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方法文章

用于研究创伤性脑损伤中出血与炎症的刺伤小鼠模型

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DOI：

10.3791/67797

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2025年2月21日

 ,  ,  , 
1Institute for Human Life Science, Ochanomizu University, 2Kitasato University School of Frontier Engineering

本文内容

摘要

简化的创伤性脑损伤（TBI）模型促进了治疗策略的开发。本方案概述了使用针头在小鼠大脑皮层制造刺伤损伤的方法，可用于分析出血和炎症反应。这种刺伤型TBI小鼠模型的优势在于无需特殊设备即可实施。

摘要

创伤性脑损伤（TBI）由物理损伤引起，通常源于事故或运动相关事件。TBI 的病因多样，包括脑震荡、脑挫伤、血肿和颅骨骨折。为了模拟这些不同的病因，研究人员已开发出多种小鼠 TBI 模型，采用不同的实验方案。脑部物理损伤会导致原发性和继发性脑损伤，从而加剧神经元丢失。原发性损伤在损伤后立即发生，常由出血引起，并继而触发继发性损伤，包括病灶周围的炎症反应。因此，建立一种适用于评估出血范围和炎症严重程度的 TBI 模型至关重要。本实验方案介绍了一种模拟穿透性脑损伤的方法，即刺伤型 TBI 小鼠模型，用于研究与 TBI 病理相关的出血、炎症及神经元丢失机制。该模型通过针头穿刺颅骨和脑组织构建，操作简便，无需特殊实验设备。此外，使用针头对小鼠大脑皮层造成的轻微损伤不会影响术后动物的行为。这一特点使研究人员能够在不担心广泛行为学影响的前提下，研究脑损伤的局部效应。来自刺伤后小鼠大脑皮层的示例数据显示，该模型在评估血液渗入脑实质、胶质细胞活化以及炎症细胞因子产生方面具有良好的有效性。此外，本方案有助于评估止血剂和抗炎化合物，从而推动 TBI 治疗药物的研发。

引言

创伤性脑损伤（TBI）由物理损伤引起，通常源于事故，包括交通事故和跌倒事故。TBI 分为两种类型：穿透性脑损伤，指锐器刺穿颅骨并损伤脑组织；以及闭合性脑损伤，指脑组织在颅腔内剧烈震荡所致，但颅骨未发生破裂1。

创伤性脑损伤（TBI）的病因多种多样，包括脑震荡、脑挫伤、血肿和颅骨骨折；因此，已开发出多种小鼠模型，采用不同的实验方案来模拟这些不同的致伤原因。例如，重复性脑震荡TBI模型通过脑部震荡实现，即使用电磁控制的橡胶撞击器对小鼠进行多次撞击2。此外，在落锤式TBI模型中，通过标准化的落锤装置对头部施加强烈的外部冲击力，导致颅骨完整情况下的局灶性钝性损伤3。另外，穿刺性TBI模型则是通过针头穿刺颅骨和脑组织而制备4（图1A）。由于已开发出多种TBI模型，因此应根据需要观察的具体病理特征来选择合适的模型。

由物理损伤引起的脑损伤会导致原发性和继发性脑损伤，从而进一步加剧神经元的丢失。原发性损伤发生在损伤后即刻，由血脑屏障（BBB）破坏、出血和血肿所致。因此，减少出血和血肿扩大至关重要，因为这些因素可能加重创伤性脑损伤（TBI）症状的严重程度。继发性损伤由脑实质内的血液成分触发，随后导致病灶周围发生炎症5。脑损伤后的预后取决于炎症动态变化；因此，迅速减轻原发性和继发性损伤对于获得良好预后至关重要6,7,8。

