微调 Caenorhabditis elegans 在带通道琼脂垫上的方向以成像神经再生

摘要

本文介绍一种利用黑胶唱片制备的PDMS模具来制作带通道琼脂垫的实验方案。这些通道可帮助用户精确调整秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）的排列方向，从而提高成像对比度，并便于结构之间的比较。这些优势在神经再生研究中尤为有用。

摘要

Caenorhabditis elegans 是一种广泛用于研究生物学过程的模式生物。其透明的身体和微小的体型使其成为成像组织、细胞及亚细胞结构的理想选择。传统的平面琼脂垫在对 C. elegans 进行成像时难以控制动物的取向，主要限制为侧向观察。这一局限性使得背腹结构的可视化变得困难，并降低了图像清晰度，尤其是在色素沉积更多、直径更大的老年个体中。为克服这些挑战，我们开发了带通道的琼脂糖垫，可精确控制动物的取向。这些通道使研究人员能够旋转并固定 C. elegans 在特定位置，从而便于同时成像多个结构，并通过将目标细胞更贴近显微镜物镜来提高图像分辨率。该方法在手术后成像再生神经纤维时尤为有用，因为这些纤维可能朝向传统平面琼脂垫难以捕捉的方向生长。此方法具有良好的可及性，因为制备带通道的琼脂垫所需的时间和材料与平面琼脂垫相同，适用于大多数实验室。

引言

线虫 Caenorhabditis elegans（C. elegans）是一种广泛使用的模式生物，用于研究发育和行为等生物学过程，因其遗传特性与哺乳动物高度保守¹。研究人员在严格控制的环境中，将 C. elegans 培养于线虫生长培养基（NGM）平板上，以标准化实验条件，从而更精确地将实验结果归因于实验变量。该生物体透明，便于对组织、细胞及亚细胞结构进行清晰成像。C. elegans 体型微小，成虫长约 1 mm，直径约 80 µm，因此可在单个载玻片上同时放置多个个体进行成像¹。其微小体型还使得单张图像即可完整捕获整个生物体，同时分辨出单个细胞，这对于观察神经纤维的再生至关重要。此外，C. elegans 发育迅速、解剖结构具有高度可重复性且遗传操作简便，这些优势与显微成像技术相辅相成，使其适用于大规模研究¹。

对秀丽隐杆线虫（C. elegans）细胞进行成像的常规方法数十年前即已建立，至今基本保持不变。研究人员使用载玻片上的扁平琼脂垫来固定并 immobilize 动物，以便观察其细胞²。琼脂垫上方加盖的盖玻片可将动物固定在适当位置，并保护显微镜物镜。重要的是，盖玻片具有较高的折射率，能够增加采集光的数值孔径，从而提高成像分辨率。此外，盖玻片还能减少光传输过程中的畸变。因此，使用盖玻片可显著改善目标细胞和结构的可视化效果。

然而，当使用盖玻片时，平坦的琼脂垫通常会限制动物的取向。C. elegans 会沿其背腹（DV）方向弯曲，因此在平坦的琼脂垫上呈现侧向取向。然而，即使在固定、拉直并预先旋转至背腹方向后，盖玻片的放置仍会使几乎所有动物重新回到侧视方向（图1）。我们认为这种重新取向的发生是因为盖玻片将突出的C. elegans阴门推向一侧。没有阴门的幼龄动物则取向更为随机。这种对取向控制的局限性至少在两个方面存在问题。首先，它可能无法将两个结构置于同一视野中（例如双侧对称结构），从而增加了比较的难度。其次，设定正确的取向对于优化成像质量至关重要，因为当目标结构靠近物镜时通常成像效果最佳。这是因为物镜只能在样品中成像有限的深度（即工作距离），并且来自较深位置的光会经历更多的散射和吸收。

C. elegans 的方向控制受限问题通常在较老的个体中更为严重。L1 至 L4 阶段的线虫直径较小，使得更大比例的身体部位可用于成像。这些幼虫的色素也较少，导致对可见光的吸收降低以及光子散射减少，从而提高了图像的清晰度和分辨率。相反，成虫个体直径更大且色素更多，由于盖玻片会影响初始方向性，因此在较深的 z 平面成像时面临更大挑战。

