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单分子时间分辨荧光各向异性用于表征生物大分子局部柔性

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DOI：

10.3791/67802

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2025年4月25日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physics and Astronomy, Clemson University, 2Department of Chemistry and Chemical Biology, TU Dortmund University, 3Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas, Universidad de Chile

本文内容

摘要

本文介绍了在共聚焦显微镜模式下，利用单分子时间分辨荧光各向异性研究生物大分子局部柔韧性和动力学特性的实验方案。

摘要

我们描述了一种利用共聚焦显微镜在单分子水平上进行时间分辨荧光各向异性实验的方案，用于研究FoxP1转录因子的脱氧核糖核酸（DNA）结合叉头（FKH）结构域的局部柔韧性和动力学特性。FoxP1通过三维结构域交换（3D-DS）机制形成二聚体，可在有或无DNA的情况下产生无序中间体。由于3D-DS涉及一个内在无序区域，因此理解其行为对于阐明FoxP1的结构与功能特性至关重要。我们使用单半胱氨酸标记的FoxP1进行了单分子荧光各向异性（smFA）实验，应用动态各向异性光子分布分析（daPDA）和时间分辨各向异性突发方差分析（traBVA）方法来探测局部柔韧性和动力学。本方案为smFA测量提供了详细、逐步的操作指南，重点介绍时间分辨分析、方差和概率分布技术，以捕捉不同时间尺度下的结构动力学。该方法使我们能够将动力学和异质性与FoxP1的二聚化及DNA结合关联起来，揭示了该转录因子所特有的复杂作用机制。

引言

生物分子的功能活性取决于其分子柔韧性及结构动力学1,2,3。生物分子在自然状态下会持续经历热涨落，其运动范围从快速的局部运动到影响功能的长期构象变化（图1）4。在生物分子中，局部主链运动可促进更大尺度的全局性运动，包括酶的铰链弯曲以及马达蛋白的显著构象变化。核磁共振（NMR）5、X射线晶体学6和低温电子显微镜（cryo-EM）7等结构测定方法已揭示多种生物分子存在多个构象。然而，将局部涨落与生物分子的大尺度构象动力学及其功能作用相联系的研究仍较为匮乏。动力学与结构之间的关联可能具有挑战性，尤其对于内在无序蛋白（IDPs）8,9,10而言更是如此。与具有固定结构的蛋白质不同，IDPs不维持稳定的三级结构，而是经历广泛的构象变化，且各构象具有相近的自由能水平，从而支持多种多样的生物学功能11,12。

已有多种实验方法被用于通过探测分子柔性来研究蛋白质的构象动力学1,13,14,15,16。其中，核磁共振（NMR）因其能够在从数十皮秒到数小时的多个时间尺度上提供原子级分辨率而尤为突出12。然而，由于自由度较高以及大尺寸蛋白质带来的复杂性，测定大分子柔性仍然具有挑战性；因此，NMR 通常仅限于研究分子量约为 100 kDa 的生物大分子17。

鉴于内在无序蛋白（IDPs）等高度动态蛋白质的结构复杂性，研究人员已开发出多种方法学进展，以探索其局部和远距离的构象空间，从而理解其功能11。单分子多参数荧光光谱技术（smMFS）18,19,20,21,22 能够提供关于生物大分子的丰富信息，揭示其功能、构象动力学、结合状态及化学计量比等关键特征。然而，解读从生物大分子获得的大量结构数据仍具挑战性，而分子动力学、荧光探针行为以及分子本身的复杂行为等因素，可能进一步增加数据分析的难度23,24,25,26,27,28。

我们采用单分子荧光各向异性（smFA）作为一种可靠的方法，用于评估生物大分子骨架上的局部和整体动力学（图1A）。荧光各向异性最早由Perrin29描述，并由Weber30,31作为生物分析工具引入32，随后随着时间分辨荧光技术的发展以及探测器灵敏度的提高，该方法被进一步应用于单分子研究33,34,35,36,37。smFA覆盖了从皮秒到数小时的广泛时间尺度，并可补充单分子 Förster 共振能量转移（smFRET）实验所获得的数据38。

smFA 可以以多种格式呈现，以提取有关生物分子动力学的关键信息（图 1B）。时间分辨荧光各向异性衰减是一维直方图，可捕捉皮秒到纳秒时间尺度上的动力学过程39,40。二维单分子直方图将单个分子的荧光寿命与各向异性相关联，能够揭示各向异性状态的异质性，并在共聚焦实验的观测时间范围内（约毫秒级）提供对潜在动力学过程的直观洞察41,42。对于亚毫秒级动力学的研究，可采用动态各向异性光子分布分析（daPDA）；而时间分辨各向异性爆发方差分析（traBVA）则为确认毫秒级附近的特定动力学提供了可靠方法43（图 1B）。

