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方法文章

直接冷冻切片 果蝇 用于增强脑组织荧光染色与免疫染色的头部装置

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DOI：

10.3791/67791

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2025年2月7日

 ,  , 
1Department of Pathology, Division of Molecular and Cellular Pathology, Heersink School of Medicine, The University of Alabama at Birmingham, 2Department of Neurobiology, Heersink School of Medicine, The University of Alabama at Birmingham, 3UAB Nathan Shock Center

本文内容

摘要

本研究介绍了一种简化的组织处理流程，包括断头、固定、冷冻切片、荧光染色、免疫染色和成像，该方法可进一步扩展至共聚焦和多光子成像。该技术具有与复杂解剖方法相当的效率，且无需依赖高超的手术操作技能。定量图像分析为其提供了广泛的研究潜力。

摘要

对黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）大脑进行免疫染色，对于研究复杂行为、神经回路及蛋白质表达模式背后的机制至关重要。传统方法常面临诸多挑战，例如复杂的解剖操作、组织完整性的维持，以及在高分辨率成像过程中特异性表达模式的可视化。本文介绍一种优化后的实验方案，结合了冷冻切片、荧光染色与免疫染色技术。该方法可改善组织保存效果和信号清晰度，减少果蝇大脑成像过程中繁琐的解剖步骤。本方法包括快速解剖、最佳固定、冷冻保护及冷冻切片，随后进行荧光染色和免疫染色。该方案显著降低了组织损伤，增强了抗体渗透性，并获得清晰、轮廓分明的图像。我们通过高保真地可视化特定神经元群体和突触蛋白，验证了该方法的有效性。这一多功能方法可实现对成年果蝇大脑中多种蛋白质标记物在多个z平面的分析，并可适用于其他组织和模式生物。本方案为开展高质量果蝇神经生物学研究中的免疫组织化学实验提供了可靠且高效的工具。该方法的精细可视化能力有助于对神经解剖学、病理学及蛋白质定位进行系统性分析，因而在神经科学研究中具有重要价值。

引言

从社会互动1、感觉信息的感知与处理2、学习3到运动4等复杂行为均由大脑驱动。神经系统疾病也日益普遍，并且预计会随着时间推移而增加5,6。研究大脑在健康与疾病状态下的工作机制至关重要。分子生物学的中心法则指出，生物功能单位最重要的功能之一由蛋白质执行7，而蛋白质的表达量及其表达位置对于理解大脑功能至关重要。

黑腹果蝇，俗称果蝇，是研究衰老及病理生理条件下脑功能的极具价值的模式生物8先进的遗传工具的可获得性 果蝇 使研究人员能够探索几乎任何蛋白质的功能9，几乎每个基因的全面基因文库均可轻松获取10结合其较短的生命周期和较高的繁殖率，这些特征使得 果蝇 脑科学研究的卓越模型11这已带来重大成果，包括绘制出果蝇的完整脑图谱12，甚至因阐明昼夜节律和分子钟的神经机制而为诺贝尔奖的获得作出贡献13,14,15因此， 果蝇 仍然是一个强大而多功能的系统，推动着我们对大脑功能的理解，并为神经系统过程提供了前所未有的洞察。

免疫组织化学和免疫荧光是研究蛋白质表达的基础工具 原位 与只能进行半定量分析且通常在整体组织上进行的蛋白质印迹（Western Blot）等技术相比16，或使用质谱等复杂且昂贵的技术来检测蛋白质水平17，免疫组织化学相对简单，既可定量蛋白质表达水平，也可检测蛋白质在组织或细胞内的定位。重要的是，荧光免疫组织化学还可进行多重检测，以同时测量多种蛋白质，从而鉴定特定细胞类型和组织，或在同一组织样本中回答多个科学问题。此外，通过组织固定可实现不同实验条件、基因型、年龄及昼夜节律时间点之间的比较。然而，荧光免疫组织化学技术具有一定的挑战性，多种因素可能影响成像质量。本优化的冷冻切片与免疫染色方案适用于 果蝇 旨在通过改善组织保存、抗体渗透以及神经元群和蛋白质标志物的可视化，来提升高分辨率成像效果。该方法针对传统技术中存在的复杂解剖过程、组织损伤以及全脑样本成像分辨率受限等问题而开发18该方案结合冷冻切片与荧光染色技术，以确保在多个z平面中保持结构完整性并实现清晰成像。与整体封片制备相比，该方法可最大限度减少形变，促进抗体更深层渗透，从而提供清晰的神经解剖学及蛋白质定位分析。18其多功能性可适用于其他组织和模式生物，为神经科学研究提供了一种可靠且高效的工具19,20它可以被用于研究几乎任何蛋白质，并可应用于各种条件、疾病或模型的研究。

