方法文章

从原子力显微镜力图中提取天然小鼠肺基底膜的杨氏模量

DOI：

10.3791/67784

⸱

2025年1月31日

 ,  ,  , 
1Munich University of Applied Sciences, 2Center for Applied Tissue Engineering and Regenerative Medicine - CANTER, Munich University of Applied Sciences, 3Experimental and Clinical Pharmacology and Toxicology, Medical Faculty, University of Freiburg, 4Department of Obstetrics and Gynecology, Medical Center, University of Freiburg

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

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本实验方案演示了如何制备小鼠肺组织的冷冻切片，进行原子力显微镜力图实验，并分析数据以测定天然小鼠肺基底膜的杨氏模量。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

原子力显微镜（AFM）能够以数十纳米的空间分辨率对样品的力学特性进行表征。由于哺乳动物细胞能够感知并响应其直接微环境的力学特性，因此以高空间分辨率表征组织的生物力学特性对于理解多种发育、稳态及病理过程至关重要。基底膜（BM）是一种厚度约为100–400 nm的细胞外基质（ECM）亚结构，在肿瘤进展和转移形成中发挥重要作用。尽管测定如此薄的ECM亚结构的杨氏模量具有挑战性，但BM的生物力学数据为理解BM如何影响细胞行为提供了全新的基础性见解，同时也具有重要的诊断潜力。本文展示了一种用于评估小鼠肺组织中基底膜力学性能的可视化实验方案，肺是易发生转移的主要器官之一。我们描述了一种高效的工作流程，用于测定位于肺组织内皮细胞层与上皮细胞层之间的基底膜的杨氏模量。该逐步操作流程包括小鼠肺组织的冷冻、冷冻切片以及在组织切片上进行AFM力图采集。此外，我们提供了一种使用CANTER处理工具箱的半自动数据分析方法，该工具箱是我们实验室自主开发的用户友好型AFM数据分析软件。该工具可实现记录的力图的自动加载、将力-压电伸长曲线转换为力-压痕曲线、计算杨氏模量，并生成杨氏模量分布图。最后，本文展示了如何通过空间滤波工具确定并提取源自肺部基底膜的杨氏模量数值。

引言

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原子力显微镜（AFM）力图谱已成为一种广泛应用的技术，可用于测定多种生物样品的纳米力学特性，其空间分辨率达纳米级，力灵敏度达皮牛顿级1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12。P. Hansma 及其同事率先开展了在生理条件下将 AFM 测量应用于生物样品的研究13,14,15,16,17,18,19,20。随后，AFM 力测量被用于评估单个分子21、活细胞及其细胞骨架9,10,22,23,24,25,26、组织及组织切片6,8,11,27,28,29,30,31，以及生物水凝胶3,4,32的力学性质。在我们的研究中，我们使用 AFM 检测了生物和化学键的力学特性18,33,34,35,36,37，以及单个细胞的纳米力学特征38,39,40。此外，对生长板软骨的测量8表明，细胞外基质（ECM）的胶原结构和杨氏模量可引导软骨细胞分裂，从而决定小鼠胚胎发育过程中生长板的生长方向。进一步地，我们研究了关节软骨中与软骨退变和骨关节炎相关的变化2,41,42,43,44,45,46,47。

近年来，大量原子力显微镜（AFM）研究已对健康与病变肺组织的力学特性进行了考察48,49,50,51,52。然而，这些研究主要关注整体组织的力学性能，而非特定组织成分（如基底膜（BM））。BM 是一种特化的细胞外基质（ECM）结构，构成一层薄层（在人类中为 100 nm - 400 nm），覆盖大多数哺乳动物器官和组织结构，例如神经元、肌肉、脂肪组织和血管。我们发现，小鼠肺部 BM 的力学特性在转移灶形成过程中起着关键作用，其中较柔软的 BM 与乳腺癌和肾癌患者的较高生存概率相关53。此外，该研究揭示，分泌型细胞外基质蛋白 netrin-4 通过与层粘连蛋白 γ1（laminin γ1）发生化学计量比为 1:1 的相互作用，降低 BM 的杨氏模量；而 laminin γ1 是几乎所有 BM 内层粘连蛋白网络中的关键组分40。

在此，我们展示了所开发的用于测定杨氏模量（Young's modulus）的实验方案的可视化流程E骨髓) 小鼠肺部基底膜（BM）的厚度为100–200 nm。BM的杨氏模量是衡量其刚度的指标，定义为线性弹性变形过程中应力（单位面积上的力）与相应轴向应变（位移）的比值。54，此处指AFM探针压入导致的基质微小压缩。在AFM实验中，可通过AFM悬臂的偏转量和悬臂位置获得作用力与位移（压入深度），并利用合适的弹性模型（本例中为修正的赫兹模型）对所得的力-压入深度曲线进行分析，从而提取杨氏模量（应力-应变关系）。55）。主要步骤如图所示 图1首先，本方案详细阐述了小鼠肺组织样本的制备及在OCT包埋剂中的包埋方法（见步骤1），以利于后续进行冷冻切片（步骤2），从而通过原子力显微镜（AFM）力图谱测定基底膜（BM）的刚度。本文所介绍的冷冻切片技术采用单面胶带和双面胶带，可在无需固定且切片不融化的情况下完成肺组织切片。第三部分详细说明了用于采集评估BM刚度所需数据的AFM操作流程。在方案的下一部分中，我们解释了如何利用自主开发的基于MATLAB的软件——CANTER Processing Toolbox，对获得的力体积数据进行自动分析（步骤4.1）。56在此步骤中，通过拟合修正的赫兹模型，从每条记录的力-压痕曲线中提取杨氏模量，该模型已针对压头几何形状（本例中为四棱锥）进行了校正。55最后，我们在步骤4.2和4.3中描述如何应用空间滤波工具和R2 开发的工具箱中的过滤工具，用于从力图中获取的包含肺泡壁所有组织区室的全面杨氏模量值集合中，提取出特异性对应于基底膜（BM）的杨氏模量值。

