20 °C 以备进一步使用。注意:PCL 纳米纤维膜连接板可以干燥储存，但使用前必须用 70% 乙醇润湿。
10. 第二天，分别加入 200 μL 和 500 μL 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 清洗插入片段和底部井，持续 3 x 10 分钟。插件和底部孔即可使用。

5. 细胞接种和组装两层共培养模型

注:将 MLE-12 细胞在含有 10% 胎牛血清 （FBS） 和 1% 青霉素/链霉素抗生素的 1x Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM）/F12 中培养。将 NIH3T3 细胞在含有 10% FBS 和 1% 青霉素/链霉素抗生素的 1x DMEM 高葡萄糖中培养。

1. 将细胞维持在 150 mm 培养皿中。当它们达到 70-80% 汇合时，用 10 mL 的 1x PBS 洗涤细胞，并用 2 mL 预热的 0.05% 胰蛋白酶/EDTA 溶液在 37 °C 下胰蛋白酶消化 3 分钟。
2. 轻轻敲击培养皿以从底部去除细胞，然后向每种类型的细胞中加入 8 mL 完全培养基以中和胰蛋白酶。将细胞悬液转移至 50 mL 离心管中，以 400 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。用 Cell-Tracker 对细胞进行染色，以观察 NM 上接种细胞的分布（有关详细信息，请参阅第 6 节）。
3. 将细胞沉淀重悬于 5 mL 完整的 DMEM/F12 培养基中。确定细胞数量并调整至 6 × 10⁶ 个 MLE-12 细胞/mL 和 8 × 10^个 5 个 NIH3T3 细胞/mL。
   注:完全 DMEM/F12 培养基用于与 MLE-12 和 NIH3T3 细胞共培养。
4. 用 500 μL 完整的 DMEM/F12 培养基填充底部孔（没有 PCL 的孔）。将 PVA 纳米纤维膜附着插入物转移到反式孔中，并加入 50 μL MLE-12 细胞悬液。将细胞在 37 °C 和 5% CO₂ 下孵育。
5. 同时，用 500 μL 的 NIH3T3 细胞悬液填充 PCL 纳米纤维膜附着的底井，并在 37 °C 和 5% CO₂ 下孵育细胞。
6. 2 小时后，在反式孔设置中组装含有 MLE-12 细胞的插入片段和含有 NIH3T3 细胞的底井。这是以 MLE-12 细胞为上层，以 NIH3T3 细胞为下层的共培养模型。在两层膜中共培养细胞所需的时间。

6. 细胞分布测定

1. 在总体积为 2 mL 的 DMEM/F12 完全培养基中制备 5 μM Cell-Tracker 红色和绿色溶液。
2. 胰蛋白酶消化后，将 MLE-12 细胞与先前制备的 Cell-Tracker 红色溶液混合，将 NIH3T3 与 Cell-Tracker 绿色溶液混合。将细胞在 37 °C 和 5% CO₂ 下孵育 30 分钟，以确保最佳细胞标记。向样品中加入 8 mL 完全 DMEM/F12 培养基，并以 400 × g 离心 5 分钟。
   注:Cell Tracker 不会影响细胞活力和增殖。因此，可以培养 Cell-Tracker 染色的细胞直至汇合。培养后 4-5 天，染色细胞中的荧光强度可能会降低。
3. 重复步骤 5.3 到 5.6。
4. 在共聚焦显微镜下观察时，将插入孔从 24 孔板转移到 12 孔板。
   注:这最大限度地减少了物镜和细胞之间的距离，从而可以观察细胞形态。

7. 3D 共培养细胞的共聚焦观察

注意:与成纤维细胞与 PCL NM 的粘附相比，上皮细胞对 PVA NM 的附着较弱。通过移液管吸液手动丢弃旧培养基，并将新培养基或溶液轻轻添加到孔壁上。在染色过程中，尽量不要让膜干燥。

