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方法文章

利用超声定位显微镜对大鼠脑微血管系统进行二维超分辨率可视化

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DOI：

10.3791/67813

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2025年3月28日

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1Department of Biomedical Engineering, Fudan University, 2Academy for Engineering and Technology, Fudan University, 3School of Information Science and Technology, Fudan University, 4State Key Laboratory of Medical Neurobiology, Fudan University

本文内容

摘要

本文介绍了一种超声定位显微镜（ULM）的实验方案，该方法可实现12.5 µm的空间分辨率，用于成像大鼠脑部微血管结构。该技术能够详细可视化血流方向与速度，为脑循环及血管疾病的研究提供了强有力的工具。

摘要

脑微血管系统形成了维持大脑功能所必需的复杂血管网络。中风、阿尔茨海默病、胶质瘤和血管性痴呆等疾病可严重破坏微血管系统。然而，目前的医学成像手段在此尺度上仅能提供间接观察。受光学显微镜技术启发，超声定位显微成像（ultrasound localization microscopy, ULM）克服了穿透深度与空间分辨率之间的经典权衡问题。通过以亚波长精度对注射的单个微泡（microbubbles, MBs）进行定位与追踪，可在微米尺度上生成血管结构与血流速度图。本文介绍了一种用于脑微血管系统超分辨率成像的可靠实验方案 体内 使用商用超声平台在大鼠中实现该方法。该技术可达到12.5 µm的空间分辨率，重建微血管结构，并提供有关血流方向和速度的详细信息，显著提升了对脑微循环的理解。该方案可拓展应用于大鼠疾病模型，为神经血管疾病的早期诊断与治疗提供有力工具。

引言

脑微血管系统由毛细血管、小动脉和小静脉组成，通过促进营养物质输送、氧气交换和废物清除，在维持大脑功能方面起着至关重要的作用1,2。该网络的紊乱与中风3、阿尔茨海默病4、胶质瘤5和血管性痴呆6等神经系统疾病相关，可导致脑生理功能受损。微血管的改变通常早于临床症状的出现，因此成为诊断和治疗干预的关键靶点7,8。全面理解血管在结构和功能层面的改变，对于推动相关研究和治疗策略的发展至关重要。

然而，由于脑微血管尺寸微小且部分位于脑组织较深部位，对其进行成像尤为困难。传统的成像方式如磁共振成像（MRI）9和计算机断层扫描（CT）10虽然能够捕捉大尺度的血管变化，但其空间分辨率（约100 µm）过于粗糙，难以清晰显示微小血管。光学方法如双光子显微镜11虽能提供优异的空间分辨率（可达1 µm），实现单个毛细血管的成像，但受限于视场范围小和穿透深度浅（不足1 mm），难以用于深部脑区的成像。作为一种基于超声的技术，多普勒成像12虽可实时评估血流情况，但其分辨率仅为50–200 µm，仍不足以呈现微血管的精细结构。总体而言，目前尚无单一方法能够同时满足高空间分辨率和足够脑组织穿透深度这两项要求，从而有效实现脑微血管系统的成像。

受光学显微镜13,14的启发，超声定位显微镜（ULM）通过定位单个注入的微泡（MBs）并以亚波长分辨率追踪其位移，实现了对微米尺度精细结构的可视化15。该技术突破了超声成像中穿透深度与分辨率之间经典权衡的限制16。本研究详细描述了一种在活体大鼠模型中实施ULM的稳健方案，从而利用 commercially available 超声平台实现对脑微血管系统的超分辨率成像。该方案不仅能对微血管结构进行全面重建，还能提供血流方向和速度的详细信息，而这些是传统成像技术无法实现的。尽管该方案已在正常大鼠中得到验证，但其可推广至大鼠疾病模型，为在不同病理条件下开展定制化研究提供了可能。

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方案

本研究中进行的所有动物实验均经复旦大学伦理委员会批准（批准号：2022JS-004）。实验方案严格遵循复旦大学的动物护理指南，以确保对动物的人道对待。在实验开始前，需让大鼠适应环境1周，期间提供充足的食物和饮水。光照周期根据其生物节律进行严格调控，以维持正常的生理状态。实验结束后，采用过量吸入异氟烷实施安乐死。

