用于研究创伤性脑损伤中出血与炎症的刺伤小鼠模型

摘要

简化的创伤性脑损伤（TBI）模型促进了治疗策略的开发。本方案概述了使用针头在小鼠大脑皮层制造刺伤损伤的方法，可用于分析出血和炎症反应。这种刺伤型TBI小鼠模型的优势在于无需特殊设备即可实施。

摘要

创伤性脑损伤（TBI）由物理损伤引起，通常源于事故或运动相关事件。TBI 的病因多样，包括脑震荡、脑挫伤、血肿和颅骨骨折。为了模拟这些不同的病因，研究人员已开发出多种小鼠 TBI 模型，采用不同的实验方案。脑部物理损伤会导致原发性和继发性脑损伤，从而加剧神经元丢失。原发性损伤在损伤后立即发生，常由出血引起，并继而触发继发性损伤，包括病灶周围的炎症反应。因此，建立一种适用于评估出血范围和炎症严重程度的 TBI 模型至关重要。本实验方案介绍了一种模拟穿透性脑损伤的方法，即刺伤型 TBI 小鼠模型，用于研究与 TBI 病理相关的出血、炎症及神经元丢失机制。该模型通过针头穿刺颅骨和脑组织构建，操作简便，无需特殊实验设备。此外，使用针头对小鼠大脑皮层造成的轻微损伤不会影响术后动物的行为。这一特点使研究人员能够在不担心广泛行为学影响的前提下，研究脑损伤的局部效应。来自刺伤后小鼠大脑皮层的示例数据显示，该模型在评估血液渗入脑实质、胶质细胞活化以及炎症细胞因子产生方面具有良好的有效性。此外，本方案有助于评估止血剂和抗炎化合物，从而推动 TBI 治疗药物的研发。

引言

创伤性脑损伤（TBI）由物理损伤引起，通常源于事故，包括交通事故和跌倒事故。TBI 分为两种类型：穿透性脑损伤，指锐器刺穿颅骨并损伤脑组织；以及闭合性脑损伤，指脑组织在颅腔内剧烈震荡所致，但颅骨未发生破裂¹。

创伤性脑损伤（TBI）的病因多种多样，包括脑震荡、脑挫伤、血肿和颅骨骨折；因此，已开发出多种小鼠模型，采用不同的实验方案来模拟这些不同的致伤原因。例如，重复性脑震荡TBI模型通过脑部震荡实现，即使用电磁控制的橡胶撞击器对小鼠进行多次撞击²。此外，在落锤式TBI模型中，通过标准化的落锤装置对头部施加强烈的外部冲击力，导致颅骨完整情况下的局灶性钝性损伤³。另外，穿刺性TBI模型则是通过针头穿刺颅骨和脑组织而制备⁴（图1A）。由于已开发出多种TBI模型，因此应根据需要观察的具体病理特征来选择合适的模型。

由物理损伤引起的脑损伤会导致原发性和继发性脑损伤，从而进一步加剧神经元的丢失。原发性损伤发生在损伤后即刻，由血脑屏障（BBB）破坏、出血和血肿所致。因此，减少出血和血肿扩大至关重要，因为这些因素可能加重创伤性脑损伤（TBI）症状的严重程度。继发性损伤由脑实质内的血液成分触发....

方案

所有动物护理方案均经日本御茶水女子大学机构动物护理与使用委员会批准，并遵循日本文部科学省制定的指南进行。实验使用6周龄成年雌性C57BL/6J小鼠（20-25 g）。所有小鼠均在清洁环境中自由摄食和饮水。所用试剂与设备的详细信息见《材料表》。

1. 大脑皮层刺伤手术

1. 试剂准备
   注意：麻醉方案与先前描述的类似¹⁵。如果动物设施推荐特定的麻醉剂，请遵循其说明。此前已证实戊巴比妥钠对大脑皮层穿刺损伤手术有效^4,13,16,17。
   1. 复合麻醉剂MMB：将1.875 mL的1 mg/mL美托咪啶、2.0 mL的5 mg/mL咪达唑仑和2.5 mL的5 mg/mL酒石酸布托啡诺溶于18.625 mL磷酸盐缓冲液（PBS）中，配制成总体积为25 mL的溶液。该混合液中含美托咪啶75 mg/L、咪达唑仑400 mg/L和酒石酸布托啡诺500 mg/L。使用前于4 °C保存，最长可保存8周。
   2. 麻醉拮抗剂：将150 μL的5 mg/mL盐酸阿替美唑....