注:可以通过包被层粘连蛋白或在 PVA 纳米纤维中掺入整合素结合基序的肽来改善细胞粘附¹⁹。

1. 将插件转移到新的 24 孔板上。弃去旧培养基，加入 150 μL 4% 多聚甲醛 （PFA） 溶液。在室温下孵育 15 分钟。
2. 去除 4% PFA 溶液，并用 150 μL 的 1x PBS 洗涤粘附的细胞。
3. 对于封闭和透化，加入 150 μL 5% 正常山羊血清和 0.2% Triton X-100 在 1x PBS 中稀释，并在室温下孵育 30 分钟。
4. 用抗体稀释剂稀释 Alexa Fluor 594 偶联的抗 zonea occludens Ab （1:400） 和 Phalloidin-iFlour 488 （1:1,000），制备它们。去除封闭溶液，每孔加入 150 μL 荧光团溶液，并在室温下孵育 1 小时。
   注:以极高的精度制备抗体溶液，因为它会直接影响结果的质量。避免暴露在光线下。
5. 弃去抗体溶液，用 150 μL 的 1x PBS 洗涤细胞 10 分钟。
6. 加入 150 μL 用 1x PBS （1:1,000） 稀释的 Hoechst 33342 并孵育 10 分钟;避免暴露在光线下。
7. 取出 Hoechst 33342 溶液，用 150 μL 1x PBS 洗涤粘附的细胞 10 分钟。
8. 准备干净的载玻片并添加精确量的水性封固凝胶。使用带有尖头的镊子小心翼翼地将膜从周围边缘分离。将膜放在封固凝胶上，确保包含细胞的一侧朝上。加入精确量的封片凝胶，并用盖玻片盖住。用指甲油密封载玻片，确保精确和完整的密封。
9. 使用以下成像设置在共聚焦显微镜下观察细胞:激光功率控制:405 强度 10;激光功率控制:488 强度 10;激光功率控制:561 强度 10;探测器灵敏度:420LP（600 值）;检测器灵敏度:525/50（700 值）;检测器灵敏度:561LP（750 值）。

8. 细胞与纳米纤维的粘附测定

1. 丢弃旧培养基，用 150 μL 的 1x PBS 洗涤细胞。
2. 在室温下用 150 μL 用 1x PBS 稀释的 3% GA 固定细胞 1 小时。
3. 在 10 分钟内用 150 μL 的 1x PBS 洗涤细胞。
4. 通过加入 150 μL 在 1x PBS 中稀释的 1% 四氧化锇 （OsO₄） 1 小时来二次固定细胞。
   注意: OsO₄ 及其蒸气是有害的。它必须在通风橱中使用。
5. 丢弃溶液，用 300 μL 1x PBS 洗涤细胞 2 x 10 分钟。
6. 在每个步骤中，用 50%、70%、90% 和 95% 至 100% 的分级乙醇将细胞脱水 10 分钟。通过加入新鲜的 100% 乙醇 10 分钟来执行最后的脱水步骤。
7. 将细胞和膜完全风干。使用带有尖头的镊子分离膜，然后使用两侧水龙头将膜放在标本架上。进行离子溅射 5 分钟，然后在 SEM 下以 2,000 倍放大倍率观察细胞。

9. 细胞生长测定

注:在本实验步骤中，CCK-8 测定用于按照制造商的说明量化细胞生长速率。

1. 通过将 9 份预热的 DMEM/F12（按体积）与 1 份 CCK-8 试剂混合来制备 CCK-8 混合物。去除旧培养基后，将 150 μL 的 CCK-8 混合物添加到含细胞的孔中。
2. 将插入片段转移到新的 24 孔板中，以将其与含有细胞的底部孔分开。将细胞在 37 °C 和 5% CO₂ 下孵育 45 分钟。
3. 收集上清液并将其转移到 1.5 mL 试管中。以 1,800 × g 离心 3 分钟。
4. 将微量离心管中的 100 μL 上清液添加到 96 孔板中。读取 450 nm 处的光密度 （OD）。

结果

该方案概述了通过构建基于纳米纤维膜的两层模型共培养 MLE-12 肺上皮细胞和 NIH3T3 成纤维细胞的关键步骤（图 1）。该模型适用于共培养细胞的活细胞成像、免疫组织化学和终点定量分析。也可以通过优化细胞密度和生长条件来利用其他细胞类型。