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方案

1. 仪器设备的准备

  1. 确保冷冻切片机已开启并设置为 -20 °C。开启载玻片加热器或小型培养箱，并将其温度设置为 37 °C。
    注意：在此阶段，已标记的载玻片可放置于加热器或培养箱中，可无限期保存直至进行切片。

2. 溶液的配制

  1. 从10倍浓度磷酸盐缓冲液（PBS）储备液配制50 mL 1倍浓度磷酸盐缓冲液（PBS），pH 7.4。用PBS配制终体积为10 mL的4%多聚甲醛溶液。
  2. 在喷雾瓶中配制70%乙醇水溶液作为清洁液。配制封闭液（用20倍浓度Tris缓冲盐水储备液配制含3%牛血清白蛋白（BSA）的Tris缓冲盐水）。配制一抗溶液（稀释比例根据实验而定）。此处使用ApoE小鼠抗体在含3% BSA的TBS中1:250稀释的溶液。
  3. 配制二抗溶液（稀释比例根据实验而定）。此处使用Alexa Flour 750 A21037山羊抗小鼠二抗在含3% BSA的TBS中1:500稀释的溶液。
  4. 配制荧光染料溶液（稀释比例根据实验而定）。此处配制5 µg/mL Nile Red的PBS溶液。
    注意：所有溶液，尤其是荧光溶液，应冷藏并保存在避光冷藏容器中。使用前需恢复至室温。

3. 组织采集

  1. 在获得老化培养瓶中的果蝇后，打开 CO2 麻醉垫的阀门，迅速将果蝇倾倒至麻醉垫上，以避免其逃逸。等待果蝇基本失去意识，几乎不再活动。通过移动载物垫将果蝇置于 SZ61 显微镜物镜下方，调节放大倍数和焦距，使果蝇清晰可见且便于进行断头操作。
    注意：本示例所用果蝇为 ELAV/+ 和 ELAV>ApoE4
  2. 将弹簧剪插入果蝇胸部与头部之间，用力夹紧，每实验组剪下 5 至 10 个果蝇头部。将未使用的果蝇放回其老化培养瓶中。
    注意：若担心固定剂渗透不充分，可在步骤 4.1 中对头部后部做一小切口，以增强固定剂的渗透。
  3. 使用毛刷将头部轻柔转移至预贴标签并置于冰上的 1.5 mL 离心管中，直至 ELAV/+ 和 ELAV>ApoE4 各组样本收集完毕。

4. 组织整体固定

  1. 从冰上取出离心管，每管加入100 µL含4%多聚甲醛的PBS溶液，确保所有头部组织完全浸没于溶液中。若头部组织粘附在管壁上而未能接触溶液，可用毛刷轻轻将其推入液面下，或轻敲管子使其接触溶液。
  2. 将离心管置于摇床上，以中等速度振荡15分钟。15分钟后，弃去多聚甲醛溶液，每管加入1×PBS溶液孵育10分钟，确保所有头部组织浸没于溶液中。
  3. 每次均弃去前一步的溶液，用PBS溶液洗涤组织3次，每次10分钟，共洗涤3次。
  4. 最后一次洗涤后，将头部组织转移至含10%蔗糖的PBS溶液中，确保组织完全浸没于管内液体中，并于4℃过夜孵育以实现充分饱和。
    注意：若需当天成像，可缩短蔗糖渗透时间；但相应的冷冻保护效果也会相应减弱。