注意：实验装置如图1A-H所示。

1. 超声定位显微成像的动物准备

  1. 麻醉
    1. 通过给予大鼠 3.5% 异氟烷与 100% 氧气的混合气体（流速为 3 L/min）诱导麻醉。约 4 分钟后，将动物从麻醉舱中取出，并俯卧于预热至 37 °C 的成像平台上。
      注：在异氟烷诱导麻醉前 30 分钟，大鼠皮下注射美洛昔康（1 mg/kg）。
    2. 将大鼠的鼻部置于连接麻醉系统的呼吸面罩中。通过给予 1.5–2.0% 异氟烷与 100% 氧气的混合气体（流速为 1.5 L/min）维持稳定的镇静状态。
      注：麻醉方法和剂量严格遵循制造商指南。在大鼠下方放置设定为 37 °C 的电热垫，以防止麻醉引起的低体温。
  2. 术前动物准备
    1. 将大鼠的上门齿固定于门齿杆的凹槽内，使下颌位于门齿杆下方。使用耳杆插入耳道前上方可触及的骨性凹陷处，以稳定大鼠头部，确保整个颅骨表面保持水平（图 1A）。
    2. 轻轻施加压力于头部不同部位，检查固定是否稳固，确保无任何移动或滑脱现象。
    3. 精细调节成像平台的高度，并通过升高或降低门齿杆凹槽来精确调整大鼠头部角度，以确保呼吸通畅。
    4. 在大鼠眼部涂抹红霉素眼膏或 30% 甘油溶液，防止长时间暴露于手术灯光下造成损伤，并维持麻醉期间角膜湿润。此外，使用圆头镊子将大鼠舌头轻柔地拉向口腔一侧，以防术中窒息。
    5. 使用手持式电动剃毛器逆毛发生长方向（从后向前）剃除大鼠头部毛发，通常范围为两耳之间、从眼睛至颈部起始处（图 1B）。皮肤切口前，交替使用碘溶液和酒精对术区进行三次消毒。
  3. 大鼠开颅手术
    1. 通过用力夹捏大鼠后肢脚趾，确认无回缩反射以判断麻醉深度。沿大鼠颅骨矢状缝做切口，起始于枕骨稍后方，向前延伸约 4 cm。使用止血钳将两侧皮肤牵开（图 1C）。可选择性完全切除颅骨上方皮肤以获得更佳手术视野，但可能增加感染风险。
    2. 使用小剪刀去除颅骨上的骨膜，充分暴露坚硬的骨层。
    3. 使用配备球形钻头的手持微型颅骨钻进行开颅（图 1D）。先使用粗钻头（直径 2.5 mm），轻柔敲击以磨除骨质，每次钻磨持续 2–3 秒。从中央区域开始，逐步向两侧较厚骨区推进。
      注：开颅过程中过度出血会影响血液循环，导致皮层区域血管重建不足（图 1H）。
    4. 每钻磨 2–3 秒暂停一次以防过热；每 2 分钟使用注射器向钻孔区域注入约 1 mL 的 0.9% NaCl 溶液，以冷却并冲洗碎屑。
    5. 当白色骨组织不再呈现连续连接时，更换为更细的钻头（直径 1 mm）。继续钻磨，直至中央主要血管清晰可见呈深棕色，周围区域呈粉红色，微血管呈微红色（图 1F）。
      注：最终开颅范围为前后方向从前囟（Bregma）+3 mm 至人字缝（Lambda），左右方向沿颅骨中线两侧各 7 mm（图 1E）。手术完成后，让大鼠休息约 10 分钟，以确保生理状态相对稳定后再开始数据采集。