方案

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所有动物样本处理程序均经丹麦环境与食品部动物实验委员会批准（许可编号 2017-15-0201-01265），符合丹麦动物福利法。为演示本方案，我们使用了一只13周龄的雄性C57BL/6小鼠。

警告：在以下实验方案中，多个步骤涉及组织样本的操作。处理生物样本时，务必佩戴适当的手套和实验服。

1. 样品制备

  1. 将新鲜收获的小鼠肺组织放入一次性 15 x 15 x 5 mm 基模中。使用带有 0.9 mm 针头的 10 mL 注射器，同时缓慢撤出针头，向样品中小心注入体积比为 1:1 的最佳切割温度（OCT）包埋剂与磷酸盐缓冲液（PBS）混合溶液。在室温下操作，并用小型手术镊子牢固夹持样品。当样品明显肿胀并出现明显渗出时，表明注射完成。
  2. 向模具中加入纯 OCT 包埋剂，直至完全浸没组织样本。为确保整个肺组织完全冻结，将样本在 -80 °C 条件下保存至少 4 小时。
    注意：此时样本可在 -80 °C 下保存至少 2 年。根据 OCT 包埋剂制造商的说明，包埋组织的最长保存时间超过 10 年。通常建议将需保存超过 4 个月的样本用透明薄膜包裹，以防止水分渗入样本。

2. 包埋肺组织样本的冷冻切片

  1. 将冷冻切片机腔室的温度调节至 -17 °C，这是肺组织样本的最佳切片温度。如果设备具备该功能，将切片台单元的温度设为 -22 °C。这有助于在整个切片过程中确保样本表面维持最佳切片温度。
  2. 准备 40 张载玻片，使用双面胶带小心地将其置于载玻片中央，然后用 15 mL 离心管在胶带上滚动，以确保胶带牢固且无气泡地粘附。确保双面胶带的长度大致等于含有样本的 OCT 包埋块的宽度。带有磨砂边缘的载玻片可用铅笔标记样本信息和切片编号。
  3. 将准备好的载玻片插入载玻片盒中，随后将装有载玻片的盒子放入冷冻切片机腔室内进行预冷。
    注意：预冷载玻片可防止在拾取切片时发生冻融循环，从而避免影响样本的机械性能。
  4. 准备多条单面胶带，每条胶带的尺寸大致与冷冻样本块相同。
  5. 在样本夹持器的内侧两个环中填充 OCT 包埋剂。将样本置于样本夹持器上的 OCT 包埋剂中，并尽可能使其保持水平。随后，将样本夹持器在冷冻切片机腔室内放置约 10 分钟，直至 OCT 包埋剂完全凝固，样本牢固固定于夹持器上。
  6. 将带有样本的夹持器安装到冷冻切片机的切片台单元上。根据设备的用户手册，调节冷冻切片机的所有关键部件，如切片台的倾斜角度和刀片的位置，以建立一个与 OCT 包埋块表面平行的切削平面。
  7. 通过将切片厚度调整为 50 µm 进行初步修片，并开始切片，直至达到样本中所需的取片位置（通常为肺组织样本表面下约 500 µm 处），以收集组织切片。随后将冷冻切片机的切片厚度调整为 15 µm，即所需组织切片的厚度。
    警告：使用冷冻切片机等切割工具时必须格外小心。为确保人身安全，请遵循制造商的安全指南，并使手指远离刀片。
  8. 用拇指对单面胶带施加适当压力，将其粘附到样本上。操作前，先将拇指在冷冻切片机腔室壁上接触数秒以冷却拇指。
    注意：胶带必须牢固地贴附于样本上，否则在切片过程中胶带可能从组织上脱落。
  9. 使用冷冻切片机切出厚度为 15 µm 的组织切片。使用刷子引导切片，并防止在切割过程中胶带从样本上脱落。为获得平整的组织切片表面，切割速度必须缓慢且均匀。
  10. 上一步产生的切片现平铺于刀块上，胶带面朝上。从载玻片盒中取出一张预冷的、带有双面胶带的载玻片，将其牢固地压在切片上以拾取切片。然后将已承载切片的载玻片放回载玻片盒中。
    注意：在操作载玻片和切片时，必须始终将其保留在冷冻切片机腔室内，以防止切片在切片过程中融化。
  11. 重复上述三个步骤，直至收集到所需数量的切片，即 40 张。
  12. 完成后，盖上载玻片盒的盖子，并将其置于干冰上转移至 -20 °C 冰箱中保存。最后，清理冷冻切片机，对所有使用过的物品进行消毒，并开启冷冻切片机腔室内的紫外灯。
    注意：本实验方案可在此处暂停。将样本在 -20 °C 下保存，直至进行原子力显微镜（AFM）测量。建议切片和 OCT 包埋剂的保存时间不超过 6 周。超过此期限后，由于其较大的表面积和吸湿倾向，切片和 OCT 包埋剂可能出现类似冻伤的改变。

3. 肺组织切片的原子力显微镜力图

注意：本实验方案中，使用 JPK NanoWizard 4XP（原子力显微镜，AFM）与布鲁克（Bruker）的电动载物台联用，并结合徕卡（Leica）DMi8 倒置光学显微镜，以记录肺组织切片的力-位移曲线。

