本报告描述了一种利用培养箱内 Drosophila 活动监测仪（DAM2）检测成年 Drosophila melanogaster 在空气传导热应激条件下达到击倒时间的方法。DAM2 通过记录单只果蝇穿越红外光束时的运动来测量其活动水平。数据分析由作者开发的一种新型可执行文件辅助完成。
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摘要
摘要
热耐受性研究 黑腹果蝇 几十年来，研究人员一直对热耐受性特别关注，通常通过监测生物在高温暴露后失能时间（TKD）来评估其热耐受能力。传统方法是将果蝇单独饲养于小瓶中，并置于恒温水浴内，随后由研究人员人工观察并记录TKD。尽管该方法已被广泛使用，但在实施人工检测时，仍存在主观性问题，以及对“完全停止活动”（包括肌肉痉挛）这一可操作定义的一致性应用困难。我们开发了一种基于TriKinetics系统的高通量自动化热耐受检测方法 果蝇 活动监测仪（DAM2）。为配合DAM2系统使用，我们编写了一个程序并制作了易于操作的可执行文件，可自动从活动数据中读取最后一次运动的时间。该脚本随后将每只果蝇的热致瘫痪时间（TKD）写入.csv文件。我们的数据显示，这种自动化的DAM2方法具有一致性和可靠性。同时，由活动计数数据生成的活动谱也具有研究价值。这些活动谱可以被整合起来，有望将热耐受性检测扩展至包括目前研究较少的热耐受行为学组分。本实验方案将详细描述如何使用DAM2系统和HoTDAM!软件来评估热耐受性 D. melanogaster
引言
变温动物在热应激下通常表现出运动活动增加。这一现象数十年来已被研究人员所注意，其特征性行为反应由 Cowles 和 Bogert 于 1944 年描述1。他们指出，处于热应激下的生物体首先会表现出运动活动增强。随着热应激加剧，短暂的活动爆发与静止期交替出现。当温度达到生物体无法再维持协调运动时，即为临界热最大值（CTmax）。随后出现肌肉痉挛，最终导致生物体发生生理崩溃1,2。这种崩溃 难以明确定义，其状态类似于"热僵直、昏迷或死亡"2。本文将使用生理崩溃 这一术语，理论上指代热应激这一模糊的终点状态。
黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）及其他小型昆虫是研究热应激的宝贵模型。为了估算构成耐热性这一复杂性状集合中的至少一部分特征，许多研究人员曾手动观察生理功能衰竭发生的时间和温度，分别代表击倒时间（TKD）和临界热最大值（CTmax）。尽管这些手动检测方法已被广泛确立，但仍存在一些缺陷。生理功能衰竭的操作定义可能难以建立，并难以恰当地适用于所有情况，尤其是在观察者经验不足时。例如，生物体从肌肉痉挛到完全衰竭的转变发生在哪个时间点？在衰竭发生前，肌肉痉挛和癫痫样活动的模式可能难以预测，这会增加准确观察的难度2,3，从而威胁结果的准确性与精确性。同时，观察难度也限制了单次实验可检测的生物个体数量，制约了实验的可扩展性。
由于活动性增加是对热刺激的一致性反应，而TKD和CTmax本质上是活动停止的临界点，因此我们尝试采用TriKinetics公司的果蝇活动监测仪（DAM2）来实现耐热性检测的自动化。我们近期发表了一种基于DAM2系统并配有易于使用的软件的自动化检测方法4。该检测方法通过将多种因素下基于TKD的耐热性测量结果与经典的依赖人工观察的TKD检测方法进行比较，完成了验证。我们还进一步探究了TKD检测中的运动活动成分，以更深入地表征可诱导的热耐受表型。我们将该检测方法及其配套软件命名为HoTDAM!（利用果蝇活动监测系统进行耐热性检测）。本文中，我们详细描述了使用DAM2系统和HoTDAM!软件进行自动化耐热性检测的方法。该方法操作简便，易于扩展，可同时对大量生物个体进行测量。
在本研究中，我们对温度感受突变果蝇（瞬时受体电位锚蛋白1； TRPA1）及其遗传对照（white1118；w1118）进行了热击倒（TKD）实验。选择这些生物体是为了突出在热应激过程中表现出的特征性活动增加对该实验的重要性。具体而言，TRPA1 果蝇不表现出这种逃避行为，说明了保守的行为反应与热耐受性评估指标（如TKD）之间的内在联系。我们对雌性和雄性果蝇均进行了实验，并实施了热适应预处理。此处展示的代表性结果来自全新的实验，不同于此前已发表的原始验证实验所使用的数据。
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方案