SEM 显示制造的 PVA 纳米纤维分布均匀，没有任何珠子形成（图 2A）。PVA 纳米纤维的直径范围为 150 nm 至 230 nm（180 ± 25 nm，平均值±标准差 （SD））。静电纺丝 PCL NMs 中的纳米纤维是随机取向的，结构类似于胶原蛋白（图 2B）。PCL NM 中的大多数纤维直径在 300 nm 和 7 μm （3.8 ± 2.5 μm） 之间。因此，PVA 纳米纤维膜的孔径小于 PCL 纳米纤维膜。

接种前，分别用 Cell-Tracker 红色和绿色对 MLE-12 和 NIH3T3 细胞进行染色，并在整个共培养过程中进行监测。如图 3 所示，可以清楚地观察到插入室中 MLE-12 细胞和下室中 NIH3T3 细胞的空间分布。聚焦堆叠分析显示，NIH3T3 细胞在不同深度 （102 ± 20 μm） 分散和检测到，而 MLE-12 细胞形成厚度为 80 ± 10 μm 的层。SEM 显示细胞附着在膜上。NIH3T3 细胞浸润 PCL 纳米纤维膜并沿纳米纤维轴延伸，而 MLE-12 细胞粘附在 PVA 纳米纤维膜表面并表现出聚集（图 4）。接下来，我们通过肌动蛋白染色检测 NIH3T3 细胞和 MLE-12 细胞的细胞骨架组织。在 PCL 纳米纤维膜上培养的 NIH3T3 细胞显示类似于组织中细胞的肌动蛋白丝的弹射分布，在 PVA 纳米纤维膜上培养的 MLE-12 细胞中的肌动蛋白染色显示圆形聚集体，没有细胞扩散（图 5）。

比较 MLE-12 细胞在单一培养和共培养中的分布和生长模式。在 PVA NMs 上单一培养的 Cell-Tracker 红色染色细胞形成聚集体，但共培养条件下的细胞在膜上保持均匀分布（图 6A）。在共聚焦显微镜图像的 3D 分析中，与在没有成纤维细胞的情况下培养的细胞相比，PVA NM 上共培养的 MLE-12 细胞的生长模式显示培养细胞分层粘附在膜上，细胞密度更高（图 6B）。此外，细胞表面（箭头所示）上带状闭合素 （ZO）-1 的细胞间粘附和表达，但在细胞聚集体中则不然，在共培养条件下比在没有成纤维细胞的培养中更明显（图 6C）。

使用 CCK-8 测定法测量膜上细胞的增殖。NIH3T3 和 MLE-12 细胞增殖随时间增加（图 7）。然而，在膜上观察到的细胞生长速率低于培养板（数据未显示）。与培养板中的单一培养细胞相比，NM 上共培养的 NIH3T3 和 MLE-12 细胞显示出稳定的生长速率。