  1. 设置原子力显微镜
    1. 打开原子力显微镜（AFM）系统的所有必要设备（例如计算机、AFM控制器、隔振台、光学显微镜等）。
    2. 启动AFM控制软件。在 选择实验 概述，选择 QI 高级成像 模式。此外，指定实验数据和校准文件的存储位置。
      注意：如果您不具备以下条件 QI 高级成像 延伸，使用 接触模式力映射 作为替代选项的模式。
    3. 选择适合所观察样品类型的合适弹性系数的悬臂梁。对于柔软的肺组织样品，推荐使用布鲁克（Bruker）的 MLCT 悬臂梁 F，其带有锥形探针，标称弹性系数为 0.6 N/m。若芯片上包含多个悬臂梁（如 MLCT 芯片），需在体视显微镜下使用镊子移除芯片上其他较长的悬臂梁，以确保仅用于测量的悬臂梁与样品接触。
      注意：除用于测量的悬臂外，其他与样品接触的悬臂可能导致实验过程中样品发生不期望的移动，甚至导致样品从下方胶带上脱落。
      警告：在当前及后续步骤中，避免使用镊子接触用于测量的悬臂。
    4. 将芯片安装到悬臂支架上。将支架插入原子力显微镜（AFM）探头中。将AFM探头置于倒置光学显微镜的样品台上方。按照用户手册中的说明对准光学杠杆光路。当激光束首先位于测量用悬臂的前端，且反射后的激光束击中分段式光电二极管的中心时，即完成光学杠杆光路的正确对准。
  2. 使用热噪声法进行悬臂梁校准57
    ​注意：悬臂梁的校准包括确定其倒置光杠杆灵敏度（InvOLS）和弹簧常数。由于厂家提供的悬臂梁标称弹簧常数通常仅为粗略近似值，因此对每个使用的悬臂梁进行单独校准是必要的。在通过记录力曲线来测定样品机械性能的实验中（例如本方案所述实验），必须在刚性基底上采用基于接触的方法直接测定InvOLS。其他确定InvOLS的方法（例如根据悬臂梁几何形状推导）仅能提供粗略估计，不适用于此处所述类型的应用。此外，若使用供应商已提供精确弹簧常数的悬臂梁，则可通过Schiller等人描述的方法测定InvOLS。58.
    1. 将显微镜载玻片放置在原子力显微镜（AFM）的样品台上。显微镜载玻片作为刚性基底，用于基于接触法测定InvOLS。
    2. 将原子力显微镜（AFM）探头放置于样品台上后，利用步进电机降低探头，直至悬臂架与显微镜载玻片之间的剩余间隙约为1–2 mm。使用带长针头（0.9 mm × 70 mm）的1 mL注射器，将PBS施加至悬臂架侧面，使其流下并在悬臂架与显微镜载玻片之间的间隙中形成液体弯月面。
      注意：用于样品力体积测量的液体（如缓冲液或培养基）也必须用于校准过程。
    3. 要在软件中执行基于接触的校准，请导航至 获取数据 页并选择 高级视图 选项。访问 校准管理器 通过位于右上角的汉堡菜单按钮。在此界面中，选择 基于接触的 作为 方法 并选择 MLCT F 从下拉菜单中选择悬臂梁作为悬臂梁名称。此外，设置 设定点 至 1 V 且 扫描次数 至10，填入相应的输入字段中。
    4. 在 获取数据 页面左侧控制面板中，为自动逼近程序输入1 V的设定值。点击 蓝色向下箭头 用户界面左上角的按钮以启动自动接近程序。当接近过程完成且悬臂与显微镜载玻片接触后，点击 校准 按钮在 校准管理器 window..
      注意：通过记录10条力曲线以及热噪声功率谱密度（PSD），系统将自动确定InvOLS和悬臂梁的弹簧常数，其中弹簧常数采用热噪声法通过PSD数据计算得出57自动校准程序完成后，需目视检查拟合曲线是否准确描述了悬臂梁记录的功率谱密度（PSD）中的正常振动模式（第一峰），并确认所测定的弹簧常数与悬臂梁制造商提供的标称弹簧常数在同一数量级。若不符合此情况，则必须手动调整拟合范围，以确保拟合结果收敛并准确反映热功率谱中的第一峰。
    5. 校准完成后，关闭 校准管理器 窗口。关闭后 校准管理器在预选目录中生成一个校准文件（*.tnd ASCII 文件）（参见步骤 3.1.2），该文件包含已确定的校准结果，后续数据分析时需要使用。请记录校准值，以备数据分析过程中参考，例如记录在实验记录本中。
      警告：从这一步开始，切勿改变激光在悬臂上的位置、调节原子力显微镜（AFM）探头中的反射镜，或移动悬臂夹持器。更改这些部件将影响反向光学杠杆灵敏度（InvOLS），导致校准值失效。为补偿热漂移，请调节AFM探头中分段式光电二极管的位置。
