利用纳米纤维膜建立上皮细胞三维共培养模块

摘要

在此，我们展示了在基于纳米纤维膜的双层系统中与成纤维细胞共培养的上皮细胞能够稳定地黏附于膜上并生长。

摘要

上皮细胞培养中的技术难题包括去分化和功能丧失。仿生三维（3D）细胞培养方法可提高细胞培养效率。本研究介绍了一种先进的双层培养系统，旨在将上皮细胞培养为类似组织的层状结构，同时在三维环境中培养成纤维细胞。通过静电纺丝技术制备聚乙烯醇（PVA）和聚（ε-己内酯）（PCL）纳米纤维膜（NMs），并分别用作上皮细胞和成纤维细胞培养的生理相关细胞外基质。在上层插入式小室中，肺上皮细胞培养于PVA纳米纤维膜上；在下层培养室中，成纤维细胞培养于PCL纳米纤维膜上。该构型避免了细胞间的直接接触，有利于研究由可溶性因子介导的旁分泌信号。采用共聚焦显微镜分析细胞分布、生长模式以及细胞内蛋白（包括上皮细胞中的闭合蛋白ZO-1）的表达。Z轴层扫技术实现了详细的三维重建，精确揭示了紧密连接的完整性及上皮层内的空间组织结构。扫描电子显微镜（SEM）用于评估细胞在纳米纤维膜上的形态特征。SEM图像显示了复杂的细胞表面结构及其与纳米纤维的相互作用，全面展示了细胞架构以及细胞与纳米纤维结构之间的相互关系。细胞计数试剂盒-8（CCK-8）检测是一种随时间测量上皮细胞和成纤维细胞生长速率的简便方法，可用于评估这些细胞共培养时的增殖行为及其潜在的协同效应。这些结果凸显了一种简单插入式共培养系统在同时培养成纤维细胞和上皮细胞方面的有效性，这在多种生理和药理学背景下具有重要意义，包括上皮组织再生、包含内皮细胞、免疫细胞及其他基质细胞的肿瘤微环境、毒性检测以及药物活性测试。

引言

几十年来，经典的二维（2D）单层培养体系对于理解感染、药理学和毒理学至关重要^1,2然而，必须考虑到组织微环境的复杂性、多组分之间的动态相互作用以及三维（3D）结构。因此，二维细胞培养在模拟组织样结构方面存在局限性。^3,4例如，缺乏细胞与细胞之间以及细胞与细胞外基质（ECM）之间的信号传导，这 在体内微环境中，对细胞分化、增殖及细胞功能至关重要。基于这些原因，已开发出三维细胞培养系统⁵在三维培养中，细胞在三个维度上生长并与周围的细胞外基质相互作用。此外，已开发出由多种细胞类型组成的三维共培养方法，以弥补单一细胞类型培养过于简化的不足。 体外 模型以及发生的动态细胞相互作用 体内⁶3D 共培养系统在细胞间通讯和细胞-细胞外基质（ECM）相互作用研究中日益受到关注^7,8,9,10现有的3D共培养系统有多种形式，可....

方案

1. 制备水稳定的PVA纳米纤维

1. 称取0.02 g聚丙烯酸（PAA）和1 g聚乙烯醇（PVA），加入含有磁力搅拌子的洁净玻璃瓶中。向瓶中加入7.8 mL蒸馏水，将瓶子置于加热搅拌器上，设定温度为84 °C、转速为500 rpm，搅拌12 h。
2. 待瓶内溶液冷却至室温后，加入0.2 mL戊二醛（GA）。将瓶子重新置于搅拌器上，设定转速为500 rpm、时间为30 min、温度为室温。
3. 使用5 mL注射器进行静电纺丝，将推杆与针筒分离，并清除针筒内部及推杆尖端的小块塑料碎屑。
4. 用针头暂时阻塞液体流动，然后将PVA溶液倒入每个针筒中（每支体积为2.5–3 mL）。安装推杆后，移除针头。
   注意：溶液中可能存在气泡，请等待气泡完全消失，此过程需10–30 min。
5. 安装新的27 G金属针头，并将其放入静电纺丝机中。
6. 用铝箔紧密包裹收集器表面。
7. 使注射器面板复位至初始位置。设置仪器参数如下：（每个泵）注射体积为2 mL，注射速率为6 µL/min，滚轮转速为100 rpm，针尖至收集器距离为14 cm。检查每个泵的液体流动情况。
8. 以约12 kV的电势运行仪器。
9. 确保纺丝过程中初始湿度为40–50%，结束时降至25–30%。当湿度降低时使用加湿器，并在静电纺丝前一天将盛有蒸馏水的培养皿放入仪器内部以提高湿度。

