一种简化的血管内穿孔法小鼠蛛网膜下腔出血模型手术操作

摘要

本文介绍了一种简化的内血管穿刺小鼠蛛网膜下腔出血模型手术操作，并结合神经功能评分进行评估。

摘要

血管内穿孔模型常被用于实验研究中模拟蛛网膜下腔出血（SAH）。尽管该模型具有全面性和可靠性，但其操作技术较为复杂。本方案在某些细节上对该模型进行了简化，并结合神经功能评分。我们采用尼龙缝合线环扎并牵拉颈总动脉（CCA），以暂时阻断血流，取代传统的结扎方法，从而提供清晰的手术视野。使用电凝笔闭合血管可降低出血风险。此外，我们采用带有黑色标记的丝线，便于确定穿刺深度。

黑色标记物无阻碍地通过颈总动脉（CCA）分叉为颈内动脉（ICA）的颈动脉分叉处，且仅受到微小阻力，表明丝线已成功到达大脑前动脉（ACA）与大脑中动脉（MCA）的颅内交汇处。这一现象表明丝线已准确定位于脑血管的关键汇合点。随后，将丝线略微向前推进以穿刺血管，可使小鼠的血管内穿刺操作更为简便，从而促进血管内穿刺模型在基因修饰小鼠中的应用。这对于分子生物学研究及药物研发具有重要意义。

引言

蛛网膜下腔出血（SAH）是一种严重的卒中亚型，具有较高的致残率和死亡率，尤其影响五十多岁的人群。自发性SAH主要由颅内动脉瘤破裂引起，动脉瘤多位于威尔氏环（circle of Willis）^1,2。临床上，患者常表现为雷击样头痛、神经功能障碍以及意识水平迅速下降³。尽管神经重症监护技术不断进步，仍有近40%的患者在出血后一个月内死亡⁴。动脉瘤性SAH后可出现多种继发性并发症，导致进行性神经功能恶化。然而，SAH的病理生理机制和临床特征目前仍不完全清楚。

因此，为了更好地理解其潜在机制并改进治疗策略，在小型动物中建立全面且可靠的模型是必不可少的。迄今为止，已有多种建立蛛网膜下腔出血（SAH）模型的方案被提出。例如，一种方法是将自体血液注入小脑延髓池。另一种改良方案则包括两次独立的注射，分别注入小脑延髓池和视交叉池。由于操作简便且死亡率较低，自体血液注射法已得到广泛应用^5,6。为了实现使用更小、更经济的实验动物的可能性，Barry 等人于1979年首次描述了大鼠SAH模型，该方法通过去除颅骨后使用钨微电极穿刺基底动脉来实现

方案

C57BL/6雄性小鼠（6-8周龄），无特定病原体，饲养于温度和适应条件受控的动物房中，维持12小时光照/12小时黑暗循环。小鼠可自由摄取标准啮齿类动物饲料和灭菌自来水。实验开始前给予2周的适应性饲养期。所有涉及动物的实验程序均经龙华医院动物伦理委员会批准，并依照中国国家科学技术委员会关于实验动物护理与使用的指南进行。

1. 动物准备

1. 将小鼠置于预热至 37 °C 的加热垫上，并在整个手术过程中维持该温度。
2. 通过吸入 2–2.5% 异氟烷对小鼠进行麻醉；手术期间以 0.4–0.6 L/min 的流速维持 1–1.5% 异氟烷。
3. 手术过程中，向双眼涂抹眼膏，以减轻眼部干燥。
4. 将小鼠置于手术台上，固定其头部，保持仰卧位，并用胶带固定四肢。

2. 蛛网膜下腔出血（SAH）诱导

1. 用手术刀片沿颈部前侧中线切开皮肤（图1A）。
2. 分离结缔组织，暴露左侧颈总动脉（CCA）及其分叉。
   注意：谨慎保护迷走神经及邻近腺体（图1B）。
3. 用6-0尼龙缝线环绕颈总动脉并留出两端不打结（

结果

神经功能评分
每组9只小鼠在术后24小时采用Sugawara等人报道的评分系统的改良方法¹¹进行评估，以评价蛛网膜下腔出血（SAH）。最高得分为18分。其中，假手术组的n = 9只动物均获得18分。SAH组的平均得分为11分（p < 0.0001）（图2）。

脑部的病理变化
在脑底部可见血凝块，并在 Willis 环处积聚，而假手术组未发现此类异常（图3）。

讨论

总之，本研究提出了一种通过血管内细丝插入诱导小鼠蛛网膜下腔出血（SAH）的简化且可靠的动物模型，提供了一种便捷而有效的研究方法。与现有的血管内穿孔模型相比，该方案在穿孔步骤上保持一致：将细丝经由颈外动脉（ECA）插入，经颈总动脉（CCA）推进，随后进入颈内动脉（ICA），并进一步前进以穿破大脑前动脉（ACA）。我们使用缝线牵拉颈总动脉以暂时阻断血流，而非结扎。与大鼠不同，小鼠的手术视野非常有限。采用牵拉方式替代结扎或使用动脉夹，可充分暴露手术区域。一方面，该方法能有效缩小颈部所需切口面积，从而减轻对小鼠的创伤；另一方面，它提供了清晰的手术视野，并节省了结扎所需的时间，使整体操作时间显著缩短。若血流阻断时间过长，可能导致脑缺血等并发症，同时穿刺部位出血也可能不足。另一个可能的问题是难以控制的出血。在此情况下，我们在拔出细丝后立即使用电凝笔直接封闭颈外动脉。

在本方法中，我们采用聚酰胺（PA）制成的细丝代替聚四氟乙烯（PTFE）导管进行穿孔。在操作过程中，若穿孔材料过软，则可能导致穿孔困难；若材料过于坚硬，则可能对血管造成损伤。我们所使用的细丝经过充分验证，其柔韧性和刚性达到最佳平衡。.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
C57BL/6 小鼠	上海杰思捷实验动物有限公司
电灼笔	卓悦天使医疗设备有限公司	GermanV50	适用于浅表性小型手术、组织凝固以及增生组织的烧灼。
异氟烷	RWD	R650-IE	异氟烷是一种吸入性全身麻醉剂，具有较小的血/气分配系数。用于动物麻醉时，可实现平稳、快速且舒适的麻醉诱导，恢复迅速，肌肉松弛效果良好，且对交感神经系统无兴奋作用。异氟烷在肝脏中的代谢率较低，因此对肝脏毒性小，即使重复使用也无明显不良反应。为避免麻醉废气对环境及实验人员造成不良影响，建议配合使用废气回收系统。
MACO 线栓	北京西农科技有限公司	1620-A2	主要用于体重为 20–25 g 的小鼠，缝线尖端熔化为半球形，无多聚赖氨酸或硅胶涂层，距尖端 9–10 mm 处有标记，已消毒，可直接使用。该型号有三种包装规格，建议在正式实验前进行预实验，以确定合适的型号。
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