  3. 分析肺切片中的肺泡壁
    1. 从冰箱中取出待评估的标本切片，室温下解冻约1分钟，直至整个OCT包埋介质变得透明。随后，在肺组织切片上滴加数滴PBS以重新水化组织。
    2. 将载有肺组织切片的显微镜载玻片放置于样品台上。将原子力显微镜（AFM）探头重新安装至样品台，并降低探头，使悬臂位于样品上方约1毫米处。使用1 mL注射器配合0.9 mm × 70 mm针头，向悬臂支架侧面加入适量磷酸盐缓冲液（PBS），直至组织切片与悬臂支架之间形成液桥。
    3. 导航至 设置管理器 通过点击 带扳手图标的按钮 用户界面的右上角。在 设置管理器，调整以下常规设置。在 方法设置 切片，设定 目标高度 至 4 µm。然后，在 电流模式设置 切片，继续进行 高级反馈设置 并设置 倍增器 1。最后，在 力设置 子部分，同样位于 电流模式设置 切片，选择该选项 撤回的压电效应 从 结束时的模式 下拉菜单
    4. 使用倒置光学显微镜识别并定位至完整的肺泡壁。在明场图像中，完整的肺泡壁表现为边缘清晰且平滑的暗色结构。（参见 图2A-B).
      注意：在可用的情况下，将明场图像导入原子力显微镜（AFM）控制软件，有助于将悬臂引导至特定的肺泡壁，并在其上方精确获取力图或定量成像（QI）图。在JPK SPM软件中，此功能称为 直接覆盖.
    5. 根据所使用的原子力显微镜（AFM）、探针悬臂及观察样品，在左侧控制面板中设置力-压痕曲线的参数。对于布鲁克（Bruker）的NanoWizard 4XP仪器和MLCT Cantilever F探针，我们推荐以下参数： 设定点 = 5 nN z 轴长度 = 8 µm z轴速度 = 300 µm/s
      注意：推荐的Z轴长度为8 µm，该值相对较大，这是由于肺组织的特性所致。鉴于肺组织通常较为柔软，即使在5 nN这一相对较低的设定点下，压痕深度在某些位置仍可达到4 µm。为了确保针尖未接触样品的基线部分在力-压痕曲线中至少占约一半，建议将曲线总长度设为8 µm，这将显著简化后续的曲线分析。对于其他生物原子力显微镜（bio-AFM），这些参数同样适用，尽管不同制造商对某些参数（如决定最大压痕力的设定点）的命名可能有所不同。若原子力显微镜系统无法达到此处给出的高垂直速度，则需根据仪器制造商的建议降低Z轴速度。
      警告：为了确保结果的可比性，所有实验中必须采用相同的 z 轴接近速度。
    6. 设定初始概览力图的位置和大小，确保其覆盖整个肺泡壁，从一侧气道延伸至另一侧。对于小鼠肺组织样本，通常选择 20 µm × 20 µm 至 30 µm × 30 µm 的范围即可。无论力图的具体尺寸如何，均将像素数量（对应记录的力曲线数量）设置为 50 × 50。这将为每张力图生成 2,500 条力-压痕曲线，从而在力图的斜率通道中提供识别基底膜（BM）所需的分辨率。（参见 图 2C- D).
    7. 记录概览图后，检查力图的高度和斜率通道。如果高度通道显示肺泡壁完整（参见 图 2D）以及是否可以在坡道通道中将基底膜（BM）区分为一条清晰明亮的线条（参见 图2C，E位于上皮层和内皮层之间的区域，在基底膜（BM）上捕获更集中的力图，尺寸为 3 µm × 3 µm 或 4 µm × 4 µm。保持像素为 50 × 50 曲线。
      注意：该步骤可获得更高的成像分辨率，并能记录更多数量的杨氏模量值，尤其适用于基底膜（BM）（参见 图 2E- F）。此外，这有助于更准确地区分基膜（BM）与周围组织，从而提高后续空间滤波过程的精确度。如果概览图的各通道显示管壁塌陷或破裂，或由于悬臂在非针尖部位接触样品而产生伪影，或在斜率通道中无法识别出明确的基膜（BM），则应移动至组织切片上的另一处管壁，直至找到一处可无伪影评估基膜（BM）的区域。
      对同一肺组织标本的其他切片重复前述步骤（3.3.6 和 3.3.7），直至完成预定数量的肺泡壁评估。为获得可靠结果，建议每例肺组织标本至少评估四条肺泡壁。59.
    8. 测量完成后，清洗所有接触过样品和PBS的设备与材料。若样品不再需要，将其丢弃至可高压灭菌的玻璃废弃物容器中。保存所有记录的数据，并关闭原子力显微镜控制软件及计算机。最后，关闭所有使用过的电气设备。
      注意：此时可暂停实验流程。实验数据已保存，可在后续时间点进行分析。