2008年，我们提出了一种使用带通道的琼脂垫的策略，以克服上述挑战，通过保持动物的特定方向来实现稳定操作^3,4。如下所述，用户可通过识别解剖学标志物，在通道中将固定的动物旋转至所需方向。通道将动物固定在隆起琼脂表面之间的凹陷处，从而在盖玻片放置过程中最小化对动物施加的力，并防止动物发生旋转。由于带通道的琼脂垫与普通平面琼脂垫的制备流程几乎相同，且耗时相近，因此本技术具有很高的可及性。许多实验室已采用我们的技术，用于固定C. elegans，以研究其解剖特征、观察发育过程以及分析神经元对行为的贡献^5,6,7,8。下文将详细描述制作带通道琼脂垫的完整流程，起始于一张用热刀切割成四等份的黑胶唱片。首先，我们将介绍用于浇铸带通道琼脂垫的聚二甲基硅氧烷（PDMS）模具的制备方法；随后，逐步展示带通道琼脂垫的制作过程。整个流程预计在无经验者操作下需耗时3小时。在完成PDMS模具制备后，使用该模具制作琼脂垫所需时间与制作常规琼脂垫相同（数分钟）。

方案

1. 制备用于制造的聚二甲基硅氧烷（PDMS）

1. 将快固剂与基础剂按1:10的比例倒入一次性称量皿中。混合未固化的液体45秒，直至液体充分融合并充满气泡。
2. 将托盘倾斜放入真空干燥器中。在-0.09至-0.1 kPa的压力范围内循环3次，使气泡升至表面。
3. 在-0.09至-0.1 kPa的压力下持续抽真空约1小时，直至仅剩少量可见气泡，这些气泡可手动去除。

2. 制备密纹唱片的PDMS模具

1. 用去离子水（DI 水）冲洗密纹唱片和玻璃板，确保无灰尘残留，以获得最佳模具。将密纹唱片自然晾干，待用。
2. 在加热板上放置一张铝箔，用于承接多余的 PDMS。
3. 将一片玻璃载片置于密纹唱片两端，以设定模具厚度等于玻璃载片的厚度。这可确保将玻璃板压到未固化 PDMS 上时高度均匀。
4. 将未固化的 PDMS 液体倒入密纹唱片的一侧。
5. 通过液体表面的光反射观察气泡，并用移液器吸头去除气泡。倾斜玻璃板并缓慢放下，使空气逸出，防止引入气泡。
6. 在 80 °C 下固化 PDMS 35 min。
7. 从加热板上取下密纹唱片并冷却。小心地将 PDMS 从密纹唱片上剥离，避免撕裂。
8. 使用新的玻璃载片作为引导，用锋利的剃刀切割 PDMS，制备带有微通道的琼脂模具。

3. 制备含 NaN₃ 的带通道琼脂垫

注意：平面琼脂垫的实验步骤和材料此前已建立⁹。本实验步骤与其非常相似。

1. 在烧瓶中加入 0.6 g 琼脂和 30 mL NGM 液体⁹ 储液。加入搅拌子，并在加热板上于 120 °C 加热。
2. 待凝胶完全融化后，加入 120 µL 叠氮化钠（NaN₃）储液（1 M 储液浓度）。
3. 用水清洗 PDMS 模具，然后使其自然晾干。将 PDMS 模具置于两组载玻片之间。
4. 用移液器反复吸取琼脂溶液以预热吸头。向 PDMS 模具中加入 300 µL 融化的琼脂，手动将琼脂铺满通道，因载玻片的放置会将琼脂沿通道展开。
5. 将显微镜载玻片直接放置在琼脂上，并使其支撑在两侧的载玻片上。待琼脂冷却后，取下载玻片。

4. 固定秀丽隐杆线虫（C. elegans）

1. 载玻片冷却后，将其垂直从模具上取下，避免产生剪切力。
2. 动物被 NaN₃ 固定后，将其移入通道中。
3. 将动物旋转至所需的方向。
4. 在垫片上放置盖玻片。倾斜垫片，并从一侧向另一侧轻轻按压，使空气移向边缘，避免产生气泡。