5. 模具制备

  1. 将最佳切割温度（OCT）包埋剂注入已标记的模具中，填充至约50%，使其扩散至模具的四个角落。
  2. 使用刷子小心地将头部样本放置于模具内OCT的表面。当将多个实验组放入同一模具时，应确保各组在模具内相互分隔，以避免混淆。
    注意：务必防止刷子携带先前的蔗糖溶液污染OCT，导致其稀释。此外，使用刷子将样本压入OCT深处可能在头部周围产生大量气泡。应避免这些错误，以防后续切片出现问题。
  3. 使用镊子尖端，缓慢将每个头部推至模具底部，使眼睛朝向底部。此方向选择用于冠状面切片。
  4. 在此过程中避免头部被刺破或压碎。在X、Y和Z三个维度上对齐所有头部，确保每个切片同时包含所有样本。应缓慢浸入以减少气泡形成。
  5. 当所有头部均正确对齐后，小心地将模具直接放入-20 °C环境中冷冻。
    注意：若在切片过程中发现头部对齐明显偏差，可考虑使用干冰或液氮对模具进行快速初始冷冻。
  6. 当模具基本冻结后，用OCT填充剩余空间，并在长期储存于-80 °C前完成冻结。

6. 模具的冷冻切片

注意：通常建议在切割实验组模具之前，先制备并切割一个空白模具。这可以在对组织进行切片前立即确保轮子、刀片和防滚玻璃的正常功能。

  1. 在模具上涂抹足量的OCT包埋剂，将卡盘头置于其上并压平，以将卡盘头固定在模具上。将模具放入冷冻切片机中完全冷冻，通常在5分钟内完成。
  2. 将卡盘头及OCT冻块从模具中取出，放入卡盘中，确保模具保持从上到下的正确方向。用卡盘钥匙拧紧，直至卡盘头固定牢固。
  3. 使用调节旋钮和卡盘深度控制装置，将组织块与刀片对齐。
  4. 将切片厚度设为20 µm。以缓慢但稳定的速度进行切片，使防卷板玻璃捕获每一片切片。使用预热的载玻片收集切片：将载玻片接触切片的近端边缘，使切片自然卷附到载玻片上。当适当留出间距时，标准尺寸的载玻片（25 mm × 75 mm × 1 mm）最多可容纳八片切片。
    注意：在选择收集哪些切片时需做出判断。由于包埋方向的关系，较早切出的切片来自头部的前部区域，而较晚切出的切片则来自后部区域。因此，若对某一特定区域更感兴趣，可相应调整切片的选择。或者，也可将所有切片依次收集在多张载玻片上，直至组织完全切完。
  5. 让载玻片在室温下干燥至少30分钟，但不超过1小时。

7. 染色与免疫组织化学（IHC）

注意：本方案将详细说明使用未标记的一抗进行免疫组化染色的方法。若需同时使用荧光染料标记的抗体或其他可在单步完成的荧光染色剂，应将其与二抗共同使用。

  1. 干燥结束后，立即用刀片去除载玻片边缘的OCT包埋剂，为疏水边界留出空间。使用 标记笔在每张载玻片上画出疏水边界。静置使其干燥5分钟。
  2. 用PBS轻轻吹打载玻片表面，对所有载玻片进行洗涤，每次5分钟，共洗涤3次，尽可能避免将液体直接加在组织上。
    注意：此处使用1000 µL移液器最为合适。一张带有组织的标准尺寸载玻片，完全覆盖所需溶液量约为750 µL。也可使用载玻片架和容器进行操作。
  3. 载玻片洗涤后，将含3% BSA的TBS封闭液滴加至载玻片上。室温孵育30分钟。
  4. 弃去封闭液，滴加 一抗溶液。本实验中使用的是在含3% BSA的TBS中按1:250稀释的SC-13521 ApoE抗体。4 °C过夜孵育，或室温孵育1小时。使用湿润的擦拭纸或纸巾覆盖以防止溶液在过夜孵育期间干燥。
  5. 弃去一抗溶液，用移液器以PBS洗涤3次，每次5分钟。
  6. 加入二抗溶液。本实验中使用的是在含3% BSA的TBS中按1:500稀释的AF 750山羊抗小鼠抗体，同时加入浓度为5 µg/mL的尼罗红染料。室温孵育1小时。
    注意：我们将荧光染料与二抗同时在同一种缓冲液（含3% BSA的TBS）中孵育。只要两种试剂之间无已知干扰，此方法为首选。若存在干扰，则应分别孵育，并在两次孵育之间增加额外的3次洗涤步骤。
  7. 用PBS洗涤载玻片3次，每次5分钟。最后一次洗涤后，在载玻片上保留 少量PBS。

