使用新型 Stamp 装置从二维细胞培养物中生成三维球状体/类器官

摘要

本研究提出了一种经济高效且高效的方法，使用基于邮票的系统在琼脂糖模具中创建微孔来生成 3D 细胞结构。该系统促进均匀球状体/类器官的形成，从而改善细胞相互作用。这种方法减少了实验的可变性，并支持药物检测和组织工程中的应用。

摘要

与传统的二维 （2D） 培养相比，三维 （3D） 细胞培养物可以更准确地表示 体内 微环境，因为它们促进了细胞与细胞外基质之间的相互作用增强。本研究旨在开发一种高效、经济且可重复的方法，使用基于邮票的创新系统在琼脂糖模具中创建微孔来生成 3D 细胞结构（球状体/类器官）。使用一种新型邮票在 6 孔板的每孔中产生 663 个微孔，为细胞聚集提供了理想的环境。将原代猪胰岛细胞接种到这些微孔中，在那里它们聚集形成球状体/类器官。将培养物在 37 °C 下在 5% CO₂ 下孵育，每 3 天更换一次培养基。定期监测球状体的形成，并收集样品进行表征。该方法成功生成了均匀和高质量的球状体，减少了实验变异性，最大限度地减少了作，并增强了细胞相互作用。基于琼脂糖的微图案模具的使用为 3D 培养提供了一个简化、受控的环境，提供了标准化且具有成本效益的解决方案。该方法支持药物检测和组织工程应用，为 3D 细胞培养模型提供了一个实用且可扩展的平台，可以在各种实验室环境中轻松实施。

引言

在过去的 50 年里，大量细胞生物学研究表明，二维 （2D） 培养物无法准确复制在动物模型中观察到的 体内 条件¹。在结构上，2D 细胞培养物不允许细胞进行三维组织并复制在 体内 系统中观察到的情况。此外，与 3D （3D） 培养物相比，2D 培养物中的细胞信号转导通路发生了改变，这可能解释了为什么使用 2D 培养物进行某些类型的药物筛选如此差异²。随着 3D 培养系统的引入，细胞培养技术取得了重大进步。3D 系统的复杂程度差异很大，具体取决于细胞组成和细胞结构。通常，会产生两种类型的结构，即:球状体和类器官。球状体被描述为从正常或肿瘤组织、胚状体和细胞系获得的简单细胞簇。3D 结构的形成受多种因素影响，包括细胞间相互作用和细胞外基质 （ECM） 成分介导的信号通路，这些成分提供结构支持和生化线索。这些元素调节有助于组织组织和功能的相互作用³.球状体培养系统于 1970 年代初首次被描述，使用 V79 中国仓鼠肺细胞系作为结节癌的模型，在非粘附条件下生长并形成完美的球体⁴。类器官被描述为源自干细胞或祖细胞的器官特异性细胞类型的簇，它们通过细胞分选和谱系规范等过程以空间受限的方式进行自我组织，反映了 体内 发育⁵。

有几种可用的方法和材料可用于在 3D 条件下培养细胞。目前用于生成 3D 培养物的主要方法是:1） 悬滴;2） 旋转细胞培养和低附着塑料;3） 包含锥形孔的金字塔板;4） 大孔支架;5） 磁珠;6） 无支架水凝胶。

悬滴是用于获得无支架 3D 培养物的方法。这种方法存在一定的局限性，包括需要大量处理、生产效率低、球形几何形状和承受高剪切力。此外，特定的程序（例如培养基更换或化合物添加）可能具有挑战性，并可能导致材料损失。此外，文献报告表明，使用这种方法时，一些细胞系无法产生紧密堆积的球体⁶。

旋转细胞培养物和低附着塑料塑料片用于防止细胞附着在基质上，导致它们聚集并形成球状体。此过程需要特定的培养瓶和/或搅拌/旋转。虽然这是大规模球状体或类器官生产最直接的方法之一，但它并非没有缺点，例如需要特定设备、培养寿命短、球状体的大小变化、对细胞的机械损伤和效率低⁶。

