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方法文章

利用纳米纤维膜建立上皮细胞三维共培养模块

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DOI：

10.3791/67780

⸱

2024年12月27日

 ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, School of Medicine, Ajou University, 2Department of Medical Sciences, The Graduate School, Ajou University, 33D Immune System Imaging Core Center, Ajou University

本文内容

摘要

在此，我们展示了在基于纳米纤维膜的双层系统中与成纤维细胞共培养的上皮细胞能够稳定地黏附于膜上并生长。

摘要

上皮细胞培养中的技术难题包括去分化和功能丧失。仿生三维（3D）细胞培养方法可提高细胞培养效率。本研究介绍了一种先进的双层培养系统，旨在将上皮细胞培养为类似组织的层状结构，同时在三维环境中培养成纤维细胞。通过静电纺丝技术制备聚乙烯醇（PVA）和聚（ε-己内酯）（PCL）纳米纤维膜（NMs），并分别用作上皮细胞和成纤维细胞培养的生理相关细胞外基质。在上层插入式小室中，肺上皮细胞培养于PVA纳米纤维膜上；在下层培养室中，成纤维细胞培养于PCL纳米纤维膜上。该构型避免了细胞间的直接接触，有利于研究由可溶性因子介导的旁分泌信号。采用共聚焦显微镜分析细胞分布、生长模式以及细胞内蛋白（包括上皮细胞中的闭合蛋白ZO-1）的表达。Z轴层扫技术实现了详细的三维重建，精确揭示了紧密连接的完整性及上皮层内的空间组织结构。扫描电子显微镜（SEM）用于评估细胞在纳米纤维膜上的形态特征。SEM图像显示了复杂的细胞表面结构及其与纳米纤维的相互作用，全面展示了细胞架构以及细胞与纳米纤维结构之间的相互关系。细胞计数试剂盒-8（CCK-8）检测是一种随时间测量上皮细胞和成纤维细胞生长速率的简便方法，可用于评估这些细胞共培养时的增殖行为及其潜在的协同效应。这些结果凸显了一种简单插入式共培养系统在同时培养成纤维细胞和上皮细胞方面的有效性，这在多种生理和药理学背景下具有重要意义，包括上皮组织再生、包含内皮细胞、免疫细胞及其他基质细胞的肿瘤微环境、毒性检测以及药物活性测试。

引言

几十年来，经典的二维（2D）单层培养体系对于理解感染、药理学和毒理学至关重要1,2然而，必须考虑到组织微环境的复杂性、多组分之间的动态相互作用以及三维（3D）结构。因此，二维细胞培养在模拟组织样结构方面存在局限性。3,4例如，缺乏细胞与细胞之间以及细胞与细胞外基质（ECM）之间的信号传导，这 在体内微环境中，对细胞分化、增殖及细胞功能至关重要。基于这些原因，已开发出三维细胞培养系统5在三维培养中，细胞在三个维度上生长并与周围的细胞外基质相互作用。此外，已开发出由多种细胞类型组成的三维共培养方法，以弥补单一细胞类型培养过于简化的不足。 体外 模型以及发生的动态细胞相互作用 体内63D 共培养系统在细胞间通讯和细胞-细胞外基质（ECM）相互作用研究中日益受到关注7,8,9,10现有的3D共培养系统有多种形式，可分为直接共培养和间接共培养8,9在直接共培养中，培养细胞的多种细胞功能主要受细胞间直接接触的影响，而非旁分泌效应。相比之下，间接共培养通过使用屏障或分隔层将不同细胞类型分离，在研究旁分泌相互作用方面具有更大优势。

利用生物相容性和可生物降解的材料，采用多种材料与方法制备模拟细胞外基质（ECM）的仿生支架10。纳米纤维支架结构模拟了生物组织中天然ECM的构型，为细胞培养提供了三维结构11,12。静电纺丝纳米纤维膜（NMs）已被用于不同类型细胞的直接和间接共培养13,14,15。