2. 数据采集前的准备工作

  1. 造影剂的制备与注射
    1. 按照官方指南，将造影剂（一支含有59 mg SF6气体和25 mg冻干粉末）溶解于5 mL 0.9% NaCl溶液中。剧烈震荡混合物以形成微泡（MB）悬液。该悬液中SF6的最终浓度为8 µL/mL。
    2. 用1 mL注射器抽取0.8 mL微泡悬液，并将其固定在已设定输注速率为100 µL/min的微量注射泵上。
    3. 将带有导管的26 G留置针插入大鼠尾静脉（图1G）。
  2. 选择成像平面
    1. 将中心频率为15.625 MHz的探头安装在配备夹具的脑立体定位仪操纵臂上（移动范围：垂直、水平及前后方向最大80 mm；读数精度：0.1 mm）。
    2. 将超声探头置于暴露的大鼠脑组织正上方。在暴露的脑表面涂抹耦合凝胶，以确保最佳信号传导。
    3. 打开软件主界面，该界面集成了大鼠脑图谱与运动控制程序。
    4. 设定Bregma点为原点。软件界面可实时显示探头轨迹及对应的大鼠脑切片位置。选择目标成像平面；例如，Bregma -1 mm。

3. 数据采集（耗时约 20 分钟）

注意：Verasonics（超声系统）提供了用于 Vantage 系统的原始 MATLAB 脚本，且未作任何修改。

  1. 软件启动
    1. 启动 MATLAB 2021a 软件。
    2. 在 MATLAB 2021a 中输入数据采集脚本。
    3. 在根目录下，于命令行窗口中键入 activate 以激活运行环境。
  2. 参数配置与射频信号采集
    1. 将数据采集的起始和终止深度分别设置为 5 和 120 个波长，以有效捕获感兴趣区域。
      注意：应根据成像平面和所研究的具体动物调整参数。
    2. 将平面波发射的偏转角度设置为从 -5° 到 5°，以 2.5° 为增量，以提高图像分辨率和对比度。
      注意：应根据具体的成像需求和目标特性调整这些设置。
    3. 将发射电压设为 20 V，以确保对感兴趣区域具有足够的穿透深度和最佳信噪比。
    4. 点击 Run 按钮以开始数据采集，并将射频（RF）信号保存为 .mat 文件格式。
      注意：在启动微注射泵 30 秒后开始数据采集，以确保微泡在大鼠体内分布均匀且稳定。

4. 数据处理与分析（预计时间约 8 小时）

  1. 数据处理
    1. 将射频（RF）数据导入 MATLAB 2021a，并进行解调以生成同相和正交（I/Q）数据（参见材料表）。
    2. 点击运行按钮，使用延时叠加（Delay-and-Sum, DAS）算法对 I/Q 数据进行波束成形（参见材料表）。
      ​注意：复合后帧率为 800 Hz，共包含 120,000 帧。
  2. 超分辨率显微成像（ULM）成像
    1. 对 IQ 数据应用奇异值分解（Singular Value Decomposition, SVD）时空滤波算法17，以去除背景噪声和杂波。每 800 帧存储为一个数据块，SVD 阈值设置为 [15, 800]。
    2. 使用高斯拟合算法18确定每个微泡（MB）的中心位置。
    3. 基于微泡的位置，利用 Kuhn-Munkres 算法在连续帧之间追踪微泡轨迹（参见材料表）。
    4. 将微泡轨迹映射到 8 倍上采样的网格中，使用热图颜色映射（hot colormap）显示各位置的微泡轨迹数量，并使用 jet 颜色映射编码血流速度，即将计算出的速度值映射至微血管结构中的每个位置。
    5. 应用自定义颜色方案以区分向上和向下的血流方向，从而生成高分辨率图像以增强可视化效果。
    6. 将原始微泡轨迹随机分为两组以生成两个子图像，分别对其进行傅里叶变换，并计算傅里叶环相关（Fourier Ring Correlation, FRC），即其频谱的归一化相关性。将分辨率定义为 FRC 下降至阈值以下时对应空间频率的倒数19。

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结果

图1 展示了详细的设置方案 体内 大鼠脑微血管超分辨显微成像，各环节均经过精心设计，以最大限度减少实验变异，确保数据采集的准确性，从而获得可靠的超分辨成像结果。

图2A展示了大鼠脑部微血管系统的ULM重建结构，成像位置位于前囟点后方-1 mm处，成像深度接近12 mm。成像平面的有效切片厚度范围为0.1 mm至0.3 mm。浅层和深层的微血管均清晰可见，且图像质量不随深度增加而下降（图2B）。通过计算感兴趣区域（ROI）内虚线上强度分布的半高全宽（FWHM），可检测到不同直径的血管，其中最小直径为13 µm（图2C）。采用傅里叶环相关（FRC）方法进行分辨率评估，大鼠脑微血管成像的空间分辨率被量化为12.5 µm（图2D）。