4. 数据分析

  1. 力-压痕曲线分析
    注意：Force Curve Analysis 应用程序的详细使用手册可在此处找到： https://github.com/CANTERhm/CANTER_Processing_Tool/wiki/2a.-力-曲线-分析
    1. 启动 CANTER 处理工具箱56 在 MATLAB 中打开 力曲线分析 应用
      注意：可通过以下链接从 GitHub 仓库下载该 Toolbox： https://github.com/CANTERhm/CANTER_Processing_Tool。GitHub 仓库中提供了 README.md 文件，其中包含如何在 MATLAB 中安装和启动该软件的完整指南。工具箱中各应用程序的详细信息可参见以下对应 wiki 页面：https://github.com/CANTERhm/CANTER_Processing_Tool/wiki。
    2. 单击以加载高分辨率（3 µm x 3 µm 或 4 µm x 4 µm）力图 选择文件 按钮，导航至力图保存的位置，双击该文件，然后点击 加载数据 应用程序用户界面中的按钮
    3. 一个弹出窗口会出现，要求输入此前在步骤 3.2 中已测定的、用于记录上一协议步骤所选力图的悬臂梁的校准值（InvOLS 和弹簧常数）。将校准值分别填入对应的编辑框中。如果在步骤 3.2.4 中未记录这些值，请参考自动生成的校准文件，其中也包含相应的校准值。保留默认选项 是 关于是否应计算针尖-样品间距的问题。随后，单击 提交 继续按钮
    4. 第二个弹出窗口出现，允许选择压头几何形状和被测样品的泊松比。对于所用的MLCT悬臂梁，选择 四面体棱锥 尖端几何形状设为默认值，并输入17.5°作为边缘半角（两者均为默认值）。使用默认的泊松比0.5，代表不可压缩材料。要继续进行QI图的加载过程，请点击 提交 按钮。
      注意：在加载过程中，记录的偏转-位移曲线（原子力显微镜的原始数据）将根据提供的校准值转换为力-压痕曲线。有关各个转换步骤及相关方程式的详细说明，请参阅Hartmann等人的补充信息。59.
    5. 加载过程完成后，力图的初始力曲线将显示在屏幕上。确保基线校正模式 偏移 + 倾斜 被选中。该模式可自动检测力-诱导曲线的基线，并将倾斜度和垂直偏移校正为零。此外，选择赫兹模型（Hertz model）作为算法 接触点定位器 在相应编辑框中为此选项输入20%的数值。该算法特别适用于检测在软组织样本上记录的力-压痕曲线中的接触点。最后，在相应的编辑框中将拟合深度设置为1.5 µm。
      注意：为确保显微镜载玻片的刚性不会影响所测得的杨氏模量，建议将最大拟合深度设置为不超过组织切片厚度10%的数值。60有关校正算法的更多细节，请参见 Hartmann 等人论文的补充信息。59.
      注意：实验过程中应使用相同的适配深度，以确保结果具有可比性。
    6. 要将修正后的赫兹模型的拟合应用于QI图中所有力-压痕曲线，请点击 保持 & 应用于全部 按钮。此时会弹出一个对话框，询问是否在分析过程中显示每条力曲线。如果不显示曲线，处理速度将略有提升。
    7. 完成最后一次力曲线分析后，会出现一个窗口，询问是否应保存拟合结果。要以 .tsv（制表符分隔值）和 .xlsx（Excel）文件格式保存结果，请点击 是 并为结果文件输入名称。此外，还会保存一个扩展名为 *.meta_data 的文本文件，其中包含曲线分析的所有详细信息，例如所使用的校准值、选择的拟合模型、选定的接触点检测算法、拟合范围以及其他相关信息。
    8. 关闭 力曲线分析 点击应用 交叉图标 位于主窗口的右上角。
  2. QI图结果的空间滤波
    注意：空间滤波步骤可确保仅考虑源自基底膜（BM）的QI图中的杨氏模量值，用于后续任何分析。一份详细的使用手册 结果筛选工具 可在此处找到： https://github.com/CANTERhm/CANTER_Processing_Tool/wiki/结果筛选工具
    1. 选择 结果筛选工具 从应用程序选择窗口的应用程序列表中 CANTER 处理工具箱 并点击启动应用程序 启动应用 按钮
    2. 要加载拟合结果，请点击 开放 位于顶部菜单栏的 结果筛选工具 用户界面。在随后弹出的窗口中，找到第一个 设置 位于内部的按钮 JPK Maps 标签，选择包含力曲线分析结果的 .tsv 文件（参见步骤 4.1.6）。点击第二个 设置 按钮，并找到与已选 .tsv 文件对应的 QI 地图文件。随后，点击 提交 加载地图数据和力曲线分析结果。
    3. 选择 Emodul 顶部的选项 显示通道 下拉菜单以将获得的杨氏模量结果显示为图像图谱。此外，选择 Emodul 选项（如果尚未选择）从 数据通道 直方图下方的下拉菜单，用于可视化QI图中加载的杨氏模量值的分布情况。
    4. 点击 操作流程 位于用户界面中央的箭头按钮，确保其指向右侧。设置 图像滤波器 切换按钮至 开启 直方图坐标轴上方的筛选面板中的位置。选择 徒手 选项从 滤膜几何形状 下拉菜单，然后点击 添加 按钮
    5. 在上方通道图像中，按住鼠标左键并围绕基膜（BM）画出滤波掩膜。在杨氏模量图中，基膜可被识别为相较于邻近较软组织具有较高杨氏模量值的明亮结构（参见 图3A）。完成绘制掩膜后，松开鼠标左键，然后双击掩膜以将其应用到图谱。此时右侧的直方图仅显示以绿色高亮区域（默认颜色；参见 图 3C-D).
    6. 要创建一个仅包含掩膜后杨氏模量值的新 .tsv 结果文件，请点击用户界面顶部菜单栏中的 保存 > 保存直方图 > 保存数据或者，右键单击直方图坐标轴的空白区域，然后选择 保存数据 从上下文菜单中。
    7. 点击 全选 在弹出窗口中选择要写入 .tsv 文件的结果，然后单击以确认选择 好的 按钮。随后，在保存对话框中输入 .tsv 文件的名称，选择期望的保存位置，最后单击 好的 保存筛选结果。
    8. 关闭 结果筛选工具 通过点击 交叉图标 在应用程序的右上角。
  3. R2 结果筛选
    注意：本实验步骤旨在确保仅考虑修正后的赫兹模型与所拟合的力-压痕曲线具有良好一致性的杨氏模量结果。以下为详细操作手册 R² 过滤工具 可在此处找到： https://github.com/CANTERhm/CANTER_Processing_Tool/wiki/R²-Filtering-Tool
    1. 开始 R² 筛选工具 通过在应用程序选择窗口的应用程序列表中选中它 CANTER 处理工具箱 并点击 启动应用.
    2. 导航至用户界面顶部菜单栏并单击 打开 .tsv 文件在随后的加载文件对话框中，找到上一步骤 4.2.5 中保存的包含骨髓（BM）杨氏模量结果的 .tsv 文件，通过双击选中该文件。
    3. 一个对话框出现，显示 .tsv 文件中包含的数据列列表。请选择 Emodul 选择包含杨氏模量数据的列。随后，在要求输入R²数据的另一个列表框对话框中，选择 rsquare_fit 加载程序完成后，加载的杨氏模量数据以直方图形式显示在屏幕左上方，而R²数据分布则显示在右上方的图表中。
    4. 在图形用户界面中央的编辑框中输入 0.96。点击 筛选数据 单击按钮，应用输入值进行 R² 筛选。此操作将仅保留 R² 值为 0.96 或更高的结果。筛选后的杨氏模量结果及其对应的 R² 值分布显示在用户界面的下半部分。
    5. 选择 保存筛选后的数据 从顶部菜单栏创建一个新的 .tsv 文件，该文件仅包含满足预设 R² 筛选条件的结果 > 0.96. 现在可将保存的数据以直方图形式显示，例如使用 直方图绘制工具，可显示所探测肺部基底膜的杨氏模量分布（参见 图4A).