这些方法可补充更传统的工具，例如具有较宽光谱的偏振分辨荧光相关光谱（pFCS）44,45,46,47。总体而言，在进行适当校准的前提下，多种smFA数据分析工具有助于识别局部和全局的构象变化。

在此，我们应用单分子荧光各向异性（smFA）技术研究人类FoxP1转录因子的DNA结合特性48,49,50,51。该 蛋白 由于其多肽链具有内在无序的特性，会形成结构域交换型二聚体 ，其构象显著受到蛋白四级结构状态以及DNA存在与否的影响。我们构建了多种单半胱氨酸突变体，用BODIPY-FL进行标记，开展smFA实验，并采用daPDA和trBVAa分析方法。该策略使我们能够将动力学行为和异质性与FoxP1的二聚化及DNA结合过程相关联，揭示了该转录因子所特有的复杂作用机制。

方案

注意：为单分子荧光各向异性（smFA）实验选择合适的荧光团至关重要。可根据可反应基团的可用性，通过在蛋白质的氨基酸或核酸的核苷酸碱基上位点特异性地连接荧光标记物，实现生物分子的标记。在有机染料52中，Alexa Fluor、Cy、BODIPY 和 Janelia Farms 系列因其较长的荧光寿命、良好的光稳定性和高量子产率，成为 smFA 实验中最常用的选择。其中，BODIPY-FL 因其更长的荧光寿命、优异的量子产率以及较短的连接臂而常被优先选用。此外，在倾向于使用群体测量技术的药物筛选中，也常采用其他替代性荧光团53。嵌合型荧光蛋白也可用于活细胞各向异性实验和成像，但其动态范围较低，存在一定局限性。

1. 缓冲液的配制

注意：进行实验室实验时，请佩戴手套、护目镜和实验服。

  1. 标准缓冲液（20 mM 4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙磺酸 [HEPES]，pH 7.8，150 mM NaCl）：将 2.38 g HEPES、4.38 g NaCl 溶解于 400 mL 超纯水中，调节 pH 至 7.8，定容至 500 mL。
  2. 裂解缓冲液（20 mM HEPES，pH 7.8，150 mM NaCl，0.1 mM 苯甲基磺酰氟 [PMSF]，10 µg/mL DNase）：将 2.38 g HEPES、4.38 g NaCl、8.71 mg PMSF 以及终浓度为 10 µg/mL 的 DNase 溶解于 400 mL 超纯水中，调节 pH 至 7.8，定容至 500 mL。
  3. 平衡缓冲液（50 mM 磷酸盐缓冲液 [PBS]，150 mM NaCl，10 mM 咪唑；pH 7.4）：将 5.05 g Na2HPO4、0.85 g NaH2PO4、4.38 g NaCl 和 0.34 g 咪唑溶解于 400 mL 超纯水中，调节 pH 至 7.4，定容至 500 mL。
  4. 洗涤缓冲液（50 mM PBS，150 mM NaCl，30 mM 咪唑；pH 7.4）：将 5.05 g Na2HPO4、0.85 g NaH2PO4、4.38 g NaCl 和 1.02 g 咪唑溶解于 400 mL 超纯水中，调节 pH 至 7.4，定容至 500 mL。
  5. 洗脱缓冲液（50 mM PBS，150 mM NaCl，250 mM 咪唑；pH 7.4）：将 5.05 g Na2HPO4、0.85 g NaH2PO4、4.38 g NaCl 和 8.5 g 咪唑溶解于 400 mL 超纯水中，调节 pH 至 7.4，定容至 500 mL。
  6. PBS 缓冲液（50 mM 磷酸钠缓冲盐水，150 mM NaCl，pH 7.4）：将 5.05 g Na2HPO4、0.85 g NaH2PO4 和 4.38 g NaCl 溶解于 400 mL 超纯水中，调节 pH 至 7.4，定容至 500 mL。
  7. 使用孔径为 0.22 µm 的滤器过滤所有缓冲液以灭菌，并将缓冲液于室温（RT）保存。
  8. 为单分子检测，使用活性炭滤器过滤标准缓冲液。

2. 荧光探针

  1. BODIPY-FL：将 1.29 mL 新开启的二甲基亚砜（DMSO）加入含有 5 mg BODIPY-FL 的小瓶中，溶解后得到终浓度为 10 mM 的 BODIPY-FL 溶液。
  2. 罗丹明 110（Rhodamine 110）：加入 1 mL 新开启的 DMSO 溶解 3.67 mg 罗丹明 110，得到终浓度为 10 mM 的 Rhodamine 110 溶液。
    注意：荧光探针应避免光照。始终使用避光管（琥珀色）并用铝箔包裹。若 DMSO 已开启，必须保存在干燥器中以延长其保质期。
  3. 将制备好的荧光探针分装成小体积 aliquot，并于 -20 °C 保存，以备后续使用。
    注意：避免反复冻融，以提高其标记效率。