含有锥形孔的金字塔板是市售的板，除了一些作可能会阻碍球状体/类器官的形成之外，还会影响成本⁷。

大孔支架也用于 3D 培养;然而，一个主要障碍在于实现有效的细胞接种和均匀分布。出现此问题的原因是孔径可能太小而无法穿透细胞，或者太大而无法牢固地保留细胞。为了解决这个问题，已经探索了几种策略⁸，这些策略直接影响该技术的复杂性和成本。

磁珠方法会产生少量的球状体/类器官，成本高，并且可能在细胞内留下纳米颗粒残基⁹。

在用于培养球体的系统中，可以使用非粘附性琼脂糖水凝胶，代表无支架水凝胶。这种方法具有显著的优势，例如精确控制 3D 结构的尺寸，以及每块板能够生成大量此类结构。在这种方法中，将细胞引入带有预制孔的水凝胶中，在水凝胶中，它们下沉并自组装成 3D 球体¹⁰。

在这项研究中，我们提出了一种使用微模式模具以简单、高效、可重复和低成本的方式生成琼脂糖微孔的设备和方法。

使用该印章作为模具在琼脂糖中生成微孔，在重力的帮助下，旨在增强微孔内的细胞相互作用和细胞组织，以简单、高效、可重复和低成本的方式 在体外 生成 3D 结构（球状体/类器官），从而节省研究时间和实验室资源。

方案

该协议遵循我们机构人类研究伦理委员会 CEUA-FMUSP:1699/2021 的指导方针，于 2021 年 9 月 8 日批准 - "猪胰岛的分离和封装"，是我们细胞和分子治疗 NUCEL 小组 （www.usp.br/nucel） 主题项目的一部分，FAPESP 资助号 2016/05311-2，标题为:"旨在治疗慢性退行性疾病（癌症和糖尿病）的再生医学"。

1. 印章装置的制作

注:此邮票由 NUCEL 集团 （https://w3nucel.webhostusp.sti.usp.br/） 定制。该印章装置是使用参考软件开发的，该软件因其精度和先进的三维建模功能而得到广泛认可。

1. 确保设计的原型具有 663 个微针，这些微针的排列能够产生相同数量的三维培养物，例如球状体或类器官。为确保 T6 托盘表面印记的稳定性，请沿设备的圆周战略性地放置五个支撑点。
2. 确保微销采用锥形设计，尺寸可调，长度从 1 到 3 mm 不等。锥体的基直径在 0.7 到 1.5 mm 之间变化，而锥角范围从 5° 到 10°。
3. 确保设备的"停止"结构（定义微销的深度）具有 10 至 19 毫米的可调长度和 20 至 40 毫米的直径，微销均匀分布在其表面上。
4. 此外，将设备设计为具有符合人体工程学的手柄，适合单手作，以提高使用过程中的实用性和精度。
   注意:为了促进设备的大规模生产，提供了 .stl 格式的数字文件，这对于 3D 打印过程至关重要。
5. 只需使用适当的软件对其进行切片，然后使用兼容的 3D 打印机打印即可。使用以下打印尺寸:X - 68 毫米;Y - 120 毫米;Z - 150 mm，确保功能和结构质量之间的理想平衡。
6. 对于设备的制造，请使用可光固化的 3D 打印机，该打印机与可 UV 固化聚合物树脂兼容，该树脂必须具有高分辨率和均匀的表面光洁度，这是实现最佳设备性能的基本特性。
7. 使用与所选 3D 打印机兼容的软件对数字模型进行切片以进行打印。