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在识别并测量完整的肺泡壁后，本方案的主要结果是基底膜（BM）的过滤后杨氏模量值。需要注意的是，并非每张组织切片都能找到适合进行原子力显微镜（AFM）测量的肺泡壁。在我们的实验观察中，约75%来自小鼠肺组织样本的冷冻切片显示出可定量分析的肺泡壁。为了准确测定肺部基底膜杨氏模量的空间分布，我们建议采用覆盖3 µm × 3 µm或4 µm × 4 µm区域的力图谱。该方法可为通常厚度为100 nm – 200 nm的小鼠肺基底膜提供足够的分辨率。因此，实验方法要求对每张力图谱采集50 × 50个力曲线，共计2,500条力曲线。在力图谱中，力曲线呈均匀分布。这意味着即使在较小的力图谱范围内，除基底膜本身的杨氏模量外，也会探测到基底膜周围组织结构的信息。因此，为了准确且选择性地仅测定肺基底膜的杨氏模量，本方案中采用了两步过滤流程。

操作者依赖的空间滤波初始筛选步骤，选择来源于小鼠肺部基底膜（BM）的力曲线拟合结果，这些结果约占所分析力图中总结果值的10%至25%。经过该初步空间滤波后，通常保留约250至625个拟合结果用于进一步分析。下一步滤波步骤确保仅纳入那些由经修正赫兹（Hertz）模型充分描述的力曲线所得出的、与基底膜相关的拟合结果。因此，采用修正赫兹模型拟合的决定系数（R2）作为滤波标准。根据我们的实践经验，遵循本实验方案所获得的拟合结果中，保留R2值高于0.96的结果是合适的。需要注意的是，R2值显著受力曲线基线的质量（平滑度）和长度、接触点的确定以及拟合模型收敛性的影响。在完成上述两项滤波步骤后，通常每条肺泡壁基底膜可保留约100至500个杨氏模量值。

可通过直方图可视化基底膜（BM）中剩余杨氏模量值的分布情况（图4A）。需要注意的是，肺部基底膜的杨氏模量值呈对数正态分布，这种分布模式在只能取正值的随机变量中较为常见61。这一点可通过图4B中的QQ图加以验证。因此，可对经对数变换后的杨氏模量（E）值分布拟合正态（高斯）分布。本研究采用自然对数（ln）对E值进行变换。通过拟合获得该分布的峰值位置（µ）和标准差（σ），并进一步通过逆变换计算得到代表性的杨氏模量，记为EBM，计算公式如下：

统计力学公式，\( E_{BM}(\mu) = e^{\mu} \)，表示指数关系。

需要注意的是，在重新变换后，标准差区间不再以峰值为中心对称。标准差区间的负向（σ-）和正向（σ+）边界可通过以下公式计算：

数学分析中统计模型的指数函数方程示意图

正态分布方差公式的方程示意图。

这些方程源于指数函数是自然对数的反函数这一事实62。

根据图4A中直方图确定的峰值μ = 9.31和标准差σ = 0.18进行反变换后，代表性杨氏模量值为EBM = 11.05 kPa，其标准差区间为[-1.82 kPa, +2.18 kPa]。或者，也可将对数正态分布拟合到未变换的杨氏模量（E）值的直方图上，以确定该分布的特征参数。

建议每只小鼠至少分析四个血管壁，以获得可靠的代表性结果，这一点我们在 Hartmann 等人的研究中已有详细说明59。为了确定小鼠的代表性杨氏模量 EBM，将四个血管壁的对数转换值绘制在一个合并的直方图中，并通过拟合正态分布确定 µ 和 σ。随后，如前所述将 µ 和 σ 进行逆变换，以获得该小鼠的 EBM 及其标准差区间。

肺组织分析的样本制备、冷冻切片和原子力显微镜检测；显示力-距离曲线及模量拟合结果。
图1：测定小鼠肺部基底膜杨氏模量的主要实验步骤概览。 首步为获取并制备小鼠肺组织，随后进行包埋处理。具体而言，先向肺组织内注射OCT包埋剂与PBS的混合液，再将肺完全浸入OCT包埋剂中。之后，使用冷冻切片机进行冷冻切片，获得厚度为15 µm的肺组织切片。本方案中，我们详细描述了如何使用单面和双面胶带在切片过程中固定样本。随后，通过对组织切片进行原子力显微镜（AFM）力图测量，确定基底膜（BM）的杨氏模量值。在完成力-距离曲线分析后，采用空间滤波与R²滤波方法，提取目标结构（即基底膜）的杨氏模量结果（在力图中以绿色显示，并在对数转换后的杨氏模量分布图中进行量化）。 请点击此处查看该图的放大版本。