3. 校准测量

  1. 在自制的偏振分辨装置上进行多参数荧光检测（MFD）实验，该装置配备4个检测通道和2个脉冲激光器（蓝色485 nm 和红色640 nm）54。然而，进行各向异性测量时，仅使用蓝色激光器和两个检测通道。
  2. 开启检测通道（平行和垂直方向）以及蓝色激光器的功率。
  3. 确保激光功率设定为60 µW，并打开时间相关单光子计数（TCSPC）软件36控制面板。
  4. 将1 µL的100 nM罗丹明110与49 µL去离子水混合，得到终浓度为2 nM的罗丹明110溶液。取50 µL的2 nM罗丹明110溶液滴加至盖玻片中心，用于校准测量。
  5. 随后，在显微镜物镜镜头上方滴加一滴浸油液（油或水均可，但需注意保持折射率一致），以提高显微镜的分辨能力。
  6. 将盖玻片置于物镜上方，并确保水滴位于显微镜物镜的中心位置。
  7. 调节成像平面，使其位于溶液内部且高于玻璃表面。
  8. 调节旋钮找到第二个明亮的焦点，并调整至一点半的位置，将激光聚焦于玻璃与液体的界面处。
  9. 在监测光子计数率的同时，调节针孔位置（70 µm），以最大化检测到的光子数量。
  10. 打开软件中的时间标记时间分辨（TTTR，或T3）模式面板，点击开始按钮。记录120秒的计数率，并使用采集软件保存为Rhodamine 110.ptu文件格式。考虑到样品浓度（2 nM），此采集时间已足够。
  11. 进行背景测量时，向盖玻片中心加入50 µL去离子水，重复步骤3.5–3.10。但记录光子计数率的时间为300秒，并保存为water.ptu文件。
  12. 进行其他背景测量时，向盖玻片中心加入50 µL标准缓冲液，重复步骤3.5–3.10。记录300秒的光子计数率，并保存为standard buffer.ptu文件。然后使用爆发积分荧光寿命（BIFL）分析软件对数据进行分析。

4. 校准与数据分析

  1. 打开 BIFL 软件，从自动弹出的窗口中点击确认设置，然后点击从文件获取参数，再点击确定。
  2. 对于待分析的测量数据，点击数据路径数组并进行选择。
  3. 接着，为绿色散射等数组加载水测量文件water.ptu；类似地，为绿色背景选择standard buffer.ptu文件；对于绿色浓样，选择Rhodamine 110.ptu文件。
  4. 在单分子选择参数下，点击下一步，然后点击调整以显示新的弹出窗口。点击阈值以更改光子间到达时间，并为平均光子间到达时间（dt）选择单分子事件时间。接着点击最小数量#以设定每个单分子事件中光子的最小数目，然后点击返回关闭弹出窗口，再点击确定。
  5. 接下来，点击颜色拟合参数以调整绿色通道的初始荧光寿命，该颜色由荧光衰减参数生成。通过修改起始和终止值来调节起始时间和延迟时间，然后点击返回关闭弹出窗口，再点击确定。
  6. 点击保存以处理 ASCII 文件，并将其保存至指定文件夹。随后，使用 ChiSurf22、光子分布分析（Photon Distribution Analysis）55,56 或爆发方差分析（Burst Variance Analysis）57,58 对时间分辨荧光各向异性衰减数据进行处理。
    注：有关如何使用 ChiSurf、PDA 和 BVA 的示例数据及逐步说明，分别可在 github.com/Fluorescence-Tools/chisurf、github.com/Fluorescence-Tools/tttrlib 、www.mpc.hhu.de/en/software/mfd-fcs-and-mfis 和 github.com/SMB-Lab/feda_tools 获取。实验数据可在 Zenodo (10.5281/zenodo.13371503) 获取。

