Method Article

使用超声定位显微镜对大鼠脑微血管系统进行二维超分辨率可视化

DOI:

10.3791/67813

⸱

March 28th, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Fudan University, 2Academy for Engineering and Technology, Fudan University, 3School of Information Science and Technology, Fudan University, 4State Key Laboratory of Medical Neurobiology, Fudan University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在这里，我们描述了一种超声定位显微镜 （ULM） 协议，该协议实现了 12.5 μm 的空间分辨率，可以对大鼠的脑微血管系统进行成像。它能够详细地可视化血流方向和速度，为推进脑循环和血管疾病的研究提供了强大的工具。

Abstract

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脑微血管系统形成一个复杂的血管网络，对维持大脑功能至关重要。中风、阿尔茨海默病、神经胶质瘤和血管性痴呆等疾病会严重破坏微血管系统。不幸的是，目前的医学成像模式仅提供这种规模的间接观察。受光学显微镜的启发，超声定位显微镜 （ULM） 克服了穿透深度和空间分辨率之间的经典权衡。通过以亚波长精度定位和跟踪单个注射的微泡 （MB），可以生成微米级的血管和速度图。在这里，我们提出了一种强大的协议，用于使用商业超声平台对大鼠 体内 的脑微血管系统进行超分辨率成像。这种方法实现了 12.5 μm 的空间分辨率，重建了微血管结构并提供了有关血流方向和速度的详细信息，大大增强了我们对脑微循环的理解。该方案可以扩展到大鼠疾病模型，为神经血管疾病的早期诊断和治疗提供了强大的工具。

Introduction

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脑微血管系统由毛细血管、小动脉和小静脉组成，通过促进营养输送、氧气交换和废物清除，对维持大脑功能至关重要 1,2。该网络的破坏与神经系统疾病有关，例如中风3、阿尔茨海默病4、神经胶质瘤5 和血管性痴呆6，导致大脑生理学受损。微血管变化经常在临床症状出现之前出现，使其成为诊断和治疗干预的关键目标 7,8。全面了解结构和功能水平的血管改变是推进研究和治疗策略的关键。

然而，由于脑微血管系统体积小且部分位于大脑内较深的位置，因此对脑微血管系统进行成像特别具有挑战性。磁共振成像 （MRI）9 和计算机断层扫描 （CT）10 等传统成像方式虽然足以捕捉大规模血管变化，但提供的空间分辨率 （~100 μm） 对于小血管的可视化来说太粗糙了。双光子显微镜11 等....

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Protocol

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本工作中进行的所有动物实验均经复旦大学伦理委员会批准（批准号：2022JS-004）。该协议严格遵循复旦大学的动物护理指南，以确保对动物的人道待遇。在实验开始之前，必须允许大鼠有 1 周的环境适应期，在此期间为它们提供足够的饲料和水。光周期根据它们的生物节律受到仔细调节，以确保维持正常的生理状态。在实验结束时，使用过量的吸入异氟醚进行安乐死。

注意：实验设置如图 1A-H 所示。

1. 用于 ULM 成像的动物准备

  1. 麻醉
    1. 通过以 3 L/min 的流速施用 3.5% 异氟醚和 100% 氧气的混合物在大鼠中诱导麻醉。大约 4 分钟后，将动物从腔室中取出，并将其俯卧在预热至 37 °C 的成像平台上。 通过在大鼠后肢的坚硬脚趾捏住时没有撤退反射来确认麻醉深度。
    2. 将大鼠的鼻子放在连接到麻醉系统的呼吸面罩中。以 1.5 L/min 的流速施用 1.5% 异氟醚和 100% 氧气的混合物，保持稳定的镇静。
      注意：麻醉方法和剂量严格遵循制造商的指南。
  2. 术前动物准备
    1. 将大鼠的上切牙固定在门牙杆的凹槽中，....

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Results

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图 1 说明了大鼠 体内 脑微血管 ULM 成像的详细设置，每个元件都经过精心设计，以最大限度地减少实验变异性并确保准确的数据采集以获得可靠的超分辨率成像结果。

图 2A 显示了大鼠大脑中微血管系统的 ULM 重建结构，位于距前囟点 -1 毫米处，成像深度接近 12 毫米。整个成像平面的有效切片厚度范围为 0.1 mm 至 0.3 mm。较浅和较深的微血管都清晰可见，并且图像质量不会随着深度的增加而下降（图 2B）。通过计算感兴趣区域 （ROI） 中沿虚线强度分布的半峰全宽 （FWHM），可以检测到各种直径的血管，最小为 13 μm（图 2C）。应用傅里叶环相关 （FRC） 进行分辨率评估，大鼠脑微血管系统成像的空间分辨率被量化为 12.5 μm（图 2D）。

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Discussion

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该协议成功地利用 ULM 对体内大鼠脑微血管系统进行超分辨率成像。与其他成像模式相比，ULM 同时适应空间分辨率和穿透深度。暴露的大鼠大脑是成像的，而不是通过颅骨成像的，避免了骨骼存在引起的衰减和变形。在中心频率为 15.625 MHz 的换能器下，捕获了深度约为 12 mm 的血管结构，空间分辨率高达 12.5 μm。血流方向促进了小动脉和静脉特定区域的分化。此外，该技术还支持各种流速测量 （1-80 mm/s）。

对大鼠进行的开颅手术在该协议中至关重要。在手术过程中，必须尽量减少过度出血。一方面，出血过多会影响血液循环，典型的表现是皮质区域缺乏血管重建。另一方面，它也会引起实验动物的生理变化甚至死亡。手术中使用的立体定向设备具有自动开颅手术程序，可以减少创伤并提高成功率，但在很大程度上依赖于从业者的经验。这是因为必须精确确定钻孔地点的位置和深度，以避免对大鼠大脑造成损害或二次伤害。虽然并不总是需要开颅手术，但经颅 ULM 成像显示出前景，但需要强大的补偿或失真校正算法。此外，采用显微注射泵稳定地管理 MB，确保.......

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Disclosures

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作者没有什么可披露的。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

这项工作得到了中国国家重点研发计划（Grant 2023YFC2410903）、中国国家自然科学基金（Grant 12274092、12034005）、上海探索者计划（Grant 21TS1400200）、上海国际科技合作计划（Grant 24490710400）和复旦大学人工智能科学基金（Grant FudanX24AI016）。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
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References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sweeney, M. D., Ayyadurai, S., Zlokovic, B. V. Pericytes of the neurovascular unit: Key functions and signaling pathways. Nat Neurosci. 19 (6), 771-783 (2016).
  2. Wardlaw, J. M., Smith, C., Dichgans, M. Mechanisms of sporadic cerebral small vessel disease: Insig....

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