图 1:在基于支架的两层系统中展示 NIH3T3 成纤维细胞和 MLE-12 上皮细胞共培养方法的示意图。 缩写:PVA = 聚乙烯醇;PCL = 聚（ε-己内酯）。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 2:PVA 和 PCL 纳米纤维的结构。 （A） PVA 和 （B） PCL 纳米纤维膜是通过静电纺丝生产的。纳米纤维的结构和直径通过膜表面的 SEM 测量。比例尺 = 1 μm （A），10 μm （B）。缩写:PVA = 聚乙烯醇;PCL = 聚（ε-己内酯）。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 3:在共培养系统中，NIH3T3 细胞在 PCL 纳米纤维膜上和 MLE-12 细胞在 PVA 纳米纤维膜上的空间分布。 NIH3T3 细胞 （4 × 10⁵） 用 Cell-Tracker Green 染色，MLE-12 细胞 （3 × 10⁵） 用 Cell-Tracker Red 染色。将接种的细胞培养 24 小时，并使用共聚焦显微镜的 Z 堆叠图像进行观察。数字以 μm 表示;箭头显示 X （宽度）、Y （长度）、Z （深度） 的尺寸。缩写:PVA = 聚乙烯醇;PCL = 聚（ε-己内酯）。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 4:NIH3T3 细胞在 PCL 纳米纤维膜上和 MLE-12 细胞在 PVA 纳米纤维膜上的粘附和形态。 将细胞在膜上培养 24 小时，并使用 SEM 以 2,000 倍放大倍率观察。比例尺 = 15 μm。缩写:PVA = 聚乙烯醇;PCL = 聚（ε-己内酯）。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 5:PCL 纳米纤维膜上 NIH3T3 细胞和 PVA 纳米纤维膜上 MLE-12 细胞中的肌动蛋白应力纤维。 NIH3T3 细胞 （4 × 10⁵） 和 MLE-12 细胞 （3 × 10⁵ 细胞） 分别接种在 PCL 和 PVA 纳米纤维膜上。培养 48 小时后，用鬼笔环肽-iFlour 488 对细胞进行染色，并使用共聚焦显微镜观察。比例尺 = 50 μm。缩写:PVA = 聚乙烯醇;PCL = 聚（ε-己内酯）;FITC = 异硫氰酸荧光素。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 6:共培养的 MLE-12 细胞在 PVA 纳米纤维膜上的生长模式。 （A） 将 Cell-Tracker 红色染色的 MLE-12 细胞（3 × 10、⁵ 个细胞）接种在 PVA 纳米纤维膜上，单独培养（-NIH3T3 细胞）并与 NIH3T3 细胞在两层系统（+NIH3T3 细胞）中培养 48 小时。（B） 用 Hoechst 33342（蓝色）和鬼笔环肽-iFlour 488 染色 48 小时的单培养和共培养 MLE-12 细胞，并使用共聚焦显微镜观察。3D 图像使用 Imaris 软件的表面功能显示。（C） MLE-12 细胞培养 48 小时，并用鬼笔环肽-iFlour 488 和抗 ZO-1 抗体（红色）荧光标记。比例尺 = 50 μm。缩写:PVA = 聚乙烯醇。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 7:两层共培养系统中细胞的生长速率。 将NIH3T3细胞（4×10⁵）和MLE-12细胞（3×10⁵）共培养指定时间。使用 CCK-8 测定法测量插入片段和底部孔中的细胞生长。数据以 SD ±平均值表示 （n = 3）。 请单击此处查看此图的较大版本。

讨论

从 2D 培养模型到 3D 培养模型的过渡代表了开发 体外 共培养模型的重大进步。3D 培养模型必须模拟细胞可以增殖、聚集和分化的组织微环境²²。使用基于支架的 3D 共培养模型增强了组织结构的复制。在本研究中，基于 NM 的 trans-well 系统提供了两种细胞的间接 3D 共培养。下腔中具有大孔的 PCL NM 允许细胞浸润并模拟间质基质。该支架支持成纤维细胞的生长和空间组织。在上腔室中使用 PVA 纳米纤维膜可以在该层中形成 MLE-12 上皮细胞。PVA 纳米纤维膜的直径和孔径使其成为支持上皮细胞粘附和生长的理想基质，上皮细胞模拟上皮组织中基底膜上的上皮细胞¹⁹。

纤连蛋白和层粘连蛋白等细胞粘附蛋白是 ECM 中的关键蛋白，它们将细胞与胶原纤维连接起来²³。上皮细胞通过其表面的整合素受体与层粘连蛋白相互作用¹⁸。接种在 PVA NMs 上的 MLE-12 细胞粘附在膜上并在膜上三维生长。然而，上皮细胞与多孔 PVA NM 的结合很低，导致聚集，因为它们缺乏与培养细胞相互作用的特异性生物基序。在我们的共培养系统中，NIH3T3 和 MLE-12 细胞之间不存在直接的细胞间接触，并且仅通过旁分泌信号传导进行通信。共培养的 NIH3T3 细胞的存在可以在整个培养过程中稳定 MLE-12 细胞与膜的附着。这种稳定可归因于成纤维细胞分泌的可溶性因子，包括胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白和各种生长因子²⁴。相比之下，在 PCL 纳米纤维支架中成纤维细胞和癌细胞直接共培养的肿瘤模型中，成纤维细胞通过基质重塑改变 ECM 的特性²⁵。