5. FoxP1 蛋白制备

  1. 重组 FoxP1 蛋白的细菌过表达
    1. 在完成快速定点突变聚合酶链式反应（PCR）后，将质粒转化至 E. coli C41 感受态细菌细胞中。
    2. 制备 LB 培养基并进行高压灭菌以实现无菌处理。
    3. 挑取单个 E. coli C41 菌落，接种于含有 5 µL（100 µg/mL）氨苄青霉素的 5 mL LB 培养基中，置于 37 °C 摇床培养箱中过夜培养。
    4. 次日，将过夜培养的预接种液按 1:500 的比例接种至已预先添加抗生素的 500 mL LB 培养基中，进行大规模细菌培养。
    5. 通过测定培养液在 600 nm 处的吸光度监测细菌生长情况。
    6. 当光密度值达到约 0.5–0.7 时，加入终浓度为 0.5 mM 的异丙基-β-d-1-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）诱导蛋白表达，并将培养物置于 15 °C 摇床培养箱中继续培养过夜。
    7. 当光密度（600 nm）达到 1.4–1.6 范围时，于 4 °C 条件下以 3000 g 离心 20 分钟收集菌体。弃去上清液，将菌体沉淀保存于 -20 °C，待后续使用。
  2. 重组 FoxP1 蛋白纯化
    1. 采用超声破碎、液相均质化、French 压力细胞等任一裂解方法，加入裂解缓冲液裂解 E. coli C41 细胞。
    2. 于 4 °C 条件下以 14000 g 离心裂解液 10 分钟。
    3. 对于带有 His6 标签的蛋白，使用快速蛋白液相色谱（FPLC）系统，用 NiSO4 洗涤并平衡 Ni2+-NTA 亲和层析柱。
    4. 将带有 His6 标签的 FoxP1 蛋白上样至已平衡的 Ni2+-NTA 亲和层析柱中。
    5. 使用洗脱缓冲液进行线性梯度洗脱，从 Ni2+-NTA 柱中洗脱 FoxP1 蛋白。
    6. 蛋白洗脱后，进行透析以实现缓冲液置换。将蛋白加入不含咪唑的平衡缓冲液中，于 4 °C 磁力搅拌条件下透析过夜。
      注：若蛋白采用其他方法纯化，应相应地进行缓冲液置换。
    7. 为去除 His6 标签，向透析液中加入烟草蚀刻病毒（TEV）蛋白酶（TEV:FoxP1 质量比为 1:100），4 °C 孵育过夜。
      注：His6 标签的酶切也可在层析柱上进行 TEV 蛋白酶消化，此步骤可提高目标蛋白的得率。
    8. 次日，重复步骤 5.2.3–5.2.5。但此次使用洗涤缓冲液而非洗脱缓冲液进行蛋白洗脱。
    9. 通过加入 PBS 缓冲液将蛋白浓缩至适当体积，并利用 280 nm 处的吸光度结合蛋白的消光系数测定蛋白浓度。
  3. 重组 FoxP1 蛋白标记
    1. 将 50–100 µM 的 FoxP1 蛋白与 10 倍摩尔过量的二硫苏糖醇（DTT）或三(2-羧乙基)膦（TCEP）混合，终体积为 500 µL，在室温下孵育 30 分钟。
    2. 使用 PD 10 脱盐柱进行缓冲液置换。将 PD10 柱通过柱适配器置于 50 mL 离心管中。
    3. 向 PD10 柱中加入 5 mL PBS 缓冲液进行平衡，于 1000 × g 离心 2 分钟。重复此步骤 3 次。
    4. 将 PD10 柱转移至新的 50 mL 离心管中，向柱内加入 2 mL PBS 缓冲液，随后加入步骤 1 中的 500 µL FoxP1 蛋白溶液。于 1000 × g 离心 2 分钟以洗脱蛋白，并收集洗脱液。
    5. 将蛋白溶液转移至超滤离心管（截留分子量 10 kDa），于 7500 × g 离心 10 分钟进行浓缩，收集浓缩后的蛋白液。
    6. 测定蛋白浓度后，加入相当于蛋白中半胱氨酸浓度 30% 摩尔当量的 BODIPY 染料，于 4 °C 旋转孵育 2 小时。
    7. 参照步骤 5.3.2–5.3.5 所述方法进行缓冲液置换并浓缩蛋白。
    8. 使用分光光度计或 Bradford、Lowry 等比色法测定蛋白浓度，并通过 500 nm 处的吸光度测定染料浓度。
    9. 使用以下公式计算标记程度：
      (A染料/ε染料)/(蛋白分子量/毫克蛋白每毫升) = 染料摩尔数/蛋白摩尔数
      其中 A染料 和 ε染料 分别为染料在最大吸收波长处的吸光度值和摩尔消光系数59。在 280 nm 处测定时，蛋白的实际吸光度需按以下公式校正：
      A蛋白 = A280-(A染料·CF280)
      其中 CF280 为特定染料在 280 nm 处固有吸收所对应的校正因子59。
      注：尽管本文重点在于半胱氨酸修饰蛋白的表达与纯化，但在蛋白中引入半胱氨酸残基时必须进行策略性设计。

6. 显微镜样品室的制备

  1. 向培养板的孔中加入 495 µL 超纯水和 5 µL（终浓度为 0.01% v/v）Tween-20（非离子型表面活性剂），混匀。室温孵育 30 分钟以上。
  2. 用超纯水轻轻洗涤培养板两次，并将其干燥。
    注意：培养板现已准备好用于实验。