结果

为分析血脑屏障（BBB）破坏后的恢复情况，在脑损伤后第1、3、5和7天通过检测血清IgG的外渗水平来评估刺伤后大脑皮层的出血程度。小鼠IgG染色图像显示，脑损伤后大脑皮层出现血液渗漏和蛋白沉积。随着血脑屏障的恢复以及IgG蛋白的降解，该现象在7天后逐渐减轻（图2B）。通过测量刺伤区域周围IgG染色强度来定量IgG外渗水平，结果表明IgG外渗在脑损伤后1天达到峰值（图2C）。除了验证血脑屏障功能的恢复外，还对刺伤后伊文思蓝渗入脑实质的情况进行了定量分析。在完整脑组织中，血脑屏障可阻止伊文思蓝从血管渗出至脑组织。然而，脑损伤后血脑屏障破坏导致伊文思蓝立即在伤口周围发生渗漏（图2D）。基于荧光强度对伊文思蓝浓度进行定量的结果显示，刺伤后1小时内伊文思蓝浓度呈指数级上升，随后在损伤后1天和3天逐渐下降（图2E）。与这些结果一致，已有研究报道，与血脑屏障完整性和紧密连接相关的因子（如碱性磷酸酶和claudin-.......

讨论

本文介绍了一种使用针头建立创伤性脑损伤（TBI）小鼠模型的实验方案。该方案可通过组织学和分子生物学方法，对脑损伤后血脑屏障（BBB）破坏及炎症反应的恢复过程进行定量评估。其他可选方案，如重复性脑震荡TBI模型和自由落体打击TBI模型，也可用于分析血脑屏障破坏和炎症反应。这些模型可在受控条件下复制TBI病理过程，包括使用专用设备精确设定冲击强度、作用范围和脑区位置等参数。此外，这些模型可在颅骨完整的情况下造成闭合性脑损伤。相比之下，本文提出的刺伤型TBI模型则模拟了伴随颅骨和脑组织损伤的穿透性脑损伤。此外，由于本方案可在较局限的范围内诱导脑损伤，因此在分析血脑屏障破坏和炎症反应时，明确定义观察区域至关重要。这正是本方案的创新之处，其得以实现的关键在于采用了比常规更细的针头^25,26。另一独特优势在于，该TBI小鼠模型无需使用立体定位仪等设备即可简便建立²⁷。

根据格拉斯哥昏迷评分（Glasgow Coma Scale, .......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
19 G × 1•1/2" 针头	TERUMO	NN-1938R
27 G × 3/4" 针头	TERUMO	NN-2719S
抗 GFAP 抗体	Sigma-Aldrich	G9269
抗 Iba1 抗体	Wako	019-19741
盐酸阿替美唑	Nippon Zenyaku Kogyo		产品名称：Antisedan
生物素偶联小鼠 IgG 抗体	Vector Laboratories	BA-9200
生物素偶联兔 IgG 抗体	Vector Laboratories	BA-1000
牛血清白蛋白	Nacalai Tesque	01860-07
脑切片器	Visikol	BSLM-2
酒石酸布托啡诺	Meiji Animal Health		产品名称：Vetorphale 5 mg
共聚焦显微镜	Zeiss	LSM700
冷冻切片机	Leica	CM1520
DAB	Sigma-Aldrich	D5637-1G
DAPI	Roche	10236276001
伊文思蓝	Wako	056-04061
荧光偶联兔 IgG 抗体	Invitrogen	A-21206
Fluoromount-G	Invitrogen	4958-02	水性封片介质
异氟烷吸入溶液	Viatris	v002139
KOD SYBR qPCR Mix	TOYOBO	QKD-201	qPCR 预混试剂盒
美托咪啶	Nippon Zenyaku Kogyo		产品名称：Domitor
显微镜	Olympus	FSX100
微量分光光度计	ThermoFisher Scientific	NanoDrop One
咪达唑仑 10 mg/2 mL	Sandoz	1124401A1060
MOUNT QUICK	Daido Sangyo	DM01	水不溶性封片介质
新生牛血清	Gibco	16010159
O.C.T. 包埋剂	Sakura Finetek Japan	45833	包埋介质
Peel-A-Way，截断式 22 mm 方形顶模具	Ted Pella	27118	组织包埋模具
蠕动灌注泵	ATTO	SJ-1211
酶标仪	Fisher Scientific	Cytation 3
实时定量 qPCR 仪	ThermoFisher Scientific	StepOne Plus
ReverTra Ace qPCR RT 试剂盒	TOYOBO	FSQ-101	cDNA 合成试剂盒
Superfrost Plus 载玻片	Fisher Scientific	12-550-15	带正电荷载玻片
带针缝合线	Alfresa	HT2003NA75-KF2
TRIzol 试剂	Invitrogen	15596026
VECTASTAIN ABC 标准试剂盒	Vector Laboratories	PK-4000	基于亲和素/生物素的过氧化物酶系统试剂盒