血脑屏障（BBB）由周细胞、内皮细胞之间的紧密连接以及星形胶质细胞的终足共同构成，这些结构协同作用，限制健康大脑中血管内物质的渗漏9。在本研究所采用的刺伤模型中，血脑屏障受到物理性破坏。评估血脑屏障完整性的常用方法包括免疫球蛋白G（IgG）染色以及检测荧光示踪剂（如伊文思蓝和葡聚糖）的渗漏情况10,11。IgG染色可标记从损伤部位渗出并沉积于脑组织中的血液成分。随着血脑屏障的恢复，血液成分向脑组织的渗漏逐渐减少，这些沉积物也被逐步降解。因此，IgG染色可用于评估脑损伤后血脑屏障的恢复程度。此外，静脉注射示踪剂向脑实质的渗漏水平也反映了血脑屏障的恢复情况。该方法能够更清晰地评估血脑屏障的动态变化，因为示踪剂的渗漏直接体现了血液成分从血液循环进入脑实质的过程。同时，减少出血可减轻原发性损伤，这一过程依赖于快速的血液凝固和及时的纤维蛋白溶解。因此，定量分析凝血和纤溶调控因子的表达水平是研究该过程的有效手段。在凝血的分子机制方面，脑损伤后的出血通过纤维蛋白的形成而停止。随后，富含纤维蛋白的血栓被组织型纤溶酶原激活物（tPA）和尿激酶型纤溶酶原激活物（uPA）降解。在刺伤型创伤性脑损伤（TBI）小鼠模型中，纤维蛋白的形成在损伤后第1天达到峰值，之后逐渐减少10。因此，通过定量分析血液成分和示踪剂向脑实质的外渗情况，以及凝血因子的表达水平，可预测血脑屏障的恢复程度。

继发性损伤过程中炎症的量化方法包括胶质细胞活化和炎症性细胞因子的表达。持续性炎症主要由病灶周围小胶质细胞和星形胶质细胞过度聚集所引发。例如，在脑穿刺损伤（stab-wound TBI）模型中，穿刺伤口会刺激病灶周围胶质细胞重新活化，以清除细胞碎片和血液成分。这种胶质细胞的再活化通常在穿刺损伤后第3天达到高峰12,13。除了吞噬功能外，再活化的胶质细胞还会分泌过量的炎症性细胞因子，导致病灶周围神经元丢失14。已有研究报道，减轻胶质细胞介导的炎症反应有助于改善脑损伤后的预后12,14。确定炎症水平对于评估损伤严重程度和预后具有重要意义。因此，建立一种适用于评估出血范围和炎症严重程度的TBI模型至关重要。本研究介绍了一种模拟穿透性脑损伤的小鼠穿刺损伤模型，旨在研究TBI病理过程中出血、炎症及神经元丢失的机制。

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方案

所有动物护理方案均经日本御茶水女子大学机构动物护理与使用委员会批准，并遵循日本文部科学省制定的指南进行。实验使用6周龄成年雌性C57BL/6J小鼠（20-25 g）。所有小鼠均在清洁环境中自由摄食和饮水。所用试剂与设备的详细信息见《材料表》。

1. 大脑皮层刺伤手术

  1. 试剂准备
    注意：麻醉方案与先前描述的类似15。如果动物设施推荐特定的麻醉剂，请遵循其说明。此前已证实戊巴比妥钠对大脑皮层穿刺损伤手术有效4,13,16,17。
    1. 复合麻醉剂MMB：将1.875 mL的1 mg/mL美托咪啶、2.0 mL的5 mg/mL咪达唑仑和2.5 mL的5 mg/mL酒石酸布托啡诺溶于18.625 mL磷酸盐缓冲液（PBS）中，配制成总体积为25 mL的溶液。该混合液中含美托咪啶75 mg/L、咪达唑仑400 mg/L和酒石酸布托啡诺500 mg/L。使用前于4 °C保存，最长可保存8周。
    2. 麻醉拮抗剂：将150 μL的5 mg/mL盐酸阿替美唑溶于9.85 mL PBS中，配制成总体积为10 mL、浓度为75 mg/L的盐酸阿替美唑溶液。使用前于4 °C避光保存，最长可保存8周。
  2. 手术步骤
    1. 小鼠麻醉：先用浸有异氟烷吸入麻醉液的纸巾对小鼠进行短暂麻醉，直至其入睡。随后使用1 mL注射器配合27 G x 3/4"针头，按10 μL/g剂量腹腔注射复合麻醉剂MMB。3–5分钟后，通过脚趾夹捏试验和翻正反射检查确认麻醉效果。
      注意：使用异氟烷吸入麻醉液时，务必密切注意避免麻醉过量。
    2. 将小鼠俯卧位放置于纸巾上。转移后，再次通过脚趾夹捏确认小鼠仍处于麻醉状态。
    3. 剃除枕部皮肤上的毛发。用棉签蘸取70%乙醇对小鼠头部背面的毛发进行消毒。用钝头镊夹住枕部皮肤，做1.0–1.5 mm宽的切口，暴露枕骨，注意不要损伤颅骨或任何器官。轻柔缓慢地撑开切口，透过颅骨观察大脑皮层与小脑之间的边界（图1B）。
      注意：对于无损伤对照组小鼠，应确保颅骨和脑组织均未受到损伤。
    4. 小鼠开颅：使用19 G x 1•1/2"针头在枕骨右侧半球钻一小孔。轻柔旋转针头以形成穿刺针插入点，注意避免损伤脑实质。该孔应位于右侧半球耳间线在人字缝与边缘之间中点处（图1B）。此孔将作为下一步穿刺针插入的引导孔。
    5. 穿刺损伤：从上述插入点插入27 G x 3/4"针头，沿前后轴方向刺入大脑皮层（图1B,C）。将针头插入至接触颅骨前壁后，再轻轻撤出。合适的插入深度应使针头可在大脑皮层表面被观察到。大脑皮层左侧作为未损伤对照侧。
    6. 使用1/2圆针配合尼龙3-0缝线缝合皮肤切口。
    7. 按10 μL/g剂量腹腔注射麻醉拮抗剂以逆转复合麻醉剂MMB的作用。注射麻醉拮抗剂后8–16小时内，小鼠应能恢复行走能力。