8. 成像用样品的封片与制备

  1. 使用 1000 µL 移液器，将 3–5 滴含 DAPI（0.9 µg/mL）的硬化封片介质均匀滴加到载玻片上，避免直接滴在组织上。
  2. 将盖玻片盖在载玻片上，避免产生气泡。
    注意：使用镊子有助于操作，可使盖玻片先滑至载玻片表面附近，再缓慢释放。
  3. 小心处理新封片的载玻片，并将其平放保存直至完全干燥。若需长期保存，应用指甲油密封。
  4. 应尽快采集图像，以避免荧光衰减。

9. 图像采集

注意：图像采集将详细介绍使用 Olympus Cell Sense Dimensions 软件的操作方法。

  1. 成像前，检查载玻片并用70%乙醇水溶液擦拭。若封片后立即进行成像，清洁时需格外小心，避免扰动盖玻片。在成像前，让载玻片和盖玻片表面干燥5分钟。
  2. 选择每个需要采集的通道，本例中为DAPI、尼罗红（Nile Red）和AF 750通道。
    1. 按以下说明选择所需放大倍数。放大倍数的选择取决于实验设计；此处使用10倍放大倍数。
      注意：所有放大倍数均可使用，包括油镜。如需要，可在载玻片表面滴加浸油。
    2. 针对每个通道，根据实验中荧光最强的样本校准合适的曝光时间。在尽可能获得明亮图像的同时，避免过度曝光。
      注意：通常导致成像质量差的两个主要因素是过度曝光（导致细节丢失）和背景信号过高（难以与真实信号区分）。此外，每种不同的放大倍数都必须独立设置曝光参数。
    3. 在菜单中选择保存文件夹并命名合并后的图像。采集完成后，所有图像将保存在此文件夹中，并使用此处定义的名称。
    4. 开始采集图像时，首先在能够提供最佳焦平面的通道中对样本进行聚焦，然后开始采集。为保证实验一致性，后续每个样本均应在同一通道中进行聚焦。
    5. 所有用于后续比较的实验组应在同一天内完成成像，以避免不同组间因荧光衰减而产生偏差。

10. 定量分析

注意：定量分析可使用多种软件完成。本文以 Olympus CellSense Dimensions 软件为例进行说明。

  1. 采集完成后，检查图像。将存在缺陷 或切片伪影 的图像从定量分析文件夹中移除。选择能够反映定量目标的图像。常见的缺陷包括气泡、组织撕裂、组织重叠以及灰尘或碎屑。
    1. 为选择合适的图像，应确保所有包含脑组织的图像均用于定量分析，以反映全脑范围内的整体表达情况。或者，仅选择反映前脑、中脑或后脑的图像，以揭示这些区域间表达差异。
  2. 在计数与测量菜单中，确定图像定量所需的感兴趣参数及其边界条件。
    1. 若需通过平均强度值比较进行ApoE表达的定量分析，应设置阈值范围，使该通道的所有像素均被纳入分析（0至无穷大）。此外，使用可用的绘图工具勾画出感兴趣区域。
  3. 对所有文件进行批量处理，或对每张图像单独执行计数与测量。
    1. 进行批量处理时，先记录定量分析的设置与执行过程，然后选择目标文件夹以执行定量分析。批量处理可通过宏管理器选项卡实现，可显著加快工作流程。
  4. 将数据表导出至电子表格以便作图。可通过计数与测量结果菜单完成此操作，或在批量处理时自动打开或导出为表格。这些数据表将包含步骤10.2中选定的全部参数。
  5. 进行统计分析与绘图时，可直接使用电子表格软件或其他软件进行数据可视化。熟练掌握所用软件对于准确呈现实验结果至关重要。本示例中，将突变体脑内ApoE表达的绝对强度值相对于对照组进行归一化，随后使用GraphPad Prism进行作图。