7. 单分子荧光各向异性实验

  1. 首先，校准单分子荧光各向异性（smFA）仪器。通过测量拉曼散射光，或通过测量具有短寿命和合适发射光谱的染料（例如赤藓红或孔雀石绿）在饱和碘化钾（KI）溶液额外淬灭条件下的荧光，来确定仪器响应函数。
  2. 为校正背景荧光，需对缓冲溶液进行测量。通过采集快速旋转染料的数据，校准平行和垂直方向探测器的相对灵敏度（G因子）。此处使用2 nM的罗丹明110对探测器进行校准60。
  3. 进行单体FoxP1的单分子荧光各向异性实验时，在腔室载玻片中将100 pM BODIPY标记的FoxP1和100 nM未标记的FoxP1加入500 µL标准缓冲液（20 mM HEPES、20 mM NaCl，pH 7.8）中。
  4. 进行DNA与单体FoxP1的滴定实验时，将400 nM DNA加入含100 pM BODIPY标记和100 nM未标记蛋白的混合物中，在室温下孵育10分钟。
  5. 进行二聚体FoxP1的单分子荧光各向异性实验时，在标准缓冲液中将500 nM未标记的FoxP1加入100 pM BODIPY标记的FoxP1中，随后在37 °C孵育30分钟。
  6. 进行DNA与二聚体FoxP1的滴定实验时，将2000 nM DNA加入含100 pM BODIPY标记和500 nM未标记蛋白的混合物中，在室温下孵育10分钟。
  7. 开始测量，并在BIFL软件中检查30秒记录内的爆发事件数量是否处于60–90之间。若样品浓度过高，应稀释至达到该范围。此步骤可确保满足单分子检测条件。
  8. 对单体FoxP1或二聚体FoxP1，在有或无DNA存在条件下，分别持续进行至少4小时的单分子荧光各向异性测量。
  9. 按照第4节所述方法分析单分子荧光各向异性测量数据。

结果

荧光各向异性源于荧光团的吸收偶极矩与发射偶极矩之间的相对取向。当荧光团暴露于偏振光时，其吸收跃迁矩与入射光的电场矢量方向一致的荧光团会被优先激发（光选择）。因此，激发态分子群体呈现出部分取向，其中大量被激发的分子其跃迁矩与偏振激发光的电场矢量方向一致61。荧光团由于布朗运动而发生旋转，因此发射跃迁矩也随之旋转，导致荧光各向异性具有时间依赖性。该效应可用于测量荧光分子的旋转运动、检测结合事件、表征荧光团所处的微环境，并捕捉分子动力学过程。

单分子实验能够独特地确定样品的异质性。利用单分子灵敏度和荧光各向异性，可为多参数荧光光谱增加另一个维度。在典型的单分子共聚焦显微镜（图2）20,21中，当使用脉冲激光时，荧光各向异性可通过基于强度或时间分辨的方法测定。

为了考虑共聚焦显微镜中高数值孔径物镜的去偏振效应62，时间分辨各向异性35,63的正确表达式为

静力学平衡方程，r_xy(t) 公式，示意图，与转动动力学相关。     (1)

其中，静态平衡公式 \(F_{xy,\|}(t)\)；力分析的物理方程。 和 静态平衡方程 \(F_{xy,\perp}(t)\)；动态分析方法；数学公式。 分别表示在波长 x 激发后，第 y 个检测通道中平行偏振 l1 和垂直偏振 l2 的时间分辨荧光强度，且这些因子用于描述由于本实验中使用的高数值孔径（NA）物镜所导致的平行与垂直信号之间的串扰35,62,64。染料在平行检测通道 静态平衡方程，ηV, λemV，发射分析研究的光学图示。 与垂直检测通道 特定条件下发射的光学效率因子 η；光谱分析公式细节。 的检测效率差异，通过检测效率比值 光吸收-发射过程方程；光学光谱分析的科学公式。 进行校正。GUV 也被称为 G 因子。

时间分辨荧光各向异性可通过多指数衰减模型来描述，以考虑荧光团与较大生物大分子相连的情况，其表达式为

瞬态吸收光谱分析中的指数衰减方程 rxy(t)。,     (2)

其中 r0 依赖于荧光团的基本各向异性（通常 r0 = 0.38), r∞ 是残余各向异性，以及 ρ1 和 ρ2 分别为快速（荧光团的局部运动）和慢速（大分子的整体运动）旋转相关时间。