2. 出血及血脑屏障破坏后恢复的评估

  1. 小鼠脑部刺伤切片的免疫酶染色以检测 IgG 渗漏
    注意：此处使用载玻片固定的冷冻脑切片。游离的冷冻脑切片也适用于本方案。
    1. 小鼠麻醉：将小鼠置于含异氟烷吸入液的浸湿滤纸附近以诱导麻醉，直至小鼠入睡。随后立即给予100 μL/kg 剂量的 MMB 复合麻醉剂腹腔注射。通过足趾夹捏试验和翻正反射确认麻醉效果。
    2. 将小鼠仰卧放置，并用针固定其双侧前肢和后肢于解剖板上。
    3. 小鼠开胸术：使用钝头镊夹住腹部皮肤，切开1.0–1.5 cm的切口，穿透皮肤和腹膜，暴露肋骨。用剪刀小心打开肋骨，避免损伤心脏，以暴露心脏进行灌注。
    4. 心脏灌注固定：准备一台蠕动灌注泵，并连接一根带有19 G x 1的管道•1/2" 一端接上针头。使用前打开泵，用 PBS 充满管道。然后在泵运行的同时，将针头插入左心室，并用镊子固定。在右心房处做一个 0.5–1.0 mm 的切口。对小鼠进行灌注18 以每分钟4-6 mL的速度灌注至少20 mL PBS，持续5分钟，以清除血液。
    5. 停止泵并转移管道至含4%多聚甲醛（PFA）的PBS溶液中。重新启动泵，以4-6 mL/min的流速持续灌注至少20 mL的4% PFA PBS溶液，进行5分钟的固定。18.
      注意：如果无泵可用，也可使用50 mL注射器连接19 G × 1•1/2" 灌注用针头
    6. 脑组织解剖：将小鼠腹侧朝下置于解剖板上，沿皮肤正中线从枕部至鼻部做切口，暴露颅骨。用剪刀小心去除颅骨，完全暴露脑组织，注意避免损伤脑组织。用弯头镊轻轻提起脑组织，转移至含有10 mL PBS配制的4% PFA的15 mL离心管中。
    7. 将分离的脑组织在4%多聚甲醛PBS溶液中4℃过夜孵育 °C代表完全固定。随后，将脑组织在含有10 mL 15%蔗糖的PBS中孵育过夜，并转移至含有10 mL 30%蔗糖的PBS中，在摇床（seesaw shaker）上继续孵育一天。这种逐步的蔗糖置换有助于防止脑组织在后续冷冻保存时因冰晶形成而受损。
    8. 脑组织包埋：将脑组织在组织包埋模具中以包埋介质进行冠状面包埋，随后使用干冰冷却的2-甲基丁烷冷冻19.
    9. 冷冻脑切片：使用冷冻切片机，制备连续冠状切面（20 μm厚的包埋脑组织切片置于正电荷载玻片上。脑切片在室温下空气干燥过夜，随后储存于-80 °C 冷冻室
    10. 封闭液配制：将10%新生小牛血清、30 mg/mL牛血清白蛋白、10 mg/mL甘氨酸和0.4% Triton X-100溶于TBS中，配制封闭液。4℃保存 °使用前于4°C保存最多2周。
    11. 小鼠 IgG 染色：将刺伤后的大脑皮层切片在室温下晾干 1 小时后，用 500 μ每张切片加入 4% PFA 溶液 1 L，孵育 30 分钟。随后用 PBS 洗涤切片（500 μL/载玻片）5 分钟，随后用 Tris 缓冲盐水（TBS，500 μ每次5分钟，离心。
      注意：所有操作均需在保湿盒中进行，以防止缓冲液蒸发。
    12. 用含10%甲醇和3%过氧化氢的TBS溶液孵育切片5分钟，以淬灭内源性酶活性，随后用Tris缓冲盐水（TBS，500 μ每次5分钟，离心。