1. 果蝇饲养
- 为实验选择合适的果蝇品系。
注意：为演示本实验方法，我们使用了瞬时感受器电位 TRPA1 基因敲除品系及其遗传对照品系 w1118。 - 根据需要在一致的条件下维持果蝇品系的培养。为遵循本方案，将果蝇品系饲养在25 ˚C、12:12 昼夜循环条件下，并饲以标准培养基（玉米粉、糖蜜和酿酒酵母）。
- 使用轻度麻醉将雄性和雌性果蝇分离。
注意：根据实验需求，可使用处女蝇或已交配果蝇。- 让成年雄蝇和雌蝇（两个品系分别饲养）交配并产卵5天，随后移除成虫。
- 数天后当新成虫开始羽化时，再次清除瓶内成虫。2天后，使用轻度乙醚麻醉将雄蝇和雌蝇分离，并以每管25只果蝇的密度分别饲养使其成熟。
2. 预处理
- 施加预处理或独立变量，以定义实验组（遗传、环境、药物或其他因素）。
- 按照本方案，将成虫按性别分开，5天后，将其中一半成虫进行预处理：将装有生物体的密封小瓶浸入37 ˚C水浴中持续1小时。对照组则保持在25 ˚C培养箱中。预处理后，让果蝇恢复24小时，再进行耐热性检测。
3. DAM2 系统设置
- 将果蝇装入DAM2监测管中，并用棉塞将管的两端封住。如果需要立即评估果蝇的耐热性，则在将果蝇装入监测管时不得使用任何麻醉剂，以避免麻醉暴露可能带来的干扰效应。相反，应使用吸管从保藏小瓶中逐个吸取果蝇至监测管中。
- 将检测管放入活动监测仪中，并记录不同组别所对应的插槽编号。
注意：若监测仪内的位置可能被视为混杂变量，则可根据实验设计对插槽分配进行随机化。 - DAM2数据采集软件
注意：DAM2系统及其软件在公司网站上提供的DAMSystem3软件数据表中有详细说明（参见材料表）。有关具体故障排除和系统功能，请参考DAM2操作说明。以下内容将指导如何在本研究的耐热性检测中使用该系统。- DAM2系统可监测每根管内单个果蝇穿越红外光束的次数。数据采集软件会按预设的时间间隔对计数进行索引并重置。在偏好设置中，选择检测所用的读数间隔。我们发现15秒的读数间隔在分辨率和读数误差之间达到了良好平衡。
注意：建议读数间隔的秒数不应短于所使用的监测仪数量。较短的读数间隔虽可提高检测的时间分辨率，但也可能增加读数错误的发生频率。软件在尝试索引读数时可能出现滞后。此外，使用更新、更快的计算机可显著减少读数错误。 - 考虑到读数错误的可能性，应确保运行DAM2数据采集软件的计算机设置为从不进入睡眠或休眠状态，以免中断检测。此外，在数据采集期间，应将自动更新（包括任何由机构控制的网络更新）设置为关闭。
- 检查所有监测仪是否已连接并能与软件正常通信。在当前数据标签页下确认每个监测仪的状态指示为绿色。
注意：有关不同颜色代码所代表问题的详细信息，请参阅DAMSystem3软件数据表。 - 数据采集软件将自动把活动计数写入系统文件夹内数据目录下的文本文件中。为便于后续数据分析，建议在每次开始数据采集前，删除该数据文件夹中的所有文本文件。
注意：文本文件会自动重新生成，因此可安全删除旧文件以清除历史数据，不会影响程序运行。
- DAM2系统可监测每根管内单个果蝇穿越红外光束的次数。数据采集软件会按预设的时间间隔对计数进行索引并重置。在偏好设置中，选择检测所用的读数间隔。我们发现15秒的读数间隔在分辨率和读数误差之间达到了良好平衡。
4. 耐热性检测
- 将监测器放入检测用培养箱中。
- 启动采集软件，并在施加热应激前，让软件以设定的时间间隔（例如，若读取间隔设为 15 秒，则进行 40 次读数或 10 分钟）进行一定时长的索引采集。
注意：此步骤可使果蝇对监测管环境进行一定程度的适应，并从安装监测器过程中的移动中恢复。特别是当分析检测期间的活动性时，该适应期可在热应激诱导前建立基础活动水平。根据具体检测的性质，也可跳过此适应阶段，直接将监测器置于已达到应激温度的培养箱中。 - 若进行静态（TKD）检测，应在适应期结束后，将培养箱设置为尽快升至设定的有害温度。响应变量将以最后一次记录到运动的时间（即最后一个非零索引）来操作化，用于估算 TKD。
- 若进行动态检测，需在适应期后确定温度升高速率。此时所测量的响应变量在技术上仍为时间。最后一次运动记录的时间将对应某一特定温度（CTmax），具体取决于升温速率。
- 在采集软件的 DAM 系统显示界面中实时监测活动计数，或直接查看 DAMSystem3 程序文件夹中数据文件夹内的文本文件。请复制文本文件并打开副本，而非直接打开数据文件夹中的原始文件，以避免干扰正在进行的数据记录。
