通道琼脂垫上秀 丽隐杆 线虫方向的微调用于神经再生成像

线虫秀 丽隐 杆线虫 （C. elegans） 是一种广泛用于研究生物过程的模式生物，例如发育和行为，因为它的遗传学与哺乳动物对应物高度保守¹。研究人员在线虫生长培养基 （NGM） 平板上培养 秀丽隐杆 线虫，环境严格控制，使实验条件标准化，并允许更精确地将结果归因于实验变量。动物是透明的，能够对组织、细胞和亚细胞结构进行清晰的成像。 秀丽隐杆线虫 很小，成年动物长 ~1 mm，直径 80 μm，这允许将多只动物放置在单个载玻片架上进行成像¹。它们的小尺寸还允许单个图像捕获整个生物体，同时分辨单个细胞，这对于可视化神经元纤维的再生至关重要。秀 丽隐杆线 虫的快速发展、刻板的解剖结构和简单的遗传学与显微镜的这些优势协同作用，允许进行大规模研究¹。

秀丽隐杆线虫细胞成像的典型程序是在几十年前建立的，并且基本上保持不变。研究人员在载玻片上使用扁平琼脂垫来安装和固定动物，以便观察它们的细胞²。垫顶部的盖玻片将动物固定在适当的位置并保护显微镜的镜头。重要的是，盖玻片具有高折射率，可增加捕获光的数值孔径并提高成像分辨率。此外，盖玻片减少了透光时的失真。因此，盖玻片改善了靶细胞和结构的可视化。

然而，当与盖玻片一起使用时，扁平琼脂垫通常会限制动物的定向。 秀丽隐杆 线虫沿其背腹 （DV） 方向弯曲，因此它们在平坦的琼脂垫上采用横向方向。然而，即使在固定、拉直和预旋转到 DV 方向后，盖玻片放置也使几乎所有动物都恢复到侧视图（图 1）。我们认为这种重新定位的发生是因为盖玻片将突出的 秀丽隐杆线虫 外阴推向一侧。没有外阴的年轻动物的定向更随机。这种对方向的有限控制是有问题的，至少有两个原因。首先，它可能不允许将两个结构放置在一个视野中（例如，双侧），这会使它们的比较复杂化。其次，设置方向对于优化成像质量很重要，因为当目标结构靠近物镜时，它们通常成像效果最佳。这是因为物镜在样品内的成像深度有限（即工作距离），并且来自更深位置的光会经历更多的散射和吸收。

对于 秀丽隐杆线虫，对方向的有限控制通常对老年动物更为严重。L1 至 L4 年龄的动物直径较小，因此蠕虫的成像比例较高。这些幼虫的色素沉着也较少，导致可见光的吸收和光子的散射减少，从而提高了图像清晰度和分辨率。相反，成年动物的直径更大，色素沉着更多，这给更深的 z 平面成像带来了挑战，因为盖玻片会影响初始方向。

2008 年，我们引入了一种使用带有通道的琼脂垫的策略，通过保持动物的方向来克服这些挑战 ^3,4。如下所述，用户通过注意解剖标志，将通道中固定的动物旋转到所需的方向。这些通道将动物固定在升高的琼脂表面之间的凹陷中，从而最大限度地减少了盖玻片放置过程中对动物的力，并消除了动物的旋转。由于槽形垫和普通平板垫的制造遵循几乎相同的程序并且需要相同的时间，因此我们的技术非常容易获得。许多实验室利用我们的技术固定秀丽隐杆线虫，以研究解剖特征、观察发育并分析神经元对行为的贡献 5,6,7,8。以下部分描述了制作通道琼脂的整个过程，从用热刀切成四等份的黑胶唱片开始。首先，我们描述了用于铸造通道琼脂的聚二甲基硅氧烷 （PDMS） 模具的制造。然后，我们逐步展示如何制备通道式琼脂。整个过程预计需要 3 小时，无需专业知识。按照 PDMS 制造程序，用模具制作的垫子将花费与典型的琼脂垫相同的时间（几分钟）。

1. 制备用于制造的聚二甲基硅氧烷 （PDMS）

1. 将快速固化剂与基料按1:10的比例倒入一次性称重盘中。将未固化的液体混合 45 秒，直到液体完全融合并充满气泡。
2. 将托盘倾斜放入真空干燥器中。在 -0.09 至 -0.1 kPa 之间循环压力 3 次，以使气泡浮出水面。
3. 在 -0.09 至 -0.1 kPa 的压力范围内保持真空状态约一小时，直到剩余少量可见气泡，可以手动去除。

2. 制作黑胶唱片的 PDMS 模具

1. 用去离子 （DI） 水冲洗黑胶唱片和玻璃板。确保无尘以获得最佳模具。让黑胶唱片风干直至使用。
2. 在热板顶部放置一张铝箔以捕获多余的 PDMS。
3. 在黑胶唱片的每一端放置一个载玻片，将模具厚度设置为载玻片的宽度。这确保了将玻璃板压到未固化的 PDMS 上时高度一致。
4. 将未固化的 PDMS 液体倒在黑胶唱片的一侧。
5. 利用液体表面的光反射观察气泡，并用移液器吸头去除它们。倾斜玻璃板并缓慢降低玻璃板，让空气逸出，防止引入气泡。
6. 将 PDMS 在 80 °C 下固化 35 分钟。
7. 从热板中取出黑胶唱片并冷却。小心地从黑胶唱片上剥离 PDMS，以免撕裂。
8. 使用新的载玻片作为导向，用锋利的剃刀切割 PDMS，以创建通道状琼脂模具。