    13. 使用封闭缓冲液（500 μL/载玻片）于室温孵育1小时，以防止抗体非特异性结合。随后，将切片与生物素标记的小鼠IgG抗体（用封闭缓冲液按1:300稀释，300 μL/载玻片）在室温下孵育1小时。
    14. 孵育小鼠 IgG 抗体的同时，配制混合液 1 μA试剂的L和1 μL 的 Reagent B（来自亲和素/生物素-过氧化物酶系统试剂盒）加入 300 μL 的封闭缓冲液。将此混合物在室温下孵育 30 分钟后再使用。小鼠 IgG 抗体孵育完成后，用 TBS 洗涤切片，每次 5 分钟，共洗涤三次。随后，将切片与预先配制的试剂 A 和试剂 B 混合液（300 μL/载玻片）在室温下孵育1小时。
    15. 用 0.1 M Tris-HCl（pH 8.0）洗涤切片，每次 5 分钟，共洗涤三次，整个过程持续 1 小时。然后在含有 0.05% 过氧化氢的 0.1 M Tris-HCl（pH 8.0）中加入 0.05% 3,3'-二氨基联苯胺（DAB）进行显色反应（500 μL/载玻片）5分钟至1小时（图2A在显微镜下观察颜色变化，以确定反应终止时机。
    16. 用 0.1 M Tris-HCl（pH 8.0）洗涤切片，每次 5 分钟，共洗三次，然后将切片室温晾干 15 分钟。随后，将切片浸入 95% 乙醇中 2 分钟，重复两次，再浸入 100% 乙醇中 2 分钟，重复两次，进行脱水。接着将切片置于二甲苯中透明，每次 5 分钟，重复两次。使用不溶于水的封片介质封片，并使其自然干燥。
    17. 小鼠IgG染色强度分析：使用20倍物镜的显微镜拍摄切片图像。
    18. 使用 ImageJ 软件，通过测量五个随机选择的视野（8 × 8 μm2 对每张切片中免疫酶染色区域分别采集每个样本的染色强度数据。使用同一切片对侧区域的平均灰度值进行染色强度归一化处理，以无损伤区域作为背景校正。 计算五个视野中归一化平均灰度值的平均值，以确定每张切片小鼠IgG染色的平均灰度值。
  2. 评估伊文思蓝渗漏至脑实质
    注意：伊文思蓝染料实验方案与先前报道的方法类似11荧光素异硫氰酸酯（FITC）标记的葡聚糖也适用于血脑屏障破坏后的恢复研究10.
    1. 伊文思蓝注射：在处死小鼠前1小时，通过尾静脉向刺伤小鼠注射PBS配制的2%伊文思蓝溶液（3 mL/kg）。
    2. 新鲜脑组织提取：在给予伊文思蓝1小时后，按照步骤2.1.1–2.1.4所述用PBS灌注小鼠。随后，使用脑切片器将新鲜脑组织冠状面解剖并切成1 mm厚的切片。选取四片切片，切割出脑组织样本（1 mm）2 正方形（每个）以包含穿刺损伤区域或无损伤脑皮层中的完整区域，依据坐标纸图1D).
    3. 伊文思蓝定量：将四份脑组织样本收集至1.5 mL离心管中，加入200 μL生理盐水匀浆 μ使用组织研磨器将三氯乙酸加入样品中。将匀浆在10,000 x g条件下离心 g 在 4 °C 反应 20 分钟。然后，用移液器收集上清液，并用 600 μ乙醇。制备伊文思蓝的标准曲线，浓度范围为0-1.0 ng/mL，用于定量其浓度。使用酶标仪在激发波长620 nm、发射波长680 nm条件下测定荧光强度。