在单分子各向异性测量中（图2），通过记录光子到达时间，并利用爆发积分荧光寿命（BIFL）分析来识别单个发光分子33,35。光子间到达时间（Δt）采用滑动平均法进行平滑处理，随后绘图以增强可视化效果。这些时间的直方图通过半高斯函数拟合，以确定来自背景的光子的均值和标准差。设定一个以标准差倍数表示的任意阈值，用于滤除单个事件，同时识别每次爆发中的首个和末个光子。每次爆发内的光子被积分后用于进一步分析，包括利用公式1和公式2计算时间分辨和基于强度的稳态荧光各向异性，或通过最大似然估计法进行分析35。由于单分子事件中光子数量有限，最大似然估计法仅考虑单指数组分，本文不再进一步讨论。

在单分子事件的二维直方图中，平均荧光寿命（τ）和各向异性（rxy）可通过 Perrin 方程29,61关联，从而获得平均旋转时间（ρ）。

荧光各向异性公式 r_xy 计算方程，科学研究，变量 r_0、τ、ρ。      (3)

通过“子系综”（se）分析，可以更准确地获得特定的ρ值，该方法将不同荧光爆发中的光子整合为一条联合的时间分辨荧光各向异性衰减曲线，并通过优化方程2的参数以拟合实验衰减曲线（seTRFA）。时间分辨各向异性能够解析生物分子在纳秒时间尺度荧光发射过程中与旋转运动（局部和整体）相关的异质性与动力学特征。

为了检测单分子事件中（亚毫秒尺度）的动力学过程，我们引入了时间分辨各向异性突发方差分析（time-resolved anisotropy Burst Variance Analysis, traBVA）57。在traBVA中，对于包含 Mi 个连续光子片段的光子突发信号，突发信号的过量各向异性方差（s2）为

方差公式；数学方程图像；统计数据分析；教学用途。.     (4)

对于单一各向异性态，方差 σ2 完全来源于散粒噪声65（sn: √N，其中 N 为光子数）

方差公式，σ² = (rₓᵧ)(1-rₓᵧ)/m，概率计算方法。     (5)

其中 m 为一个爆发中的光子数。因此，为了识别各向异性的额外方差，我们可以将由构象异质性引起的各向异性超额方差（S2）定义为公式 4 与公式 5 之间的差值。

方差公式，\(S^2 = s^2 - \sigma^2\)，用于统计数据分析。      (6)

为了捕捉单个分子观测过程中发生的时间动态并考虑方差近似，可采用动态各向异性光子分布分析法（dynamic anisotropy Photon Distribution Analysis, daPDA）55,56。在daPDA中，荧光强度通过条件概率（概率方程 P(Fxy𝖨‖, Fxy⟂)，统计分析，数学公式）建模，该概率以二项分布形式表示。

概率方程；P(Fxy,||, Fxy, ⊥|F)；统计分析；公式；物理学；研究。     (7)

结合背景计数率服从泊松分布的估计值

概率方程，公式，泊松分布，数学概念，P(B) 分析。     (8)

其中 静态平衡；⟨B⟩方程；物理学符号；教育关键词；简明描述 是单位时间窗口内的平均背景光子数。静态平衡 ΣFx=0 公式，方程，教学示意图 和 静态平衡方程 ⟨B⊥⟩，平衡分析公式，教育研究示意图 分别表示平行和垂直方向的背景计数，可通过缓冲液样品作为参照进行测量。通过最小化一个优度指标 χ2 来优化实验测定的荧光各向异性，该指标基于每个偏振通道的荧光强度分布，并可包含动力学变化。

所提供的分析程序和数据呈现方法为解释所采集的数据提供了一种全面的途径。尽管本方案主要侧重于共聚焦测量，而此类测量在捕捉纳秒至毫秒范围内的各向异性变化方面存在局限，但仍可采用全内反射显微镜来监测更长时间尺度上的荧光各向异性，从而实现时间序列分析66。对于单分子共聚焦测量，我们强调使用多维直方图，该方法可为所观测的集合生成独特的指纹图谱。从选定群体中重构出的时间分辨荧光衰减曲线，可用于追踪纳秒尺度下荧光各向异性的演化过程（图3）。光子分布分析55，56和爆发方差分析（BVA）57，58也可用于捕捉介于时间分辨衰减与多维直方图之间的时间尺度上的动态过程。虽然本方案未涉及偏振荧光相关光谱（FCS）的使用——无论是否采用脉冲激发67，68（该技术可填补纳秒到毫秒时间尺度之间的空白）——但相同的数据可用于计算FCS69，尽管这超出了本方案所述范围。若开展此类实验，建议延长样品测量时间。