结果

本方案概述了通过构建基于纳米纤维膜的双层模型（图1）共培养MLE-12肺上皮细胞和NIH3T3成纤维细胞的关键步骤。该模型适用于共培养细胞的活细胞成像、免疫组织化学以及终点定量分析。通过优化细胞密度和生长条件，也可用于其他类型的细胞。

扫描电镜显示，制备的聚乙烯醇（PVA）纳米纤维分布均匀，无珠状结构形成（图2A）。PVA纳米纤维的直径范围为150 nm至230 nm（180 ± 25 nm，均值±标准差（SD））。电纺聚己内酯（PCL）纳米纤维膜中的纳米纤维呈随机取向，结构类似胶原（图2B）。PCL纳米纤维膜中大多数纤维的直径介于300 nm至7 µm之间（3.8 ± 2.5 µm）。因此，PVA纳米纤维膜的孔径小于PCL纳米纤维膜。

接种前，MLE-12 细胞和 NIH3T3 细胞分别用 Cell-Tracker 红色和绿色染色，并在整个共培养过.......

讨论

从二维培养到三维培养模型的转变代表了在开发中的一项重大进步 体外 共培养模型。一种三维培养模型必须模拟细胞能够增殖、聚集和分化的组织微环境²²基于支架的三维共培养模型可增强组织结构的复制。本研究中，基于纳米纤维膜（NM）的trans-well系统实现了两种细胞的间接三维共培养。下室的聚己内酯（PCL）纳米纤维膜具有较大的孔径，可允许细胞浸润，并模拟间质基质，支持成纤维细胞的生长与空间排列。上室采用聚乙烯醇（PVA）纳米纤维膜，有利于MLE-12上皮细胞形成单层结构。PVA纳米纤维膜的直径与孔径使其成为支持上皮细胞黏附与生长的理想基质，模拟了上皮组织中上皮细胞在基底膜上的生长状态。¹⁹.

纤连蛋白和层粘连蛋白等细胞黏附蛋白是细胞外基质（ECM）中的关键蛋白，可将细胞与胶原原纤维连接起来²³。上皮细胞通过其表面的整合素受体与层粘连蛋白相互作用¹⁸。接种在聚乙烯醇（PVA）纳米膜上.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.05% 胰蛋白酶/EDTA	Welgene	LS015-01
100倍青霉素/链霉素	Gibco	10378016
20x PBS	LPS 溶液	CBP007A
4% 多聚甲醛	Biosesang	PC2031-050-00
Alexa Fluor-594 标记的 ZO-1 抗体	Invitrogen	339194
抗体稀释液 OP Quanto	Epredia	10129-576
CCK-8 检测试剂盒	Donginbio	CCK-3000
细胞培养皿（150×20）	SPL	20151
CellTracker Green CMFDA	Invitrogen	C7025
CellTracker Red CMTPX	Invitrogen	C34552
氯仿	Samchun	C0584
锥形管	SPL	50050
盖玻片	康宁	CLS2980245
DMEM高糖	Welgene	LM001-05
DMEM/F12	Welgene	LM 002-05
DURAN 平法兰螺纹干燥器底座	DWK生命科学	7.022 260
DURAN 玻璃干燥器盖 &和止流夹	Daihan Science	SM.2444061
DURAN 旋塞阀，带聚四氟乙烯阀杆	DWK生命科学	10322671
静电纺丝机	NanoNC	ESR200RD
乙醇，纯品	Sigma Aldrich	459844
FBS	Sigma Aldrich	TMS-013-BKR
荧光激光共聚焦扫描模块 K1-fluo	Nanoscope Systems
凝胶封固剂	Biomeda 公司	M01
戊二醛溶液	Sigma Aldrich	340855
Hoechst 33342	Invitrogen	H1399
27G 金属喷嘴	NanoNC
指甲油	自然共和国
正常山羊血清	Vector Laboratories	S-1000
四氧化锇	Sigma Aldrich	201030
鬼笔环肽-iFlour 488	abcam	ab176753
塑料注射器_Lure接头锁（10 mL）	HENKE SASS WOLF	AL10
聚丙烯酸	Sigma Aldrich	323667
聚（乙烯醇）	Sigma Aldrich	341584
聚己内酯	Sigma Aldrich	440744
纯 HCl	杜山	1129
扫描电子显微镜	凝胶过滤层析	SNE-4500M
载玻片	马里恩费尔德优质	K15663717
Sylgard 184 固化剂	全知	OMNI.05255
Synergy H1 多功能酶标仪	Biotek
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100