2. 琼脂糖微孔的制备

1. 准备琼脂糖溶液。
   1. 称取纯琼脂糖粉末并将其溶解在 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中，以达到 1-2% （w/v） 的最终浓度。
   2. 在微波炉或水浴中加热溶液直至完全溶解，确保其均匀透明。
      注:避免过热或过度再加热，因为这会降解琼脂糖。不要准备大量储备液。
   3. 让溶液冷却至 ~40 °C，这是移液的理想温度。
2. 准备定制的印章。
   1. 用软毛海绵和蒸馏水清洗邮票以去除残留物。
   2. 将清洁后的印章暴露在紫外线下 5-10 分钟以确保无菌。
3. 形成微孔。
   1. 将 ~3 mL 的 40 °C 琼脂糖溶液倒入/移液到 6 孔板的每个孔中，确保 2-3 mm 的均匀深度。
   2. 将定制的邮票放在孔的中心，同时琼脂糖仍然温暖。
      注意:邮票具有确保对齐和稳定性的横向支撑，无需手动支撑。每个印章每孔产生 ~663 个微孔（~2 mm 高）。确保 micropin 上没有气泡;如果形成气泡，请轻轻移动邮票以消除气泡。
   3. 让琼脂糖在室温下固化 5-10 分钟，不要移动板。
      注:在凝固过程中不要干扰琼脂糖，以避免微孔结构发生变化。
   4. 轻轻地来回移动去除印章，以释放真空而不会损坏微孔。
      注:这种运动有助于空气进入，从而可以顺利去除印记而不会使凝胶变形。微孔必须保持完整。
   5. 用 PBS 溶液洗涤微孔 3 次以去除残留物。
   6. 将板暴露在紫外线下 10 分钟以消除微生物污染。
   7. 加入 3 mL 培养基，并将板在 CO₂ 培养箱中于 37 °C 孵育过夜。
      注:该孵育在细胞接种前验证是否存在污染。

3. 在微孔中接种细胞

1. 准备细胞悬液。
   1. 通过胰蛋白酶消化或其他解离方法收集细胞以获得均匀的悬浮液。
   2. 计数细胞并根据每个微孔的所需数量调整浓度。
      注:要在 663 个微孔中每个微孔接种 5,000 个细胞，请制备至少含有 3.315 × 10^{个 6} 个细胞的悬浮液。优化细胞浓度以防止中枢坏死并确保足够的营养和氧气扩散。
2. 为细胞接种。
   1. 将 ~3 mL 制备好的细胞悬液移液移液到微孔上，轻轻旋转板以确保均匀分布。
   2. 让细胞通过重力沉降（~10-15 分钟）或以 100 × g 温和离心 5 分钟。
      注:离心可用于确保细胞在微孔中浓缩。
   3. 将板转移到 37 °C 且具有加湿气氛的 CO₂ 培养箱中。

4. 3D 细胞培养物的维护

1. 更换培养基。
   1. 每 2-3 天更换一次培养基，去除 50% 的旧培养基并加入新鲜培养基。
      注意:确保微孔在整个培养期间保持浸没状态，以防止脱水。
2. 监测 3D 培养物的形成。
   1. 继续培养，直到 3D 结构完全形成和紧凑（例如，原代胰岛培养需要 2-3 天）。
      注:对于需要较长形成时间的培养物，每 2-3 天更换一次部分培养基。

5. 3D 结构的收集和表征

1. 收集球状体/类器官。
   1. 去除旧培养基，并使用大口径或切割移液器吸头通过剧烈移液收集 3D 结构，以防止压缩或解聚。
      注意:必须控制剧烈的移液以去除聚集体而不会使它们变形。
2. 准备分析。
   1. 立即使用收集的球状体/类器官或修复它们以备将来分析。
      注:球体的结合和稳定性取决于细胞类型、形成时间和培养条件。小心以避免分离。

结果

本研究中使用的细胞培养物来源于猪胰岛。本研究中使用的胰岛制剂具有 80 ± 5% 纯度（基于二硫腙染料染色）和 >80% 胰岛细胞活力（基于活细胞中荧光素二乙酸酯或死细胞中碘化丙啶的检测）（活/死荧光法）。确保猪胰岛制剂的纯度至少为 80%（例如，通过二硫腙染色）和 >80% 的存活率。分离后，在 CMRL 1066 培养基中维持贴壁培养物，补充有 1 mM L-谷氨酰胺、0.2% 环丙沙星和 10% 胎牛血清 （FCS），在 37 °C 和 5% CO₂ 下，如前所述^11,12。

在本研究中，彻底评估了基于 stamp 的系统在琼脂糖模具中生成微孔的有效性（图 1）。 图 2 所示的印章设计展示了微探针的精度及其放置，有助于在微孔形成过程中保持一致的对齐和处理。这确保了整个板的微孔模式一致，这是实现可重复 3D ...