该方法已应用于FoxP蛋白这类复杂的体系，为理解其作用机制中涉及的分子运动提供了重要见解。FoxP蛋白是一类转录因子，参与大脑和肺部发育等多种生理过程；尤为重要的是，已发现多种突变会损害这些蛋白的功能70,71。我们以FoxP1的DNA结合域为模型，构建了多种单半胱氨酸突变体，并引入BODIPY-FL荧光染料作为分子运动的示踪标记（图4A）。事实上，我们评估了二聚化和DNA结合对该蛋白主要结构调控作用的影响。通过单分子荧光各向异性（smFA）方法，我们生成了二维smFA图谱，并对每种突变体在单体和二聚体状态下的traBVA和daPDA进行了分析。本文展示其中一种单突变体的研究示例（图4）。所有突变体的各向异性行为在确定高、低旋转相关时间方面表现相似，从而可推断出无序态和折叠态的集合。然而，在各集合的比例和动力学方面，所有突变体均表现出高度异质性，反映出受二聚化和DNA结合影响的有序-无序转变差异，并展示了沿蛋白链结构动态的高分辨率描述（图5）。

各向异性示意图、时间分辨荧光各向异性及二维单分子荧光各向异性分析分子动力学和结构变化。
图1：生物分子的动力学范围与荧光各向异性方法。（A）连接在目标生物分子骨架不同位置的小分子荧光探针的各向异性可反映局部结构动力学。（B）荧光强度衰减（时间分辨荧光各向异性，FA）和共聚焦单分子显微镜数据的单分子直方图所探测的时间尺度。请点击此处查看该图的放大版本。

激发激光装置示意图，瞬态吸收光谱法及数据分析结果。
图2：单分子荧光各向异性数据的采集与处理。（A）使用配备单一线性偏振激发激光器（本例中为蓝色）的共聚焦单分子显微镜分析自由扩散的分子。荧光发射（本例中为绿色）经偏振分束器将信号分为两种偏振方向（与激发光源平行的 薄层色谱（TLC）板展示分离过程示意图。 和垂直的 T形符号，表示垂直关系；几何概念图；静力学平衡原理。）后，由两个探测器分别检测。（B）每个被检测到的光子均以三个参数表征：微时间、宏时间及通道类型。数据以时间标记时间分辨（TTTR）格式存储72。（C）选择并处理单个分子的爆发信号，以提取荧光参数，包括每个观测分子的荧光各向异性。（D）数据可通过多种方式呈现，包括荧光各向异性与荧光寿命的二维图谱以及时分辨各向异性衰减曲线。这些呈现方式可实现对荧光寿命、旋转相关时间和体系异质性的定性观察与定量分析。请点击此处查看该图的放大版本。

荧光各向异性分析；二维单分子荧光各向异性图，时间分辨荧光，seTRFA结果。
图3：FoxP1 结构域互换二聚体的代表性数据。（A）荧光各向异性（rscatter）与每分子平均荧光寿命之间的相关性，以等高线图表示。叠加了代表分子系综平均的双组分旋转Perrin方程拟合曲线，其中两个组分的荧光寿命 ρ1 和 ρ2 分别为 0.2 ns 和 8.5 ns。（B）利用子系综的时间分辨荧光衰减曲线计算样品的时间分辨荧光各向异性。采用公式2进行拟合，解析出荧光各向异性的局部和整体组分。请点击此处查看该图的放大版本。

蛋白质相互作用分析；示意图显示 FoXP1 结构、2D-smFA、traBVA、daPDA 结果。
图 4：利用单分子荧光各向异性（smFA）监测 FoxP1 的亚毫秒动力学行为。（A）FoxP1 单体结构的示意图表示。（B）二维直方图展示了动力学异质性，揭示了通过时间分辨荧光各向异性检测到的两个不同的旋转相关时间。时间分辨各向异性爆发方差分析（traBVA）发现一小部分具有超额方差（公式 6）的事件表现出显著的各向异性。利用光子分布分析（PDA）进行的定量动态各向异性分析进一步提取了该过程的交换速率。请点击此处查看该图的放大版本。

蛋白质相互作用分析：FoxP1 单体/二聚体示意图、方差散点图、组分比例柱状图。
图5：筛选FoxP1在二聚化过程中的局部与全局运动。（A）示意图比较了FoxP1的单体形式与其二聚体形式。（B）显示了在单体和二聚体条件下各位置的平均超额方差，较大的超额方差表示各向异性变化更显著。（C）采用光子分布分析（Photon Distribution Analysis, PDA）进行动态各向异性分析，有助于确定在无DNA（绿色）和有DNA（黄色）条件下各组分的比例（高各向异性以深色表示，低各向异性以浅色表示）。在此方法中，（未显示）估计了局部行为与全局行为之间转换的速率，揭示FoxP1会发生部分去折叠。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

在单分子荧光各向异性实验中，必须仔细考虑所选荧光染料的光物理性质。这些性质包括发射波长，其必须与检测系统相匹配；以及激发波长，应与可用的脉冲激光器相兼容。为了优化动态范围，荧光染料的荧光寿命应相对于分子的旋转扩散时间较长。这对于追踪分子的旋转动力学以及荧光团偶极子与目标生物分子之间连接关系/取向至关重要。此外，亮度、光稳定性和量子产率对于获得强信号和稳定的信噪比也至关重要。基于这些原因，BODIPY-FL 已被多项研究选为所用荧光染料39,40,42。