结果

制备PDMS模具
在模具制备过程中循环施加真空压力，可刺破并去除未固化PDMS中的气泡，从而确保获得无气泡的模具。如图3D所示，气泡上升至表面并被刺破。无气泡的模具能够制备出清晰的微通道。

PDMS模具的固化
将玻璃板放置在密纹唱片上时，应避免产生气隙。这些气隙可能导致厚度不均或表面缺陷。如果存在气泡，可通过肉眼观察检测。从玻璃板的一侧向另一侧按压可排出空气，减少气泡的形成，并确保模具厚度均匀，如图4A所示。

使用带通道的琼脂垫进行精细定向 C. elegans
带通道的琼脂垫可实现秀丽隐杆线虫（C. elegans）的精确定向。我们使用铂金丝挑取工具轻轻滚动线虫以调整其方向，同时通过阴门或S形肠道等解剖标志确认其朝向。图5A，C）。我们在荧光解剖显微镜下确认方向后，将动物转移至图示的倒置显微镜 图 5B，D.

利用带通道琼脂垫评估神经纤维再生
带通道琼脂垫通过优化动物体位，提高神经再生成像质量。将再生的神经纤维置于更靠近物镜的位置，可减少光散射和吸收，从而提升图像清晰度。图5E、F显示，将再生部位靠近物镜可改善成像质量，有助于更准确地分析神经再生长情况。

图1: 秀丽隐杆线虫 在平面和带通道的垫片上。 (A动物置于平坦的琼脂垫上，呈背腹位（DV方向）；阴门朝向盖玻片。B盖玻片的引入会将阴门推向一侧，迫使线虫呈侧向定位。C动物置于有沟槽的琼脂垫上，呈背腹（DV）方向。D) 盖玻片引入后，动物遗骸保持背腹轴方向。E) 在DV方向上，位于带通道琼脂垫上的roller突变体的明场图像。F明场图像，带盖玻片，同一动物 E 保持背腹（DV）方向。缩写：DV = 背腹；lat = 侧向。 请点击此处以查看此图的放大版本。

图 2：PDMS 制备所需材料与设备。（A）SYLCAP 284-F 硅橡胶试剂盒。（B）天平。（C）塑料注射器。（D）真空干燥器。（E）加热板。（F）12 英寸长播放唱片，根据需要折断使用。（G）玻璃板。缩写：PDMS = 聚二甲基硅氧烷。请点击此处查看该图的放大版本。

图3：混合与抽真空未固化的PDMS。（A）在托盘中混合基础剂与固化剂。（B）将托盘放入真空室中。（C）循环抽真空三次，使气泡升至表面。（D）一小时后，大部分气泡已破裂。注意PDMS透光性有所改善。请点击此处查看该图的放大版本。

图 4：将玻璃片无气泡地引入未固化的 PDMS 中。（A）将玻璃片无气泡地置于黑胶唱片上。（B）从唱片上取下的已固化 PDMS 模具，插图展示了微通道细节。请点击此处查看该图的放大版本。

图 5：在带通道琼脂上固定的 C. elegans 的明场与荧光图像。（A）动物处于背腹（DV）双侧方向的明场图像。背腹方向的解剖标志：呈螺旋S形的肠道（箭头所示较暗组织）横跨中线，位置约为从头部到尾部距离的60%处。（B）同一动物在背腹方向的神经元荧光图像，见于图A。（C）动物处于侧向（lat）方向的明场图像。侧向方向的解剖标志：阴门朝向侧面。（D）同一动物在侧向方向的神经元荧光图像，见于图C。（E）再生结构（箭头）位于动物较深（远）侧的方向。（F）再生结构位于更浅（近）侧、靠近物镜的动物方向；再生结构更清晰（箭头）。比例尺 = 20 µm。缩写：DV = 背腹方向；lat = 侧向。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

沟道状琼脂垫的主要优势在于其能够维持动物在成像过程中的方向。这些沟道可容纳成年动物，允许对其进行可控旋转，并在加盖盖玻片后保持该方向不变。我们已成功对野生型、滚动突变型（roller）和矮胖突变型（dumpy）动物进行了成像。我们利用解剖学标志物对动物进行准确定向，从而可在同一视野内成像并比较多个结构，并使目标细胞更接近表面。特别是这种定向方式便于背侧或腹侧（双侧视图）的观察，从而能够比较动物的左侧与右侧。