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结果

上述方法可实现对成年果蝇大脑进行可靠且无需繁琐解剖的荧光成像。如图1所示，该方法操作简便，只要所有样本、仪器和材料准备就绪，即可快速完成。此外，在OCT包埋模具阶段可将样本储存于-80 °C，数周后仍可使用。研究人员无需经过长期培训即可掌握这一简单的解剖与包埋技术，因此该方法具有很高的可及性。

使用该方法进行荧光显微镜观察的示例如图2A-D所示。抗体标签（ApoE）和荧光染料（尼罗红）的表达均清晰明确。此外，也可观察到脑组织具有较高的完整性。可进一步利用常见的图像处理软件功能（如去卷积）来提高图像清晰度，该效果也在图2A'-D'中展示。去卷积有助于提高图像的锐度和对比度，并降低噪声。

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讨论

此处，我们介绍一种对冷冻切片进行精确荧光成像的实验方案 黑腹果蝇 头部。这是一种直接的方法，具有多个重要优势：方法简单，任何具备基本实验室安全培训的人员均可操作；可灵活用于检测任何存在高质量抗体的目标蛋白的表达；并且能够精确定量目标蛋白的表达量及其在头部各区域的表达位置。如果组织和图像质量足够高，该方法还可能实现整个头部蛋白表达的三维定位 mapping 果蝇 头部

与技术上较为复杂的脑组织分离后结合共聚焦显微镜成像的方法不同，本方案可实现对整个 Drosophila 头部的成像，而不仅限于脑部。这一点尤为重要，因为果蝇视觉系统是研究神经元功能的重要模型21，但在脑组织分离过程中，部分结构可能丢失。此外，该方法可在同一组织切片中提供内部对照组织，例如喙器肌肉，以判断目标蛋白的表达是否特异性存在于特定细胞类型或组织类型中22。这使得不同组织之间能够进行直接比较，避免了使用不同切片时可能因实验条件微小差异而带来的影响。本方案的另一优势在于...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢Melkani实验室成员在制定本方案过程中提供的宝贵反馈和帮助。果蝇品系Elav-Gal4（BL#458）和UAS-ApoE4（BL#76607）来自美国印第安纳州布卢明顿市的布卢明顿 Drosophila 品系中心（Bloomington, IN, USA）。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助，项目编号为AG065992和RF1NS133378，授予G.C.M.。本研究还获得了阿拉巴马大学伯明翰分校（UAB）启动资金3123226和3123227对G.C.M.的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1000 µL 移液器Eppendorf3123000063
1000 µL 移液器吸头Olympus Plastics23-165R
10X 磷酸盐缓冲液（PBS）FisherJ62036.K7pH=7.4
200 证明乙醇Decon Laboratories64-17-5
20X Tris 缓冲盐水Thermo ScientificJ60877.K2pH=7.4
AF750 山羊抗小鼠二抗Alexa FluorA21037
防卷曲玻璃片IMEBAR-14047742497
ApoE 小鼠一抗Santa CruzSC13521
牛血清白蛋白Fisher9048-46-8
1.5 mL 离心管Fisher05-408-129
带电载玻片Globe Scientific1415-15
冷冻切片模具Fisher2363553
冷冻切片机LeicaCM 3050 S
冷冻切片机刀片C.L. SturkeyDT554N50
蒸馏水
干冰??????
精细镊子Fine Science Tools11254-20
果蝇操作垫Tritech ResearchMINJ-DROS-FP
含 DAPI 的硬化封片介质VectashieldH-1800
吸水纸（Kimwipes）Kimtech34120
显微镜OlympusSZ61
Nile Red SigmaN3013
最佳切割温度包埋剂（OCT）Fisher4585
旋转摇床OHAUSSHLD0415DG
20% 多聚甲醛Electron Microscopy Sciences15713
剃须刀片Gravey#40475
弹簧剪Fine Science Tools15000-10
蔗糖FisherS5-500

参考文献

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