上皮细胞构成主要器官的物理屏障，而成纤维细胞则是介导细胞外基质（ECM）重塑并调控邻近上皮组织的主要间质细胞6,16,17。上皮细胞和成纤维细胞分别通过细胞表面的整合素受体与基底膜中的层粘连蛋白（laminin）和间质基质中的纤连蛋白（fibronectin）相互作用18。当上皮细胞培养在直径为150–250 nm并带有微孔的聚乙烯醇（PVA）纳米膜（NMs）上时，会形成多层结构，而非细胞聚集体或球状体，其生长模式与上皮组织中的细胞相似19。相比之下，直径为400–1,500 nm、微孔大小为10–50 µm的聚己内酯（PCL）纳米膜为培养的成纤维细胞提供了与间质基质相似的空间维度13,14。由于具有良好的生物相容性，PVA和PCL膜是组织工程中常用的聚合物材料20,21。

本研究介绍了一种利用多孔电纺纳米纤维膜（NMs）的先进双层培养系统，用于将上皮细胞培养成类似组织的层状结构，并在三维结构中培养成纤维细胞。该实验方案可分为五个关键阶段：纳米纤维制备、纤维交联后处理及质量评估、膜固定培养小室的制备、细胞接种与三维共培养，以及三维培养细胞的检测分析。

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方案

1. 制备水稳定的PVA纳米纤维

  1. 称取0.02 g聚丙烯酸（PAA）和1 g聚乙烯醇（PVA），加入含有磁力搅拌子的洁净玻璃瓶中。向瓶中加入7.8 mL蒸馏水，将瓶子置于加热搅拌器上，设定温度为84 °C、转速为500 rpm，搅拌12 h。
  2. 待瓶内溶液冷却至室温后，加入0.2 mL戊二醛（GA）。将瓶子重新置于搅拌器上，设定转速为500 rpm、时间为30 min、温度为室温。
  3. 使用5 mL注射器进行静电纺丝，将推杆与针筒分离，并清除针筒内部及推杆尖端的小块塑料碎屑。
  4. 用针头暂时阻塞液体流动，然后将PVA溶液倒入每个针筒中（每支体积为2.5–3 mL）。安装推杆后，移除针头。
    注意：溶液中可能存在气泡，请等待气泡完全消失，此过程需10–30 min。
  5. 安装新的27 G金属针头，并将其放入静电纺丝机中。
  6. 用铝箔紧密包裹收集器表面。
  7. 使注射器面板复位至初始位置。设置仪器参数如下：（每个泵）注射体积为2 mL，注射速率为6 µL/min，滚轮转速为100 rpm，针尖至收集器距离为14 cm。检查每个泵的液体流动情况。
  8. 以约12 kV的电势运行仪器。
  9. 确保纺丝过程中初始湿度为40–50%，结束时降至25–30%。当湿度降低时使用加湿器，并在静电纺丝前一天将盛有蒸馏水的培养皿放入仪器内部以提高湿度。
    注意：湿度是成功制备PVA纳米纤维的关键因素。
  10. 定期检查液体流动情况。若针头发生堵塞，暂时停止仪器运行。使用实验室擦拭纸清除液滴，并等待新液滴形成。若仍无法流动，则更换针头后继续运行仪器。
  11. PVA纳米纤维的制备过程约需6 h完成。静电纺丝结束后，将附有纤维膜的铝箔从收集器上取下，并将纳米纤维膜置于真空干燥器中用干燥剂保存。

2. 聚乙烯醇（PVA）纳米纤维膜的盐酸（HCl）蒸气处理及纤维质量评估

注意：聚乙烯醇纳米膜（PVA NMs）在经过盐酸（HCl）蒸气后交联反应后，其水稳定性得以良好保持。该工艺已针对纳米膜的适宜厚度、孔径和粗糙度进行了优化。聚乙烯醇是一种高度亲水性的聚合物，电纺聚乙烯醇纳米纤维在接触水或潮湿环境时不稳定。因此，聚乙烯醇纳米膜应在聚乙烯醇聚合物制备完成后立即用 HCl 蒸气处理。

