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方法文章

毛霉菌 Phycomyces blakesleeanus 的有性杂交

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DOI：

10.3791/67790

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2025年6月6日

 , 
1Organismal Biology and Ecology Department, Colorado College

本文内容

摘要

本文介绍了一种诱导P. blakesleeanus交配的基本实验方案。

摘要

Phycomyces blakesleeanus 是接合菌门（Mucoromycota）中的一种丝状真菌，以其卓越的环境感知能力和适应性反应而著称。以往的研究表明，重力、光、湿度和营养可利用性等环境刺激会影响其生长动态和繁殖策略，但其潜在机制仍是当前研究的重点。环境信号可触发该真菌的有性或无性繁殖。有性繁殖始于信息素信号传导，进而诱导菌丝的化学趋向性，最终经历一系列形态转变，形成接合孢子。

在实验室条件下，P. blakesleeanus 的杂交会导致互补的菌丝体在不同阶段进入有性生殖周期。本研究旨在验证环境信号是否能够触发 P. blakesleeanus 菌丝体之间的交配。将营养受限培养基上生长的 P. blakesleeanus 杂交组合置于营养缺乏的琼脂中，以模拟营养剥夺条件，从而诱导其产生有性响应。成功诱导 P. blakesleeanus 交配将有助于未来需要大量处于特定发育阶段的有性繁殖菌丝体的研究工作。本研究的结果将进一步加深我们对 P. blakesleeanus 生殖机制如何受环境因素影响的理解，从而丰富关于丝状真菌有性生殖的总体知识体系。

引言

在实验室条件下诱导真菌交配，已推动了人们对真核生物遗传学、细胞生物学、进化生物学和生物技术的理解。双核真菌，特别是子囊菌门（Ascomycota），在实验室环境中关于交配诱导的研究最为深入1。有趣的是，最早被提出存在有性生殖的真菌Syzygites megalocarpus并不属于子囊菌门，而是接合菌门（Mucoromycota）的成员2。接合菌门是一个早期分化的类群，曾被归类为"Zygomycota"，现被认为与双核真菌类群互为姐妹支系3,4。接合菌门与虫霉门（Zoopagomycota）在进化上具有重要意义，因为这些类群代表了真菌向陆地生态系统过渡的关键阶段4,5。与其他真菌类似，接合菌通过无性和有性两种繁殖策略来响应环境变化3,6。在营养受限条件下，接合菌会启动有性生殖周期6。接合菌表现出同宗配合和异宗配合两种交配机制，其交配相容性由交配型基因sexM和sexP决定，分别标记为(-)和(+)7,8,9。

Blakeslee10强调了毛霉菌有性生殖周期对外界条件的敏感性，指出水分对其形成至关重要，且基质中的营养物质可获得性也起着重要作用。互补的交配型通过利用β-胡萝卜素作为前体协同合成三孢酸（TA），从而启动有性生殖周期11,12,13。在检测到TA后，响应的营养菌丝会增厚并发育为高度分枝的接合孢子囊柄14,15,16。接合孢子囊柄继续产生TA，并相互进行化学吸引。在P. blakesleeanus中，接合孢子囊柄在基质内部分化，因此在固体琼脂培养基上不易观察到17。当接合孢子囊柄相互接触后，它们会缠绕在一起并形成气生的接合孢子囊柄。

随着有性周期的进行，接合孢子梗的顶端相互附着，细胞中部向外突出，形成基部具有珊瑚状膨大的环形结构，从而完成向原配子囊的转变。构成原配子囊的细胞顶端开始融合并发育为配子囊。在配子囊阶段，接合孢子梗呈现出刺状装饰结构。细胞顶端的细胞壁溶解，同时出现不定隔膜，界定出接合孢子将形成的区域，此时接合孢子梗起到类似钳子的悬垂器作用18。随着细胞壁增厚，接合孢子将逐渐积累色素，并进一步形成额外的刺状装饰结构17,18。接合孢子形成后，将进入一段休眠期，随后重新启动生长周期。

Phycomyces blakesleeanus 是一种异宗配合的接合菌，以其巨大的细胞和对环境响应敏感的孢子囊梗而著称6,8,18。该生物易于在实验室中培养，其有性生殖周期中形成接合孢子的过程可在8–10天内完成并被观察。作为模式生物，P. blakesleeanus 已被广泛研究其感知外界光信号的能力17,19。由于其培养简便且可诱导交配，该真菌也成为研究光感知机制的理想模型20；这些研究结果也揭示了真菌中光感应机制在进化上的保守性。在 P. blakesleeanus 中，已证实这些保守的光感应蛋白可通过光信号抑制有性生殖过程21。近年来的进化发育生物学研究致力于解析在 P. blakesleeanus 有性生殖周期中参与细胞分化的关键基因6。要将形态发生过程与特定基因相关联，需要分离出足量且细胞类型一致的组织，以开展基因表达分析。