- 当所有果蝇均持续数分钟未见任何运动时，停止采集软件。
注意：在我们的检测中发现，数分钟的持续无活动状态表明果蝇因热应激已发生生理衰竭，这与经典的手动 TKD 检测中观察到的现象相似。然而，该现象依赖于果蝇的自发逃避行为。因此，若研究中的特定处理可能影响该行为反应，应考虑潜在的混杂因素。此外，根据检测的具体参数（如温度、处理方式），检测持续时间显然会有所不同。
5. 数据整理与分析
注意：有关如何从 GitHub 下载可执行应用程序以及软件基本功能的演示，请参见补充视频 S1。
- 数据采集完成后，使用引用的软件（参见材料表）扫描文本文件以检查错误，并为活动数据的分段时间区间选择特定的起始和终止点。如果设置了10分钟的适应期，则从活动记录开始后10分钟处开始分段时间区间。有关分段时间的更多细节，请参见讨论部分。
- 打开 HoTDAM! 分析软件，通过点击文件 | 加载监测数据导入已扫描的监测器数据文件。
注意：该软件及可执行应用程序可从 GitHub（https://github.com/MatthewR47/HoTDAM）或公司网站的分析软件部分获取。请注意，目前该可执行应用程序仅兼容 Windows 操作系统。 - 添加组别标识，以指明各处理组对应 DAM2 监测器中的哪个细胞通道。
注意：软件界面的布局与监测器的实际布局相对应。 - 点击开始多组定义，弹出对话框以添加将应用于多个细胞通道的组别标识。接受组别标识后，点击相应细胞通道以应用该标识，然后点击停止多组定义。
注意：该软件将对 DAMSystem3 数据进行组织，并导出为 .csv 文件，以便在统计分析软件中进一步处理。 - 通过点击文件 | 导出击倒数据 | 导出所有监测器或导出选定监测器，将每个监测器内果蝇的 TKD（即最后一个非零索引值）导出为 .csv 文件。输出文件中，每只果蝇的 TKD 将按其组别标识进行组织。
- 通过点击文件 | 导出活动数据 | 导出所有监测器或导出选定监测器，将每只果蝇的活动数据导出为 .csv 文件，仅保留时间戳和计数值数据，以简化后续数据处理，同时为每只果蝇分配指定的组别标签。
注意：DAMSystem3 数据文件的前几列包含监测器在数据采集期间的内部信息（例如光照监测或错误消息）。计数数据位于第11至42列（详见 DamSystem3 数据表）。使用该分析软件导出活动数据时，将自动删除除时间戳和计数数据列之外的所有列。 - 若进行 CTmax 实验，可利用 TKD 和温度升高速率来确定 CTmax。
注意：该分析软件采用 C# 编写，具有面向对象的结构（源代码可在 GitHub 获取：https://github.com/MatthewR47/HoTDAM），程序的各个部分可轻松修改，便于根据特定需求进行定制化调整。
6. 统计学
注意：根据实验设置的具体情况，可以使用多种不同的测试方法来分析 TKD 数据。
- 使用生存分析（例如，Cox 回归、Kaplan-Meier）将基因敲低视为实验中每只果蝇都将经历的一个事件。
注：有关详细综述，请参见 Bradburn 和 Clark 撰写的四篇系列论文，讨论生存分析及其实施方法5,6,7,8。 - 使用方差分析（ANOVA）评估组间差异并比较不同模式，尤其是在针对特定条件验证自动化实验时。
- 采用 Kaplan-Meier 生存分析方法分析 TKD 数据。按品系拆分文件，使分析分别进行（例如，针对 TRPA1 和 w1118 品系）。选择时间变量为TKD（单位为min），敲低作为事件，预处理作为因素，性别作为分层变量。
- 进行 log-rank、Breslow 和 Tarone-Ware 检验，以比较每一层（即性别）的预处理情况，以示例方式展示多种方法。
- 绘制生存曲线图。
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结果
TRPA1 和 w1118 品系的分析分别进行。截尾百分位时间及其他描述性统计结果见表1。
...| 百分位数a | ||||||||
| 性别 | 处理方式 | 25.00% | 50.00% | 75.00% | ||||
| N | 估计值 | 标准误 | ||||||
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讨论