  1. 将纳米纤维膜切割成适用于跨孔插件的所需尺寸的小片。
  2. 准备一个含有1.5 mL纯HCl的小培养皿。将盛有HCl的培养皿和纳米纤维片放入真空室中，并关闭盖子。
    注意：HCl蒸气用作后交联剂，使纳米纤维具有水稳定性。
  3. 打开连接真空泵的阀门，等待10秒直至HCl烟雾上升，然后关闭阀门。用HCl烟雾处理膜2分钟。
  4. 经HCl蒸气处理后，在膜上滴加几滴去离子水（DW），将其置于玻璃载片上，并从箔片上取下膜。空气干燥20分钟后，膜会自然粘附在载片上。
  5. 使用自动溅射镀膜仪在碳导电胶带上对膜表面镀一层薄金。获取扫描电子显微镜（SEM）图像。
  6. 用HCl交联PVA纳米膜后，用1×PBS洗涤3次，并将膜浸泡于培养基中后检测pH值，以确认无残留HCl。

3. PCL 纳米纤维的制备及纳米纤维质量评估

  1. 称取1.5 g PCL，加入洁净的玻璃瓶中。向瓶中加入8.5 mL氯仿，将瓶子置于平板搅拌器上，在室温下搅拌12小时，使PCL完全溶解于氯仿中。
  2. 重复步骤1.3至1.9，但步骤1.7和1.8除外，将注射速率为8 µL/min，电压设为17.5 kV。
    注意：PCL制备过程约需3.5小时完成。
  3. 裁取一小块膜样品，通过自动溅射法镀膜5分钟，然后获取扫描电镜（SEM）图像。

在跨孔板中组装两层膜

注意：在本方案中，我们使用24孔板及其相应的插入孔。PVA纳米膜固定在插入孔上，而PCL纳米膜固定在底孔底部。

  1. 将纳米纤维膜切割成圆形片状，PVA 纳米纤维膜（NM）直径为 10 mm，PCL 纳米纤维膜直径为 13 mm。
  2. 使用聚二甲基硅氧烷（PDMS）Sylgard 184 作为粘合剂，将膜固定在插件和培养室孔底部。使用前，在塑料杯中按 10:1 的质量比混合 Sylgard 184 基液（A 组分）与固化剂（B 组分）。用干净的载玻片剧烈搅拌 PDMS 溶液 2–3 分钟，直至整个混合物充满气泡。静置 10 分钟，待气泡形成并消失后再使用；同时将载玻片加热至 100 °C。
  3. 将 PDMS 涂布于载玻片上，将插件孔的底边轻轻浸入 PDMS 中。将插件孔倒置放在预热的载玻片加热器上，使 PDMS 固化（约 10–15 分钟）。用 200 µL 吸头仔细检查，确保 PDMS 不再发黏。
  4. 按照步骤 2.2 至 2.4 所述方法处理 PVA 纳米纤维膜片。
  5. 轻轻将插件孔压在 PVA 纳米纤维膜片上，使插件孔底部朝向膜片的纳米纤维面。在孔中央加入一滴蒸馏水，用镊子小心去除铝箔。将插件孔放入新的 24 孔板中，让膜自然干燥。
  6. 将 PCL 纳米纤维膜片固定在底部孔中时，务必先将 200 µL 吸头浸入 PDMS 混合液中，然后精确地点涂在四个角和中心位置。
  7. 将板置于载玻片加热器上，使 PDMS 固化 5–7 分钟，以确保组装质量。
  8. 将 PCL 纳米纤维膜片放入含 PDMS 的孔中，使膜片的纳米纤维面与 PDMS 相接触。用干净的小刷子轻轻按压膜片的铝箔面，以确保完全贴附。向孔中加入 0.2 mL 70% 乙醇，以便于去除铝箔。
  9. 在跨孔装置中，将插件和底部孔置于紫外光下过夜灭菌。
    注意：混合后的 PDMS 可在 -20 °C 下保存以供后续使用。注意：附有 PCL 纳米纤维膜的板可干燥保存，但使用前必须用 70% 乙醇润湿。
  10. 次日，分别向插件和底部孔中加入 200 µL 和 500 µL 的 1× 磷酸盐缓冲液（PBS），各清洗 3 次，每次 10 分钟。插件和底部孔即可使用。