讨论

尽管文献中存在各种 3D 培养方案，但 Wassmer 等人进行的一项研究¹³ 测试了使用胰岛生成 3D 结构的几种方法。作者观察到，天然胰岛和自聚集球体在大小和形状方面表现出相当大的异质性，并且比使用其他方法获得的球体更大。根据他们的发现，他们得出结论，球体可以使用不同的技术生成，每种技术都有自己的优点和缺点。对于胰岛细胞聚集，推荐的方法是悬滴技术、琼脂糖微孔板或 Sphericalplate 5D。

文献中已成功使用用于生成琼脂糖微孔的装置。例如，Stuart 等人¹⁴ 使用设备显示出有希望的结果，但它存在一些需要解决的缺点。这些特点包括它可以生产的微孔数量有限，由于模具面积小而减少了工作体积，以及它的设计为负模，这使得处理复杂化，并增加了微孔破损和变形的风险。

Charelli 及其同事¹⁵ 使用 3D 打印技术...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
31L 微波	伊莱克斯	78965840 6699 9	用于加热琼脂糖溶液的设备，促进其溶解并确保更高的均匀性。它允许溶液达到形成孔的理想液态。
3DFila 灰色不透明光敏 3D 树脂			UV 固化聚合物树脂
3D 打印机 - Creality Halot 一台	Creality	N/A	3D 打印机，用于打印邮票设备
琼脂糖	UNISCIENCE	UNI-R10111	为了形成凝胶，将 1% 至 2% 溶解在盐水磷酸盐缓冲液 （PBS） 或适当的培养基中。
Autodesk Fusion 360			3D 建模
BB15 CO2 培养箱	Thermo Fisher	51023121	用于在合适和受控环境中培养细胞的设备。
Chitubox	Chitubox	N/A	用于打印
II 类生物安全柜	Grupo VECO	N/A	确保在既定参数和协议内进行细胞培养的无菌环境。
培养基	USBiological/Life Sciences	C5900-03A	包含用于适当细胞培养的添加剂。
培养板 （P6）	SARSTEDT	1023221	用于塑造琼脂糖和培养细胞。
锥形瓶 （25 mL）	Laborglas	91 216 14	用于溶解的容器 1–2% 琼脂糖溶于磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 或其他合适的培养基中，通常在微波炉中加热。
Falcon 15 mL 聚苯乙烯离心管	Corning	352099	用于保持细胞悬浮并进行可能的稀释。
胎牛血清 （FBS）	Vitrocell Embriolife	005/19	培养基添加剂。
PBS 溶液（磷酸盐水缓冲液）	实验室制备	N/A	，用 MiliQ 超纯水稀释 1 倍。用于溶解 1% 至 2% 的琼脂糖并洗涤已产生的孔。
蓝色瓶盖试剂瓶 - Schott	Laborglas	21801545	用于制备和储存培养基。
Stamp device	NUCEL Group	N/A	链接 - 此链接提供对 stamp 设备的 .stl 文件的访问。只需使用适当的软件对其进行切片，然后使用兼容的 3D 打印机打印即可。https://drive.google.com/drive/folders/1gTYComnJWzHpN6ZKOyK EChKS3Qns0rOA？usp=sharing
带过滤器的处理培养瓶 25 cm²	康宁	430639	用于贴壁细胞的培养和维持。
胰蛋白酶	Merck	07-07-9002	用于接种前的细胞解离。
紫外线 （UV）	N/A	N/A	用于对邮票和印版进行消毒。