3. 刺伤后脑内炎症水平的评估

  1. 脑组织穿刺损伤切片中胶质细胞的免疫酶染色
    1. 脑切片的制备：按照步骤 2.1.1–2.1.9 所述方法制备脑切片载玻片。
    2. 胶质细胞染色：将穿刺损伤的脑皮层切片在空气中干燥1 h后，用4% PFA（500 μL/载玻片）孵育30分钟。随后用PBS洗涤切片（500 μL/载玻片）孵育5分钟，随后用TBS洗涤两次（每次500 μ每次5分钟，离心。
    3. 用含10%甲醇和3%过氧化氢的TBS溶液孵育切片5分钟，以淬灭内源性酶活性，随后用Tris缓冲盐水（TBS，500 μ每次5分钟，离心。
    4. 使用封闭缓冲液（500 μ在室温下用 L/slide）孵育1小时，以防止抗体的非特异性结合。
    5. 将切片与一抗（300）在4℃孵育过夜 μL/载玻片）。一抗稀释比例为：Iba1 以 1:3,000 稀释，GFAP 以 1:1,000 稀释，均用封闭缓冲液稀释。
    6. 用 TBS 洗涤切片，每次 5 分钟，共洗涤三次。然后加入生物素标记的二抗（用封闭缓冲液按 1:300 稀释，300 μL/载玻片）在室温下孵育1小时。
    7. 孵育二抗的同时，配制混合液1 μA试剂的L和1 μL 的 Reagent B（来自亲和素/生物素-过氧化物酶系统试剂盒）加入 300 μL 的封闭缓冲液。然后在使用前于室温下孵育30分钟。
    8. 二抗孵育完成后，用TBS洗涤切片三次，每次5分钟，然后将切片与预先配制的试剂A和B的混合液（300 μL/载玻片）在室温下孵育1小时。
    9. 用 0.1 M Tris-HCl（pH 8.0）洗涤切片，每次 5 分钟，共洗涤三次，整个过程持续 1 小时。然后使用含 0.05% 过氧化氢的 0.1 M Tris-HCl（pH 8.0）配制的 0.05% DAB 显色（500 μL/载玻片）孵育30分钟至3小时。在终止反应前，于显微镜下观察颜色变化。
    10. 用 0.1 M Tris-HCl（pH 8.0）洗涤切片，每次 5 分钟，共洗三次，然后将切片室温晾干 15 分钟。随后，将切片依次浸入 95% 乙醇中 2 分钟，重复两次，再浸入 100% 乙醇中 2 分钟，重复两次，进行脱水。接着将切片置于二甲苯中透明，每次 5 分钟，重复两次。使用不溶于水的封片剂封片，并使其自然干燥。使用显微镜配备 20x 物镜采集切片图像。
  2. 脑组织穿刺损伤切片的胶质细胞免疫荧光染色
    1. 脑切片的制备：按照步骤2.1.1-2.1.9所述方法制备脑切片载玻片。
    2. 胶质细胞染色：将穿刺损伤的脑皮层切片在空气中干燥1小时后，再次用4%多聚甲醛（PFA，500 μL/载玻片）孵育30分钟。随后用PBS洗涤切片（500 μL/载玻片）孵育5分钟，随后用TBS洗涤两次（每次500 μL/载玻片）各5分钟。使用封闭缓冲液（500 μ室温下用 L/slide 孵育 1 小时，以防止抗体的非特异性结合。
    3. 将切片与一抗（300）在4℃孵育过夜 μL/载玻片）。一抗使用以下稀释比例：Iba1 为 1:3,000，GFAP 为 1:1,000，用封闭缓冲液稀释。
    4. 用 TBS 洗涤切片，每次 5 分钟，共洗涤三次。然后加入荧光标记的二抗（用封闭缓冲液按 1:300 稀释，300 μL/载玻片）在室温下孵育1小时。