上皮细胞位于基底膜上，基底膜充当生长支持层和选择性渗透层。目前正在开发几种技术策略，包括类器官技术，以创建上皮组织的 3D 复杂模型²⁶。然而，类器官结构阻碍了常规测定法的使用²⁷。此外，用于实验数据收集的传统显微镜很复杂，因为类器官是在嵌入 3D 水凝胶基质中时培养的²⁷。在这项研究中，插入室与低室分开，以便于精确观察在 PVA NM 上培养的上皮细胞。此外，3D 类器官是通过干细胞分化产生的。因此，与共培养系统相比，培养干细胞需要很长时间并且是一个复杂的过程，并且据报道类器官的异质性²⁸。

与单一培养相比，上皮细胞和成纤维细胞的共培养提高了对支架的粘附，并维持了培养的上皮细胞的稳定生长和功能。此外，由于共培养成纤维细胞分泌的可溶性因子，培养基中不需要补充材料，包括生长因子和细胞因子。尽管在细胞共培养中使用纳米纤维支架通过提供结构支持具有优势，但与生物相容性水凝胶相比，它们无法在培养细胞周围提供 ECM²⁹。因此，可以使用具有多层水凝胶的 NM 上的细胞来实现这种限制。

总之，用于同时培养成纤维细胞和上皮细胞的简单插入共培养系统在各种生理和药理学环境中至关重要，包括上皮组织再生、肿瘤微环境、毒性测定和药物活性测试。将对基于纳米纤维膜的 3D 共培养系统进行仪器化，并设计用于高通量药物吸收和运输筛选研究。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.05% 胰蛋白酶/EDTA	Welgene	LS015-01
100x 青霉素/链霉素	Gibco	10378016
20x PBS	LPS 溶液	CBP007A
4% 多聚甲醛	Biosang	PC2031-050-00
Alexa Fluor-594 偶联的 ZO-1 抗体	Invitrogen	339194
抗体稀释剂OP Quanto	Epredia	10129-576
CCK-8 检测试剂盒	Donginbio	CCK-3000
细胞培养皿 （150x20）	SPL	20151
CellTracker 绿色 CMFDA	Invitrogen	C7025
CellTracker 红色 CMTPX	Invitrogen	C34552
氯仿	Samchun	C0584
锥形管	SPL	50050
盖玻片	康宁	CLS2980245
DMEM 高葡萄糖	Welgene	LM001-05
DMEM/F12	Welgene	LM 002-05
DURAN 干燥器底座，带平面法兰，螺纹	DWK Life Sciences	7.022 260
DURAN 玻璃干燥器盖 &旋塞阀	Daihan Science	SM.2444061
DURAN 旋塞阀，带 PTFE 转子	DWK Life Sciences
静电纺丝机	NanoNC	ESR200RD
乙醇，纯	Sigma Aldrich	459844
FBS	Sigma Aldrich	TMS-013-BKR
荧光激光共聚焦扫描仪模块 K1-fluo	Nanoscope Systems
Gel/mount	Biomeda Corp.	M01
戊二醛溶液	Sigma Aldrich	340855
Hoechst 33342	Invitrogen	H1399
金属喷嘴 27G	NanoNC
指甲油	Nature republic
普通山羊血清	Vector Laboratories	S-1000
四氧化锇	Sigma Aldrich	201030
鬼笔环肽-iFlour 488	abcam	ab176753
塑料Syringe_Lure锁 （10 mL）	HENKE SASS WOLF	AL10
聚（丙烯酸）	Sigma Aldrich	323667
聚（乙烯醇）	Sigma Aldrich	341584
聚己内酯	Sigma Aldrich	440744
纯HCL	Duksan	1129
扫描电子显微镜	SEC	SNE-4500M
载玻片	Marienfeld Superior	K15663717
Sylgard 184 套装	能	OMNI.05255
Synergy H1 多功能阅读器	Biotek
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100