5. 共培养模型的细胞接种与双层结构组装

注意：MLE-12 细胞在含 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素/链霉素抗生素的 1× Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）/F12 中培养。NIH3T3 细胞在含 10% FBS 和 1% 青霉素/链霉素抗生素的 1× 高糖 DMEM 中培养。

  1. 将细胞培养于150 mm培养皿中。当细胞融合度达到70–80%时，用10 mL 1× PBS洗涤细胞，并加入2 mL预热的0.05%胰蛋白酶/EDTA溶液，在37 °C下消化3 min。
  2. 轻轻敲击培养皿使细胞从底部脱落，然后每种细胞分别加入8 mL完全培养基以中和胰蛋白酶活性。将细胞悬液转移至50 mL离心管中，在400 × g 条件下离心5 min，弃去上清液。使用Cell-Tracker对细胞进行染色，以观察接种细胞在NM上的分布情况（详见第6节）。
  3. 将细胞沉淀重悬于5 mL完全DMEM/F12培养基中。计数细胞并调整浓度至6 × 106 MLE-12细胞/mL和8 × 105 NIH3T3细胞/mL。
    注意：完全DMEM/F12培养基用于MLE-12与NIH3T3细胞的共培养。
  4. 向底部小室中加入500 µL完全DMEM/F12培养基（无PCL的一侧）。将附着有PVA纳米纤维膜的插入式培养小室转移至trans-well装置中，并加入50 µL MLE-12细胞悬液。将细胞置于37 °C 、5% CO2条件下培养。
  5. 同时，向附着有PCL纳米纤维膜的底部小室中加入500 µL NIH3T3细胞悬液，并在37 °C和5% CO2条件下培养细胞。
  6. 2 h后，将含有MLE-12细胞的插入式小室与含有NIH3T3细胞的底部小室在trans-well装置中组装。此即构建完成以MLE-12细胞为上层、NIH3T3细胞为下层的共培养模型。将细胞在双层膜系统中共同培养至所需时间。

6. 细胞分布检测

  1. 在2 mL完全DMEM/F12培养基中配制5 µM的Cell-Tracker红色和绿色溶液。
  2. 消化后，将MLE-12细胞与预先配制的Cell-Tracker红色溶液混合，NIH3T3细胞与Cell-Tracker绿色溶液混合。在37 °C、5% CO2条件下孵育30分钟，以确保细胞标记充分。向样品中加入8 mL完全DMEM/F12培养基，并在400 × g下离心5分钟。
    注意：Cell-Tracker不会影响细胞活力和增殖，因此标记后的细胞可继续培养至融合。染色细胞的荧光强度可能在培养4-5天后有所减弱。
  3. 重复步骤5.3至5.6。
  4. 在共聚焦显微镜下观察时，将插入式小室从24孔板转移至12孔板。
    注意：此举可缩短物镜与细胞之间的距离，便于观察细胞形态。

7. 三维共培养细胞的共聚焦观察

注意：上皮细胞在聚乙烯醇纳米膜（PVA NM）上的贴附能力较成纤维细胞在聚己内酯纳米膜（PCL NM）上的贴附弱。使用移液器抽吸法手动弃去旧培养基，并沿孔壁轻柔加入新的培养基或溶液。染色过程中，应避免膜干燥。