显示具有增强纳米材料特征和形貌的结构分析的显微镜图像系列。
图 2：在小鼠肺组织切片上进行的典型力图AFM实验。（A）小鼠肺组织切片的明场显微镜概览图像，可用于识别位于两个肺泡之间的完整肺泡壁。在图像右侧，可见原子力显微镜（AFM）的三角形MLCT悬臂F。（B）组织切片中选定肺泡壁的放大视图。（C）和（D）为包含50 × 50个力曲线的15 × 15 µm概览图的斜率通道和高度通道。在斜率通道中，基底膜（BM）表现为一条亮线（白色箭头），表明该结构在肺泡壁中具有更高的刚度。高度通道证实了肺泡壁的完整性，未见破裂迹象。在15 × 15 µm概览图中识别出基底膜后，记录了一个更小的4 × 4 µm力图（E：斜率通道，F：高度通道），包含50 × 50个力曲线。比例尺：（A）200 µm，（B–D）25 µm。所示AFM图像的颜色标尺范围分别为（C）2.36 – 9.29 nN/µm，（D）0 – 3.38 µm，（E）2.36 – 9.29 nN/µm（概览图）和2.42 – 8.37 nN/µm（小图），（F）0 – 3.38 µm（概览图）和0 – 1.99 µm（小图），颜色由暗至亮。所有AFM图像均采用线性颜色标尺。请点击此处查看该图的放大版本。

杨氏模量分布图；杨氏模量直方图；刚度分析；力映射图。
图 3：空间滤波过程的可视化。（A）由力曲线分析得到的杨氏模量分布图，如结果过滤工具中所示，可用于对结果进行空间滤波。基底膜（BM）表现为一条明亮（高杨氏模量值）的条带，周围被较软的组织区域所包围。（B）对应于未滤波分布图（A）的杨氏模量值直方图。在应用（C）空间滤波掩模（绿色区域）后，（D）直方图仅包含来自绿色高亮区域的杨氏模量值，该区域被识别为基底膜。请注意，直方图左侧可见的残余低值可归因于拟合收敛性较差的情况，这些将在后续的R²滤波步骤中被剔除。请点击此处查看该图的放大版本。

杨氏模量直方图与Q-Q图、数据分布分析、统计评估。
图4：按照本实验方案测得的小鼠肺部基底膜杨氏模量分布。（A）所得基底膜杨氏模量值的对数正态化直方图（N = 325）。通过拟合正态分布（黑色实线），确定均值 µ = 9.31，标准差 σ = 0.18。经逆变换后，对应基底膜的杨氏模量为 EBM = 11.05 kPa，其非对称标准差区间为 [-1.82 kPa, +2.18 kPa]。（B）对数化后的基底膜杨氏模量值分位数与标准正态分布分位数的Q-Q图。该图表明，除分布左右尾部的少数数值外，所得杨氏模量值主要呈对数正态分布。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

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由于基底膜（BMs）的力学特性会影响多种细胞功能，如肿瘤出芽、细胞分化、细胞运动以及染色质的可及性53,63,64,65,66,67,68，因此其力学特性已受到广泛关注。然而，在以一致且可量化的方式评估基底膜力学性能方面，仍存在尚未满足的技术需求。本实验方案旨在帮助原子力显微镜（AFM）使用者测定来自野生型或基因修饰小鼠的健康或病变肺组织样本中肺部基底膜的杨氏模量。基于MATLAB开发的用户友好型图形界面应用程序CANTER Processing Toolbox56可协助完成AFM数据的后续分析。本方案预期将有助于其他研究人员开展相关研究，推动肺部疾病在临床诊断、疾病管理或新治疗策略方面的进展。

该实验方案的关键步骤包括：在肺组织标本进行冷冻切片时，必须确保组织切片在任何阶段均不发生融化，以防止因冻融循环导致其力学性质发生改变。因此，必须仅使用预冷的显微镜载玻片来收集切片，并且所有操作均需在冷冻切片机的冷冻室内完成。在肺泡壁上记录力图谱过程中最关键的步骤是利用所生成的斜率图像，该图像可提供探查区域刚度分布的定性概览，从而帮助识别基底膜（BM）的合适测量位置。对所获得的杨氏模量值进行空间滤波是本方案中的关键步骤，也是CANTER处理工具箱的核心功能之一。该滤波步骤使研究人员能够通过基底膜相较于两侧较软细胞层所表现出的独特较高刚度特征，识别出基底膜，并提取其对应的杨氏模量值用于后续分析。

这种高级分析工作流程显示，与野生型同窝小鼠相比，netrin-4 基因敲除小鼠肺基底膜的杨氏模量显著升高（约两倍）53。因此，本方案有助于对不同条件或组别进行比较分析。

除了原子力显微镜（AFM）之外，还存在多种用于检测生物材料力学性能的方法，包括在分子水平上的光镊或磁镊69,70,71，在中等尺度上的微压痕技术72,73，以及在宏观尺度上的受限或非受限压缩测试74,75。具体而言，压力血管造影法、拉伸测试76,77和流变学78已被用于评估血管样本及重建的基底膜（BM）基质的刚度。然而，像压力血管造影法和拉伸测试这类技术仅能评估完整组织或整体组织结构（如整个血管）的力学特性，而这些结构包含多种细胞层和结构组分。因此，在使用这些方法评估基底膜生物力学时，非基底膜组分（如细胞成分）的力学性能总会叠加在基底膜的结果之上，难以单独分离出基底膜自身的特异性力学性质。