筛选生物分子骨架动力学通常需要对蛋白质进行标记，这通常通过位点特异性标记实现。该方法通常通过引入可用于靶向化学修饰的残基来完成。最常用的方法是在目标位置引入半胱氨酸，其巯基侧链可与马来酰亚胺或碘乙酰胺等试剂发生选择性反应。较少使用的是利用苄基卤化物或溴甲基酮形成硫醚键。其他氨基酸侧链也可作为靶点，但由于其在蛋白质中较为常见，因此较少被采用。然而，也可使用其他替代方法，例如非天然氨基酸73。标记位点的合理选择至关重要，以尽量减少对被研究生物分子的干扰，同时必须设置适当的对照。例如，若标记分子用于结合实验，则应通过互补的无标记方法验证荧光基团不会影响结合亲和力。

在确定合适的样品并实施最佳标记策略后，下一步是确保共聚焦显微镜已针对单分子实验进行了正确的对准和校准。该方案描述了如何确定进一步分析所需的因子。仪器校准完成后，下一步是测量样品并处理数据，以从检测到的光子中提取尽可能多的信息。如图2所示，微时间、宏时间以及通道类型等关键参数可用于基于典型时间相关单光子计数（TCSPC）电子系统的进一步分析和可视化。

单分子荧光光谱技术的最新进展可被广泛用于研究生物大分子异质集合体的结构信息。然而，目前仅有相对较少的研究利用荧光各向异性所提供的信息，且需要完整的蛋白质模型才能推导出生物大分子的结构动力学特征。因此，揭示多种转录因子的结构域间相互作用及蛋白质-蛋白质相互作用的动力学过程仍具有挑战性。

总之，单分子荧光各向异性实验可提供有关生物大分子骨架局部与全局运动的互补信息，这些信息对于理解其功能至关重要。

披露

所有作者均声明，他们对本文内容不存在任何竞争性经济利益。

致谢

本工作获得了FONDECYT基金11200729和FONDEQUIP EQM200202（授予E.M.）、NIH R15CA280699、R01GM151334以及NSF CAREER MCB 1749778（授予H.S.）的资助。N.K.感谢克莱姆森大学博士后奖学金项目的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Alexa Fluor 488赛默飞世尔科技A20100https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A20100?SID=srch-srp-A20100
Amicon Ultra 离心滤器，10 kDa 截留分子量Millipore SigmaUFC901008https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/mm/ufc9010
氨苄青霉素钠盐Millipore SigmaA0166-5Ghttps://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/a0166
BODIP FL 马来酰亚胺（BODIPY FL N-(2-氨基乙基)）马来酰亚胺赛默飞世尔科技B10250https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/B10250?SID=srch-srp-B10250
一次性 PD 10 脱盐柱Millipore SigmaGE17-0851-01https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/ge17085101
二硫苏糖醇Millipore Sigma10197777001https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/roche/dttro
无水 DMSO赛默飞世尔科技D12345https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/D12345?SID=srch-srp-D12345
脱氧核糖核酸酶Millipore Sigma10104159001https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/roche/10104159001
E. coli C41 细菌细胞 英韦滕
Foresigh Nuvi 镍离子负载 IMAC，5 mL 柱伯乐12004037https://www.bio-rad.com/en-us/sku/12004037-foresight-nuvia-ni-charged-imac-5-ml-column?ID=12004037
HEPESMillipore Sigma7365-45-9https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/h3375
咪唑Millipore Sigma288-32-4https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/i5513
IPTGMillipore SigmaI6758-1Ghttps://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sial/i6758
MCE 膜滤器，0.22 μm 孔径Millipore SigmaGSWP02500https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/mm/gswp02500
NaClMillipore Sigma7647-14-5https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/s3014
Nunc Lab-Tek II 培养皿载玻片系统赛默飞世尔科技154534https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/154534
OverExpress C41(DE3) 化学感受态细胞Millipore SigmaCMC0017-20X40ULhttps://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/cmc0017
PMSFMillipore Sigma329-98-6https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/78830
罗丹明 110赛默飞世尔科技419075000https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/419075000?SID=srch-hj-419075000
磷酸氢二钠Millipore Sigma7558-79-4https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/s3264
磷酸二氢钠二水合物Millipore Sigma13472-35-0https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/71505
TCEP 盐酸盐，试剂级Millipore Sigma580567-5GMhttps://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/mm/580567
吐温 20Millipore Sigma11332465001https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/roche/11332465001

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单分子时间分辨荧光各向异性用于表征生物大分子局部柔性
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