注意：通过在聚乙烯醇（PVA）纳米纤维中包被层粘连蛋白或整合素结合基序的肽段，可改善细胞附着19。

  1. 将插入物转移至新的24孔板中。弃去旧的培养基，加入150 µL的4%多聚甲醛（PFA）溶液，在室温下孵育15分钟。
  2. 移除4% PFA溶液，用150 µL的1× PBS洗涤贴壁细胞。
  3. 进行封闭和通透处理：加入150 µL含5%正常山羊血清和0.2% Triton X-100的1× PBS稀释液，在室温下孵育30分钟。
  4. 将Alexa Fluor 594标记的抗zonula occludens抗体（1:400）和Phalloidin-iFluor 488（1:1,000）用抗体稀释液进行稀释。移除封闭液，每孔加入150 µL荧光染料溶液，在室温下孵育1小时。
    注意：抗体溶液的配制必须极为精确，因其将直接影响实验结果的质量。避免光照。
  5. 弃去抗体溶液，用150 µL的1× PBS洗涤细胞，持续10分钟。
  6. 加入150 µL用1× PBS稀释的Hoechst 33342（1:1,000），孵育10分钟；避免光照。
  7. 移除Hoechst 33342溶液，用150 µL的1× PBS洗涤贴壁细胞，持续10分钟。
  8. 准备干净的载玻片，加入适量水溶性封片胶。使用尖头镊子小心地将膜从周围边缘剥离。将膜放置在封片胶上，确保含有细胞的一面朝上。再加入适量封片胶，盖上盖玻片。用指甲油密封玻片，确保密封精确且完整。
  9. 使用以下成像参数在共聚焦显微镜下观察细胞：激光功率控制：405，强度10；激光功率控制：488，强度10；激光功率控制：561，强度10；探测器灵敏度：420LP（600值）；探测器灵敏度：525/50（700值）；探测器灵敏度：561LP（750值）。

8. 细胞在纳米纤维上黏附能力的检测

  1. 弃去旧培养基，用 150 µL 的 1× PBS 洗涤细胞。
  2. 加入 150 µL 用 1× PBS 稀释的 3% 戊二醛（GA），室温固定细胞 1 小时。
  3. 用 150 µL 的 1× PBS 洗涤细胞，每次 10 分钟。
  4. 加入 150 µL 用 1× PBS 稀释的 1% 四氧化锇（OsO4）进行二次固定，作用 1 小时。
    注意：OsO4 及其蒸气有害，必须在通风橱中操作。
  5. 弃去溶液，用 300 µL 的 1× PBS 洗涤细胞，每次 10 分钟，共洗涤两次。
  6. 依次使用 50%、70%、90%、95% 和 100% 的梯度乙醇进行脱水，每步 10 分钟。最后一步使用新鲜的 100% 乙醇重复脱水 10 分钟。
  7. 将细胞和膜完全空气干燥。使用尖头镊子将膜剥离，并用双面胶带将膜固定在样品台上。在扫描电镜（SEM）下以 2,000 倍放大倍数观察前，进行 5 分钟的离子溅射镀膜处理。

9. 细胞生长实验

注意：在本实验方案中，采用 CCK-8 检测法，按照试剂盒说明书定量检测细胞生长速率。

  1. 通过将9体积份预热的DMEM/F12与1体积份CCK-8试剂混合，制备CCK-8混合液。移除旧的培养基后，向含细胞的孔中加入150 µL CCK-8混合液。
  2. 将插入式培养插件转移至新的24孔板中，使其与含有细胞的底层孔分离。在37 °C、5% CO2条件下孵育细胞45分钟。
  3. 收集上清液并转移至1.5 mL离心管中。以1,800 × g离心3分钟。
  4. 取100 µL微量离心管中的上清液加入96孔板中。在450 nm处测定吸光度（OD）。

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结果

本方案概述了通过构建基于纳米纤维膜的双层模型（图1）共培养MLE-12肺上皮细胞和NIH3T3成纤维细胞的关键步骤。该模型适用于共培养细胞的活细胞成像、免疫组织化学以及终点定量分析。通过优化细胞密度和生长条件，也可用于其他类型的细胞。

扫描电镜显示，制备的聚乙烯醇（PVA）纳米纤维分布均匀，无珠状结构形成（图2A）。PVA纳米纤维的直径范围为150 nm至230 nm（180 ± 25 nm，均值±标准差（SD））。电纺聚己内酯（PCL）纳米纤维膜中的纳米纤维呈随机取向，结构类似胶原（图2B）。PCL纳米纤维膜中大多数纤维的直径介于300 nm至7 µm之间（3.8 ± 2.5 µm）。因此，PVA纳米纤维膜的孔径小于PCL纳米纤维膜。

接种前，MLE-12 细胞和 NIH3T3 细胞分别用 Cell-Tracker 红色和绿色染色，并在整个共培养过...