    5. 用 TBS 洗涤切片，每次 5 分钟，共洗涤 3 次，然后将切片与 0.4 μg/mL DAPI 溶液于 TBS 中（500 μL/载玻片）室温孵育5分钟。
    6. 用 TBS 清洗切片（500 μL/载玻片）5 分钟，然后用蒸馏水（500 μL/载玻片）5分钟。将切片晾干15分钟后，用水性封片剂封片，并静置干燥。使用共聚焦显微镜配备20倍物镜采集切片图像。
  3. 胶质细胞标志物和炎症细胞因子的实时定量聚合酶链式反应
    注意：引物序列16,20,21,22 在本方案中使用的试剂和材料列于 表1.
    1. 新鲜脑组织制备：按照步骤2.1.1–2.1.4所述，用PBS灌注小鼠。随后，使用脑组织切片器将新鲜脑组织冠状切片为厚度1 mm的切片。选取四片切片，切割出脑组织块（1 mm2 根据坐标纸，选取包含脑刺伤区域或大脑皮层对侧完整区域的正方形区域（每个区域为一个方格），确定需切割取出的组织区域，确保病灶位于其中心图1D).
    2. RNA提取：将四块脑组织收集至1.5 mL离心管中，加入1 mL TRIzol试剂，通过移液吹打进行匀浆。室温孵育5分钟。 然后，加入200 μL 氯仿，充分涡旋混匀，室温下再孵育 2 分钟。将混合物在 12,000 x g 4℃下15分钟 °C. 小心地将上层透明液体转移至新的1.5 mL离心管中，避免转移任何白色沉淀物，后者含有DNA和蛋白质。
    3. 加入500 μ加入 L 异丙醇至收集的上层，充分混匀，室温孵育 10 分钟。12,000 x g 4℃下10分钟 °C，移除上清液，加入1 mL 70%乙醇洗涤RNA沉淀。 以 7,500 x g 4℃下5分钟 °C，完全去除上清液，将沉淀物在空气中干燥10分钟。将RNA沉淀溶解于15 μL 的无 RNase 水中，于 55 ℃ 变性 RNA 10 分钟°C.
    4. 使用微量分光光度计测定 RNA 浓度。将 RNA 储存于 -80 °立即执行 C。
    5. cDNA合成：进行cDNA合成时，使用市售的DNA合成试剂盒。总共准备10 μ1.5 L 反应缓冲液 μ每个样本使用一个L型管，包含2 μ5 × RT缓冲液L，0.5 μL 的 RT 酶混合液，0.5 μ引物混合液 L，1 μg RNA 和无核酸酶水。37℃孵育 °C，15 分钟，用于逆转录反应，然后在 98°C 反应 5 分钟以灭活酶。然后，加入 90 μ将无核酸酶水 L 加入缓冲液中并充分混匀。将 cDNA 溶液储存于 -20°C.
    6. RNA表达的定量：对于实时定量PCR分析，使用市售的定量PCR预混试剂盒。通过将5 μL的预混液与每个样本混合，制备混合溶液。 μL 的 KOD SYBR qPCR Mix，0.4 μ第5步，共5步 μM 正向引物，0.4 μ第5步，共5步 μM 反向引物，以及 0.2 μ2 微升 50 倍 ROX 溶液 μ无核酸酶水 L
    7. 制备2的混合物 μcDNA 溶液的 L 和 8 μ将混合溶液 L 加入 8 孔排管中，充分混匀后离心。
    8. 以以下循环条件启动 PCR 反应：98 °C 2分钟，随后进行40个循环：98°C，10 秒，60°C，10 秒，68°C，持续30秒。使用实时定量PCR仪进行熔解/解离曲线分析步骤。
    9. mRNA表达分析：使用2-ΔΔCt法分析mRNA表达水平，该方法通过内参基因进行标准化。 Gapdh，然后与对侧进行比较23.