在本方案中，通过力图结果的空间滤波提取目标特征（基底膜，BM）。该方法的一个局限性在于，要求目标特征在获得的杨氏模量图或其他可用图通道中能够被清晰分辨并识别为独立的模式。例如，肺泡组织中的基底膜之所以可被识别，仅因其相互连接的结构表现出显著高于周围细胞的杨氏模量。因此，基底膜在获得的杨氏模量图中呈现为连续的亮条带。然而，其他生物结构的力学性质与其周围组织差异不足，无法通过图谱结果进行空间滤波分离。尽管本方案可与其他方法结合用于在记录的力图中识别结构（如免疫荧光染色），但此类方法可能产生难以解释的结果。这一问题可能源于染色过程会改变组织的力学性质。因此，在原子力显微镜（AFM）测量前，仅在没有其他替代方法可识别目标特征时，才应对组织进行任何处理或染色。此外，必须开展适当的对照实验，比较染色与未染色样品的生物力学特性。

该方案介绍了一种基于杨氏模量差异来识别目标结构的方法。因此，该方法可应用于具有与肺部类似的解剖学基底膜（BM）的组织，包括甲状腺、结肠和前列腺（参见Hartmann等人59的扩展数据图）。尽管该方案最初是为分析基底膜力学特性而开发，但本方案及CANTER处理工具箱56具有足够的通用性，可用于检测原子力显微镜（AFM）力图中任意力学性质不同且连续的区域（详见 www.github.com/CANTERhm/CANTER_Processing_Tool/wiki 的操作说明）。这种广泛的适用性使该工具在整个AFM领域具有重要价值，并支持了科学界日益关注的力学生物学研究。 

披露

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作者声明无竞争利益。

致谢

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B.H. 和 H.C.-S. 感谢巴伐利亚州科学与艺术部通过巴伐利亚研究重点“三维组织的制备与生物物理表征”（CANTER）项目以及巴伐利亚学术论坛（BayWISS）-健康研究博士联盟提供的资助。数据分析软件 CANTER Processing Toolbox 的开发由德国研究基金会资助，属于研究联盟“探索骨关节炎中关节软骨与软骨下骨的退变与再生——ExCarBon”（FOR2407-1/2）的子项目1（CL 409/4-1/2）。B.H. 和 H.C.-S. 还感谢德国研究基金会通过大型仪器设备计划 GGA-HAW（INST 99/38-1）提供的资助。本工作还得到了丹麦癌症协会（R204-A12454（R.R.））和德国研究基金会（项目编号 539446614 至 R.R.）的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1 mL 注射器B Braun9166017VInjekt-F
10 mL 注射器B Braun4606108VInjekt Luer Solo
15 mL Falcon 管Sarstedt62.554.002带螺帽的离心管
悬臂梁 - MLCTBruker AFM Probes3444具有锥形尖端结构的原子力显微镜悬臂梁
冷冻切片机刀片Leica Biosystems14035843496低剖面一次性刀片 DB80LX
冷冻切片机样品夹持器Leica Biosystems14047740044标本盘 30
冷冻切片机Leica BiosystemsCM1950Leica 冷冻切片机
直接叠加扩展模块Bruker用于 JPK SPM 软件的软件扩展模块，可将倒置显微镜的光学图像导入 SPM 软件的数据查看器中。
一次性底模Science ServicesSA62534-15Tissue-Tek 冷冻模具 15×15×5 mm
双面胶带tesa Film56661-00002相纸胶带
固定弹簧悬臂梁夹持器Bruker
倒置显微镜 - Leica DMi8Leica Microsystems
JPK 电动载物台Bruker
JPK NanoWizard 4XP BioScienceBruker
JPK SPM 软件Bruker
K5 CMOS 显微镜相机Leica Microsystems
MATLABMathworks版本 R2024a 或更高
MATLAB - 曲线拟合工具箱 Mathworks
MATLAB - 图像处理工具箱Mathworks
MATLAB - 信号处理工具箱 Mathworks
MATLAB - 统计与机器学习工具箱Mathworks
显微镜载玻片Carl RothH869.1用于悬臂梁校准的普通显微镜载玻片
显微镜载玻片 - 带磨砂边缘Carl RothH870.1用于冷冻切片的带磨砂边缘显微镜载玻片
针头 ø0.9 mm × 25 mmB Braun4657500用于向肺组织样本中注射 OCT 包埋剂 
针头 ø0.9 mm × 70 mmB Braun4665791长针头，用于在原子力显微镜下施加 PBS
OCT 包埋剂Sakura Finetek4583Tissue-Tek O.C.T. 包埋剂
磷酸盐缓冲液Bio&SellBS.L1825不含 Ca²⁺、Mg²⁺ 的 PBS 溶液，500 mL
QI 高级成像扩展模块Bruker用于 JPK SPM 软件的软件扩展模块，可为每个记录的图像像素提供其对应的完整力曲线。
手术刀B Braun5518083一次性外科手术刀
剪刀Kaut-BullingerM681700精密剪刀 13 cm 
单面胶带tesa Film57330-00000透明胶带，33 m × 19 mm
载玻片盒GWL Storing SystemsK50W可存放 50 片载玻片的载玻片盒
体视显微镜 - Stemi DR1663Zeiss
镊子 - Vomm SS-SA-ESDEleshopELE002121

参考文献

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