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讨论

从二维培养到三维培养模型的转变代表了在开发中的一项重大进步 体外 共培养模型。一种三维培养模型必须模拟细胞能够增殖、聚集和分化的组织微环境22基于支架的三维共培养模型可增强组织结构的复制。本研究中，基于纳米纤维膜（NM）的trans-well系统实现了两种细胞的间接三维共培养。下室的聚己内酯（PCL）纳米纤维膜具有较大的孔径，可允许细胞浸润，并模拟间质基质，支持成纤维细胞的生长与空间排列。上室采用聚乙烯醇（PVA）纳米纤维膜，有利于MLE-12上皮细胞形成单层结构。PVA纳米纤维膜的直径与孔径使其成为支持上皮细胞黏附与生长的理想基质，模拟了上皮组织中上皮细胞在基底膜上的生长状态。19.

纤连蛋白和层粘连蛋白等细胞黏附蛋白是细胞外基质（ECM）中的关键蛋白，可将细胞与胶原原纤维连接起来23。上皮细胞通过其表面的整合素受体与层粘连蛋白相互作用18。接种在聚乙烯醇（PVA）纳米膜上...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作获得了韩国卫生科技研发计划（Korea Health Technology R&韩国健康产业开发院（KHIDI）通过#38;D项目，由韩国保健福祉部资助 &韩国研究基金会（NRF）通过韩国政府（MSIT）资助的项目（2022R1A4A5032702）；韩国教育部资助的韩国基础科学研究所（国家研究设施与设备中心）基础科学研究中心能力建设计划项目（2019R1A6C1010003）；韩国卫生福利部（HR16C0001）资助项目

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.05% 胰蛋白酶/EDTAWelgeneLS015-01
100倍青霉素/链霉素Gibco10378016
20x PBSLPS 溶液CBP007A
4% 多聚甲醛BiosesangPC2031-050-00
Alexa Fluor-594 标记的 ZO-1 抗体Invitrogen339194
抗体稀释液 OP QuantoEpredia10129-576
CCK-8 检测试剂盒DonginbioCCK-3000
细胞培养皿（150×20）SPL20151
CellTracker Green CMFDAInvitrogenC7025
CellTracker Red CMTPXInvitrogenC34552
氯仿SamchunC0584
锥形管SPL50050
盖玻片康宁CLS2980245
DMEM高糖WelgeneLM001-05
DMEM/F12WelgeneLM 002-05
DURAN 平法兰螺纹干燥器底座DWK生命科学 7.022 260
DURAN 玻璃干燥器盖 &和止流夹Daihan ScienceSM.2444061
DURAN 旋塞阀，带聚四氟乙烯阀杆DWK生命科学 10322671
静电纺丝机NanoNCESR200RD
乙醇，纯品Sigma Aldrich459844
FBSSigma AldrichTMS-013-BKR 
荧光激光共聚焦扫描模块 K1-fluoNanoscope Systems
凝胶封固剂Biomeda 公司M01
戊二醛溶液Sigma Aldrich340855
Hoechst 33342InvitrogenH1399
27G 金属喷嘴NanoNC
指甲油自然共和国
正常山羊血清Vector LaboratoriesS-1000
四氧化锇Sigma Aldrich201030
鬼笔环肽-iFlour 488abcamab176753
塑料注射器_Lure接头锁（10 mL）HENKE SASS WOLFAL10
聚丙烯酸Sigma Aldrich323667
聚（乙烯醇）Sigma Aldrich341584
聚己内酯Sigma Aldrich440744
纯 HCl杜山1129
扫描电子显微镜凝胶过滤层析SNE-4500M
载玻片马里恩费尔德优质K15663717
Sylgard 184 固化剂全知OMNI.05255
Synergy H1 多功能酶标仪Biotek
Triton X-100Sigma AldrichX100

参考文献

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