3. 用 NaN₃ 制造槽式琼脂垫

注意:扁平琼脂垫的程序和材料是先前建立的⁹.此过程非常相似。

1. 将 0.6 g 琼脂和 30 mL NGM 液体⁹ 原液加入烧瓶中。加入搅拌棒，在热板上以 120 °C 加热。
2. 凝胶熔化后加入 120 μL NaN₃ 原液（1 M 原液浓度）。
3. 用水清洗 PDMS 模具并风干。将 PDMS 模具放置在两组幻灯片对之间。
4. 上下移液琼脂以加热移液器吸头。将 300 μL 熔化的琼脂移液到 PDMS 模具上，手动将琼脂涂布到通道上，因为玻片放置会沿通道铺展琼脂。
5. 将显微镜载玻片直接放在琼脂上，放在载玻片两侧。琼脂冷却后取出载玻片。

4. 安装 秀丽隐杆线虫

1. 滑块冷却后，将滑块直接从模具中取出，不要剪切。
2. 在动物被 NaN₃ 固定后，将动物移入通道
3. 将动物旋转到所需的方向。
4. 将盖玻片放在垫上。倾斜垫子并从一侧轻轻向下推到另一侧，将空气推向一侧，避免产生气泡。

制作 PDMS 模具
在模具制造过程中循环真空压力会刺穿并去除未固化 PDMS 中的气泡，确保模具无气泡。如图 3D 所示，气泡上升到表面并穿刺。无气泡模具可以产生干净的通道。

PDMS 模具的凝固
将玻璃板放在黑胶唱片上时，请避免产生气隙。这些间隙会导致厚度不均匀或表面缺陷。如果存在气泡，可以通过肉眼检测到。将玻璃板从一侧压向另一侧会置换空气，最大限度地减少气泡形成并确保模具厚度均匀，如图 4A 所示。

使用槽式琼脂垫对秀丽隐杆线虫进行精细定位
通道状琼脂垫允许线虫的精确定位。我们通过用铂丝镐轻轻滚动动物来设置动物方向，同时使用地标（例如外阴或 S 形肠）验证方向（图 5A，C）。在将动物转移到如图 5B、D 所示的倒置显微镜之前，我们在荧光解剖显微镜下确认方向。

使用通道琼脂垫评估神经元纤维的再生
通道式琼脂垫通过优化动物方向来提高神经元再生的成像质量。将再生神经元纤维放置在更靠近物镜的位置可减少光散射和吸收，从而提高图像清晰度。图 5E，F 显示，将再生位点放置在更靠近物镜的位置可以提高成像质量，从而有助于更准确地分析神经元再生。

图 1:扁平和通道垫上的秀丽隐杆线虫。（A） DV 方向的平坦琼脂垫上的动物;外阴面盖玻片。（B） 盖玻片引入将外阴推向一侧，迫使动物进入外侧方向。（C） DV 方向的通道琼脂垫上的动物。（D） 引入盖玻片后，动物保持 DV 方向。（E） DV 方向上通道琼脂垫上的滚筒突变体的明场图像。（F） 带盖玻片的明场图像，与 E 相同的动物保持 DV 方向。缩写: DV = 背腹;纬度 = 横向。请单击此处查看此图的较大版本。

图 2:用于制造 PDMS 的材料和设备。 （A） SYLCAP 284-F 有机硅弹性体套件。（B） 规模。（C） 塑料注射器。（D） 真空干燥器。（E） 热板。（F） 12 英寸长播放的黑胶唱片，根据需要拆开。（G） 玻璃板。缩写:PDMS = 聚二甲基硅氧烷。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 3:混合和抽真空未固化的 PDMS。 （A） 在托盘中混合基料和固化剂。（B） 将托盘放入真空室中。（C） 循环抽真空 3 次，让气泡浮出水面。（D） 一小时后，大多数气泡破裂。注意:通过 PDMS 的传输已得到改进。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 4:在无气泡的未固化 PDMS 中引入玻璃板。 （A） 在黑胶唱片上引入无气泡的玻璃板。（B） 从记录中取出凝固的 PDMS 模具，带有插入的详图通道。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 5:安装在通道琼脂上的 秀丽隐杆线虫 的明场和荧光图像。 （A） 动物在双侧 DV 方向的明场图像。DV 方向的解剖标志:螺旋 S 形肠（箭头表示较暗的组织）穿过从鼻子到尾巴距离的中线 ~60%。（B） DV 方向神经元的荧光图像，与 A 相同。（C） 动物在纬度方向的明场图像。背阔肌方向的解剖标志:外阴面向一侧。（D） 与 C 相同的动物 lat 方向神经元的荧光图像。（E） 在动物更深（远）侧的再生（箭头）方向。（F） 更靠近目标的浅侧动物的再生定向;Regeneration Clearer （箭头）。比例尺 = 20 μm。缩写: DV = 背腹;纬度 = 横向。 请单击此处查看此图的较大版本。

作者没有需要披露的利益冲突。