本文所述的耐热性测定方法具有多功能性和可扩展性。我们此前已发表了一项验证研究，将HoTDAM!方法与经典的基于观察的TKD测定法进行了比较，发现自动化测定法在多个因素上呈现出相同的总体趋势4（图3）。换句话说，与传统的手工TKD测定法一样，DAM2自动化测定法能够根据性别、测定温度、热适应预处理以及测定前热适应预处理后的恢复时间来区分生物个体。尽管自动化测定法被认为更具客观性，因为其TKD结果不依赖研究人员的主观观察，但我们的数据并未表明该方法在检测效应方面明显优于手工测定法。我们发现两种测定方法在精确度方面相当，甚至在某些方面，自动化测定法的效应量略小（详见Rokusek等4发表的补充材料中关于验证研究中自动化DAM2测定法与手工观察法的详细描述性统计与方差分析数据）。造成这一现象的原因可能与两种测定方法在TKD测量指标上的内在差异有关，下文将对此进行详细讨论。
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披露
作者声明不存在利益冲突。
致谢
本项目获得了美国国立卫生研究院普通医学科学国家研究所的机构发展奖（IDeA）资助（5P20GM103427 和 1U54GM115458）。同时得到内布拉斯加大学卡尼尔分校本科生研究学者计划以及内布拉斯加医学中心医学生暑期研究计划的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 14 mL 聚苯乙烯试管 | Falcon | 352057 | |
| 30 加仑鱼缸 | Wal-mart | ||
| 8 盎司瓶子 | Genesee | 32-129F | |
| 恒温恒湿培养箱 | Memmert | HPP750eco | |
| 玉米粉 | Lab Scientific | FLY801010 | |
| DAM2 果蝇活动监测仪 | TriKinetics | DAM2 | (DAMSystem3 数据表) https://www.trikinetics.com/Downloads/DAMSystem%20Price%20List%202024.7.pdf |
| DAMSystem 数据采集软件 | TriKinetics | 免费下载 | |
| 果蝇琼脂 | Lab Scientific | FLY80201 | |
| 乙醇 | Fisher Scientific | BP82011 | |
| 乙醚 | Fisher Scientific | E134-4 | |
| FileScan 软件 | TriKinetics | 用于扫描文本错误、数据分箱和输出 | |
| Genesee 瓶用封口棉 | Genesee | 49-100 | |
| Genesee 试管用封口棉 | Genesee | 49-102 | |
| Genesee 试管 | Genesee | 32-113RL | |
| HoTDAM 软件 | Github 或 Trikinetics | https://github.com/MatthewR47/HoTDAM | |
| 浸入式循环加热器 | PolyScience | MX-CA11B | |
| 糖蜜 | Lab Scientific | FLY80084 | |
| 丙酸 | Fisher Scientific | A258-500 | |
| DAM2 用 Pyrex 玻璃管 5 × 65 mm | TriKinetics | PGT 5x65 | https://www.trikinetics.com/Downloads/DAMSystem%20Price%20List%202024.7.pdf |
| 小型毛笔 | Wal-mart | ||
| SPSS Statistics | IBM | ||
| 丙酸钠（tegosept） | Lab Scientific | FLY55015 | |
| 面包酵母（torula yeast） | MP Biomedicals | 290308505 | |
| TRPA1 突变品系 | Bloomington Stock center | 26504 | w[1118]; TI{w[+mW.hs]=TI}TrpA1[1] |
| w1118 品系 | Bloomington Stock center | 3605 |
参考文献
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