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结果

为了分析血脑屏障（BBB）破坏后的恢复情况，在脑损伤后第1、3、5和7天通过检测血清IgG在刺伤后大脑皮层中的外渗水平来评估出血程度。小鼠IgG染色图像显示，脑损伤后IgG在大脑皮层中出现渗漏和沉积现象。随着血脑屏障的恢复以及IgG蛋白的降解，该现象在7天后逐渐减弱（图2B）。通过测量刺伤区域周围IgG染色强度来定量IgG外渗水平，结果表明IgG外渗在脑损伤后第1天达到峰值（图2C）。除了通过IgG外渗确认血脑屏障的恢复情况外，还通过伊文思蓝渗漏实验定量评估了其向脑实质的渗出。在完整的大脑中，血脑屏障可阻止伊文思蓝从血管渗入脑组织；然而，脑损伤后血脑屏障破坏导致伊文思蓝立即在伤口周围发生渗漏（图2D）。基于荧光强度对伊文思蓝浓度进行定量的结果显示，刺伤后1小时内其浓度呈指数级上升，随后在损伤后1天和3天逐渐下降（图2E）。与上述结果一致，已有报道指出，与血脑屏障完整性和紧密连接相关的因子（如碱性磷酸酶...

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讨论

本文介绍了一种使用针头建立创伤性脑损伤（TBI）小鼠模型的实验方案。该方案可通过组织学和分子生物学方法，对脑损伤后血脑屏障（BBB）破坏及炎症反应的恢复过程进行定量评估。其他可选方案，如重复性脑震荡TBI模型和自由落体打击TBI模型，也可用于分析血脑屏障破坏和炎症反应。这些模型可在受控条件下复制TBI病理过程，包括使用专用设备精确设定冲击强度、作用范围和脑区位置等参数。此外，这些模型可在颅骨完整的情况下造成闭合性脑损伤。相比之下，本文提出的刺伤型TBI模型则模拟了伴随颅骨和脑组织损伤的穿透性脑损伤。此外，由于本方案可在较局限的范围内诱导脑损伤，因此在分析血脑屏障破坏和炎症反应时，明确定义观察区域至关重要。这正是本方案的创新之处，其得以实现的关键在于采用了比常规更细的针头25,26。另一独特优势在于，该TBI小鼠模型无需使用立体定位仪等设备即可简便建立27。

根据格拉斯哥昏迷评分（Glasgow Coma Scale, ...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢滨野彩那、山下美纪、远藤美咲、小林希诺、中平仁都对免疫组织化学和实时定量PCR提供的帮助。本研究由日本学术振兴会科研基金（JSPS KAKENHI 19K16122）、武田科学振兴财团、安斯泰来代谢障碍研究财团、三菱财团、脑科学财团以及上原纪念财团资助，资助对象为K.H.

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
19 G × 1•1/2" 针头TERUMONN-1938R 
27 G × 3/4" 针头TERUMONN-2719S
抗 GFAP 抗体Sigma-AldrichG9269
抗 Iba1 抗体Wako019-19741
盐酸阿替美唑Nippon Zenyaku Kogyo产品名称：Antisedan
生物素偶联小鼠 IgG 抗体Vector LaboratoriesBA-9200
生物素偶联兔 IgG 抗体Vector LaboratoriesBA-1000
牛血清白蛋白Nacalai Tesque01860-07
脑切片器VisikolBSLM-2
酒石酸布托啡诺Meiji Animal Health产品名称：Vetorphale 5 mg
共聚焦显微镜ZeissLSM700
冷冻切片机 LeicaCM1520
DABSigma-AldrichD5637-1G
DAPIRoche10236276001
伊文思蓝Wako056-04061
荧光偶联兔 IgG 抗体InvitrogenA-21206
Fluoromount-GInvitrogen4958-02水性封片介质
异氟烷吸入溶液Viatrisv002139
KOD SYBR qPCR MixTOYOBOQKD-201qPCR 预混试剂盒
美托咪啶Nippon Zenyaku Kogyo产品名称：Domitor
显微镜OlympusFSX100
微量分光光度计ThermoFisher ScientificNanoDrop One
咪达唑仑 10 mg/2 mLSandoz1124401A1060
MOUNT QUICKDaido SangyoDM01水不溶性封片介质
新生牛血清Gibco16010159
O.C.T. 包埋剂Sakura Finetek Japan45833包埋介质
Peel-A-Way，截断式 22 mm 方形顶模具Ted Pella27118组织包埋模具
蠕动灌注泵ATTOSJ-1211
酶标仪Fisher ScientificCytation 3
实时定量 qPCR 仪ThermoFisher ScientificStepOne Plus
ReverTra Ace qPCR RT 试剂盒TOYOBOFSQ-101cDNA 合成试剂盒
Superfrost Plus 载玻片Fisher Scientific12-550-15带正电荷载玻片
带针缝合线 AlfresaHT2003NA75-KF2
TRIzol 试剂Invitrogen15596026
VECTASTAIN ABC 标准试剂盒Vector LaboratoriesPK-4000基于亲和素/生物素的过氧化物酶系统试剂盒

参考文献

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