尽管已有文献描述过在实验室条件下诱导P. blakesleeanus交配的实验方案，但其中一些仅提及所用培养基类型及相关菌株18。部分方案未提供具体的培养基配方，但描述了如何在平板上放置推测为互补交配型的位置10。较新的方案通过混合两种交配型的孢子并接种混合孢子悬浮液21，或在平板上将交配型相隔一定距离放置并培养20天22，从而提高接合孢子的产量。这些方法有助于获得大量已分化的细胞，特别是接合孢子，但可能不适用于观察发育的时间进程，或难以挑选在接合孢子形成前出现的性结构用于单细胞转录组学研究。其他研究通过将互补交配型在固体培养基上相隔一定距离接种，以观察性周期启动过程中连续的形态学转变6,22,23，从而解决了这一问题。与其他真菌类似，P. blakesleeanus菌丝呈辐射状扩展24,25。因此，当互补交配型在同一平板上生长时，其菌丝的不同区域会在不同时间发生接触。由于菌丝间的接触是P. blakesleeanus性周期的早期步骤之一，这意味着相互作用的菌丝不同区域将处于性周期的不同阶段。这种不同步性可能影响基因表达研究的结果：如果已分化的细胞类型混合存在，且其基因表达程序确实不同，则很难将某一基因的功能归因于特定结构。

除了 P. blakesleeanus 作为研究有性生殖周期中形态发生相关基因的模型价值外，其旺盛的生长能力以及在数天内完成分化的特性，使其成为培训对早期分化的丝状真菌感兴趣的学生的理想真菌，也适用于本科教学环境，用于学习真菌的多样性及其发育过程。本文所介绍的实验方案利用两种培养基的三种不同浓度，以展示营养可利用性对菌丝形态、交配诱导以及特定有性结构富集的影响，可用于定量分析、观察或潜在的单细胞转录组学研究。

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方案

1. 培养基制备

  1. 将玉米粉琼脂（CMA）或马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）粉末溶于去离子水中。配制100% CMA或PDA时，按照生产商说明，将17 g CMA溶于1 L去离子水中，或将39 g PDA溶于1 L去离子水中。配制N% CMA或PDA时，取生产商推荐量的1/N，并补充额外的琼脂，使琼脂终浓度达到7.5%（w/v）。
    注意：可选步骤：若存在细菌污染风险，可在高压灭菌前加入终浓度为25 µg/mL的氯霉素。
  2. 将培养基置于高压灭菌器中，在121 °C下灭菌15分钟。
  3. 将培养基放入设定为60 °C的水浴中约30分钟，冷却至约60 °C。
    注意：若用手握住盛有温热培养基的瓶子6秒无明显不适感，则表明培养基已冷却至适宜倾注温度。
  4. 在超净台或生物安全柜内无菌条件下进行平板倾注。将培养基瓶倾斜于打开的空培养皿上方，倾注至刚好完全覆盖皿底即可。
    1. 也可使用玻璃刻度移液管，向每个培养皿中加入20 mL培养基。
      注意：此方法会延长培养基瓶处于低温的时间，增加琼脂提前凝固的风险。
  5. 让培养基重新凝固。若不立即使用，将平板置于4 °C保存。

2. 准备真菌孢子或组织

  1. 获取每种 P. blakesleeanus 交配型的培养物（例如 NRRL 1555 (-)、NRRL 1554 (+)、NRRL 1464 (-) 和 NRRL 1465 (+)）。若使用孢子接种杂交，首先将每种交配型在100% CMA或PDA培养基上进行纯培养。
  2. 从已有培养物中切取部分前沿菌丝，将切下的菌丝接种至一块100% CMA/PDA平板上。在27 °C、12小时光照循环条件下培养纯培养物1周。
  3. 当出现孢子囊梗后，用含0.01% Tween 20的无菌去离子水浸没产孢的纯培养物，采用无菌操作技术。使用P1000移液器从平板中吸取1.0 mL Tween 20-孢子混合液，转移至微量离心管中。
  4. 在小型离心机中离心30秒，然后弃去上清液。
    1. 若需要更多孢子，可继续向同一微量离心管中加入1.0 mL Tween 20-孢子混合液，并重复步骤2.4。获得足够量的孢子后，弃去上清液，加入500 µL无菌去离子水。
    2. 可选：使用血细胞计数板估算孢子浓度，以判断是否需要添加更多水或重新离心孢子。
  5. 或者，也可使用纯培养物的前沿菌丝直接接种杂交。
    1. 使用无菌刀片或打孔器切取组织，并立即将接种物接种到平板上。
  6. 设置两亲本杂交、四亲本杂交或八亲本杂交（图1）。
    注意：若杂交用于转录组学研究，建议为每种条件/培养基额外设置1-2块指示平板。指示平板可使研究人员减少实验平板的光照暴露，因为光照会抑制 P. blakesleeanus 的有性生殖。
    1. 对于两亲本杂交，将互补交配型相对放置（图1A）。
      1. 将(-)交配型（NRRL 1555 或 NRRL 1464）的菌丝放置在PDA或CMA平板上，距离培养皿边缘至少1 cm。
      2. 在同一平板上，与(-)交配型相对的位置、距离培养皿边缘1 cm处，放置(+)交配型（NRRL 1554 或 NRRL 1465）（图1A）。
        注意：互补交配型之间的距离会影响参与有性周期的组织大小。交配型之间距离较远时，菌丝可更充分扩展，从而增加两个亲本之间的有性相互作用数量。
    2. 对于四亲本杂交，将相同交配型相对放置，但相邻于互补交配型（图1B）。
      1. 将(-)交配型（NRRL 1555 和 NRRL 1464）的孢子或菌丝在PDA或CMA平板上相对放置，距离培养皿边缘至少1 cm。
      2. 在同一平板上，选择两个(-)交配型之间的位置，且距离平板边缘至少1 cm处，接种(+)交配型（NRRL 1554 或 1465）的孢子或菌丝。
      3. 在同一平板上，与第一个(+)交配型接种位置相对、且距离平板边缘至少1 cm处，放置另一个(+)交配型。
    3. 对于八亲本杂交，沿培养皿边缘交替放置交配型，每种交配型各四个（图1C）。
  7. 接种后，用封口膜密封平板（或不密封），并将平板放入次级容器中，随后在黑暗条件下22 °C培养。每日观察平板上是否出现交配迹象，在此期间从平板底部拍照，并随着菌丝生长追踪其扩展情况。
    注意：接种后24小时，预期可在所有培养基类型上观察到菌丝扩展，但此阶段个体之间通常尚未接触。
  8. 根据培养基类型（PDA或CMA）及浓度（25%、50%、100%），当菌丝开始接触时，应在解剖显微镜下检查互补交配型接触区域的菌丝是否有交配迹象。使用相机或固定在解剖显微镜上的智能手机拍摄相互作用的菌丝图像。
    1. 获取菌丝图像并进行拼接（例如使用Panorama Stitcher应用程序）。使用ImageJ软件估算菌丝覆盖面积（参见在线教程）。