此前，对这些双侧结构的可视化和比较需要使用三维Z轴堆栈图像，并可能需要对信号进行归一化处理，以校正因深度增加导致的透射率下降。因此，通过带通道的琼脂所确定的方向性，可在多个线虫样本间实现更一致的成像，从而有助于提高测量的准确性。这对于手术后再生神经纤维的评估尤其有益，因为再生纤维可能朝难以成像的方向生长，例如环状方向²。

此外，带通道的琼脂能够减轻动物所受的应力，因为动物被放置在凹陷处，可缓解盖玻片压力并促进正常生理状态⁵。尽管松弛品系在制片过程中可能发生扭曲，但通道有助于保持动物呈线性排列，并实现整体旋转。在另一种应用中，该图案化结构还可限制动物活动，从而减少成像或观察时所需的麻醉剂量⁸。

最后，沟道化琼脂技术也具有很高的可及性。在模具制备完成后，制作沟道化琼脂垫所需的时间、技术要求和成本与制作常规平面琼脂垫大致相同。制备PDMS模具所需的所有材料在许多学术实验室中均常见，或可在线购买。PDMS模具的耐用性使其成为实验室经济高效的选择，能够长期承受大量使用。PDMS模具可使用数年，经历数百次使用。我们至今仍在使用一个已有17年历史的模具，仅出现中等程度的老化。建议将模具在室温下存放于容器中，以避免灰尘污染；如有必要，可用去离子水清洗去除污染物。

尽管具有这些优势，我们的技术仍存在一些局限性。用于将动物放置到垫片上的挑针力量可能会使通道发生变形，从而影响动物的定位。与任何精细操作一样，将动物定位并旋转至理想方向可能耗时较长，这会增加动物接触麻醉剂的时间，并可能引发应激反应。在放置盖玻片时，通道还可能截留空气并形成气泡，这些气泡会散射光线，干扰成像的清晰度。我们在实验方案中讨论了减少气泡的方法。根据我们的经验，通过一定程度的训练和练习，大多数与通道状琼脂相关的缺点均可得到有效避免。

未来优化这些通道的方向包括开发针对特定实验需求的设计，例如针对不同年龄和表型的秀丽隐杆线虫（C. elegans）设计不同尺寸和形状的通道。通过纳米加工技术¹⁰制造定制化的通道尺寸，相比通用通道可降低对动物的生理影响⁵。总之，使用带通道的琼脂垫可实现对老年线虫中难以观察结构的高分辨率成像。这些琼脂垫能够固定C. elegans的方向，从而提高成像质量并实现更精细的可视化，同时由于通道结构提供了支撑作用，减少了动物所受的应激压力。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
125 mL 锥形瓶	Corning	4980-125
33 1/2 RPM 或 12 英寸长播放（LP）黑胶唱片	N/A	N/A	单声道沟槽深度：50 µm，宽度：200 µm
30 mL 塑料注射器	Fisher Scientific	50-793-817
90% 铂，10% 铱丝	Tritech Research	PT-9010	用于制作铂金探针
铝箔	Amazon	N/A
氯化钙	Fisher Scientific	AAL131910B
玻璃板	N/A	N/A	从相框中取出的 7 英寸 × 5 英寸玻璃板
玻璃移液管	Fisher Scientific	13-678-20A	用于制作铂金探针
加热板	Thermofisher	SP88857104
硫酸镁	Fisher Scientific	AA3333736
显微镜载玻片	Mckesson	938360
分子生物学级琼脂	Benchmark Scientific	A1705
磷酸氢二钾	Fisher Scientific	P290-500
磷酸二氢钾	Fisher Scientific	P285-500
叠氮化钠	Fisher Scientific	AAJ2161022
氯化钠	Fisher Scientific	BP358-212
方形盖玻片	Fisher Scientific	12-541-016
SYLCAP 284-F（快速固化）硅胶弹性体封装套件，透明，光学清晰，混合比例 10:1，500 克/毫升（0.5 千克），比 Sylgard 184 及类似产品更快	MicroLubrol	N/A
真空干燥器	Fisher Scientific	08-648-100
称量皿	Fisher Scientific	01-549-750