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讨论

本方案成功利用超分辨率显微血管成像技术（ULM）实现了对活体大鼠脑部微血管的超分辨率成像。与其他成像方式相比，ULM 同时兼顾了空间分辨率和穿透深度。成像过程采用暴露的大鼠脑组织而非经颅骨成像，从而避免了骨组织引起的信号衰减和畸变。在中心频率为 15.625 MHz 的换能器下，实现了对约 12 mm 深度处血管结构的成像，空间分辨率高达 12.5 µm。血流方向有助于区分小动脉和小静脉的特定区域。此外，该技术可支持广泛的血流速度测量范围（1–80 mm/s）。

在大鼠上进行的开颅手术是本方案中的关键步骤。手术过程中，必须尽量减少过度出血。一方面，过度出血可能影响血液循环，典型表现为皮层区域缺乏血管重建；另一方面，还可能引起实验动物的生理变化，甚至导致死亡。本操作中使用的立体定位装置配备有自动开颅程序，可减少创伤并提高成功率，但该程序的实施在很大程度上依赖操作者的经验。这是因为必须精确定位钻孔的位置和深度，以避免对大鼠脑组织造成损伤或继发性伤害。尽管开颅手术并非总是必需，经颅超分辨率超声显微成像（ULM）已展现出应用潜力，但需要采用强大的补偿或畸变校正算法。此外，实验中采用微注射泵...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作部分得到了中国国家重点研发计划（项目编号：2023YFC2410903）、国家自然科学基金（项目编号：12274092、12034005）、上海市探索者计划（项目编号：21TS1400200）、上海市国际科技合作项目（项目编号：24490710400）以及复旦大学“科学智能基金”（项目编号：FudanX24AI016）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
酒精DICHANGhttps://www.dehsm.com/goods-17187.html75%
波束成形程序蒙特利尔大学生物医学工程研究所Matlab 超声工具箱 3.4 版本
体温维持装置瑞沃德生命科学有限公司69026
脑立体定位仪瑞沃德生命科学有限公司71000-R可适配呼吸面罩
颅内微量注射手术器械套装瑞沃德生命科学有限公司SP0005-R
数字显微镜瑞沃德生命科学有限公司DOM-1001
药物递送导管瑞沃德生命科学有限公司https://www.rwdls.com/product-solutions/life-sciences/administration/draw-blood
红霉素软膏仁和药业H360200181% x 15 g
气体麻醉机瑞沃德生命科学有限公司R500IE包含呼吸面罩
手持式电动剪毛器GUAZHOUMUMJD-DTJ02
手持式微型颅骨钻瑞沃德生命科学有限公司78001
留置针康莱特企业发展集团有限公司正压型 26 G
碘溶液HYNAUThttps://www.hainuocn.com/index/detail/524.html4.5–5.5 g/L
同相/正交解调程序蒙特利尔大学生物医学工程研究所Matlab 超声工具箱 3.4 版本
异氟烷瑞沃德生命科学有限公司R510-22-10
MATLAB 软件MathWorks版本 R2021a
微量注射泵瑞沃德生命科学有限公司R462
氯化钠注射液圣奥动物药业有限公司2700714600.90%
SonoVueBraccohttps://www.bracco.com/en-se/product/sonovue
球形钻头瑞沃德生命科学有限公司HM1027/HM1010
配套定位软件瑞沃德生命科学有限公司V2.0.0.30400
注射器康莱特企业发展集团有限公司RWLB1 mL
追踪程序Jean-Yves Tinevez2016 版本
超声耦合剂骏康医疗器械有限公司型号 DS-1
超声探头VERASONICS, INC.L22-14vX LF
Verasonics 超声系统VERASONICS, INC.Vantage-256超声平台

参考文献

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