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结果

经过四亲本杂交后，各菌株的生长速率略有差异，通过菌丝体面积的变化来确定（图2）。尽管差异未达到统计学显著性，NRRL 1555 在 25% CMA、25% PDA 或 100% PDA 培养基上接种时，其面积变化较快。同样，NRRL 1465 在 50% PDA 或 CMA 培养基上生长时，面积变化较大。NRRL 1464 在 100% CMA 培养基上生长时，面积增长最快。接种24小时后（1 DPI），在 PDA 培养基上生长的菌株相比在 CMA 培养基上生长的菌株呈现更明显的黄色（图3）——此前已有研究表明 PDA 可促进色素生成26。在 24 小时后，生长于 100% PDA 培养基上的菌株平均面积更大（表1）。相比之下，在 25% CMA 培养基上的菌株在 1 DPI 时平均面积最小（表1）。

直到接种后第2天（2 DPI），才观察到相邻菌株...

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讨论

本文介绍了一种在实验室条件下诱导P. blakesleeanus进行有性生殖的简单实验方案。该方案最关键的考虑因素之一是营养限制。人们推测，真菌将有性生殖作为一种应对恶劣环境条件（如营养限制）的适应机制6,28,29,30,31,32。调节营养水平有助于优化实验设计。例如，若研究人员希望比较气生接合孢子囊柄与配子囊中表达的基因，则建议采用更严格的营养限制条件（如25% CMA），因为在该条件下有性结构的密度较使用较高浓度CMA或PDA时更低。较低的有性结构密度（如在50%或25% CMA条件下所观察到的）不仅使特定分化细胞类型的分离更为容易（细胞更易识别和切割），还能确保仅采集到目标细胞类型。

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

我们感谢科罗拉多学院自然科学执行委员会、生物体生物学与生态学系以及Hevey家族学生研究基金对本工作的资助。同时，我们向Alice Keller和Tia Hutchens致以诚挚谢意，感谢她们提供的技术支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
琼脂粉ThermoFisher3453PK
氯霉素FisherSciBP904-100
玉米粉琼脂Carolina742460
Panorama StitcherApple App Store
Phycomyces blakesleeanus (-) NRRL 1555美国农业部-农业研究服务局1555USDA-ARS 仅向学术研究人员发货；替代来源见下文
Phycomyces blakesleeanus (-) NRRL 1564美国农业部-农业研究服务局1564USDA-ARS 仅向学术研究人员发货；替代来源见下文
Phycomyces blakesleeanus (-) 试管培养物Carolina Biological Supply156183可购买教学级培养物；对应 NRRL 1555
Phycomyces blakesleeanus (+) NRRL 1554美国农业部-农业研究服务局1554USDA-ARS 仅向学术研究人员发货；替代来源见下文
Phycomyces blakesleeanus (+) NRRL 1565美国农业部-农业研究服务局1565USDA-ARS 仅向学术研究人员发货；替代来源见下文
Phycomyces blakesleeanus (+) 试管培养物Carolina156182可购买教学级培养物；对应 NRRL 1554
马铃薯葡萄糖琼脂FisherSciDF0013-17-6
Sprout Plus Mini 离心机Heathrow ScientificSKU 120610
Tween 20Sigma-AldrichP6585-10ML

参考文献

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