大鼠迷走神经直接注射操作方案

摘要

我们介绍一种用于大鼠的直接迷走神经注射方案，可将药物直接递送至神经内部，且不会引起注射后的并发症。该方法适用于涉及自主神经系统调控的临床前神经科学研究。通过必要的修改，该技术也可用于大鼠及其他物种其他神经的直接注射。

摘要

目前存在大量促进药物递送至中枢神经系统的策略与方法。然而，直接向周围神经系统递送药物的研究相对较少，可供研究人员参考的详细方法学文献也较为有限。本文介绍一种以迷走神经为模型神经的周围神经系统药物直接注射技术。该方法可用于治疗自主神经系统疾病，特别是通过靶向左侧迷走神经实现药物干预，且经适当调整后，亦可推广至其他神经的直接注射。本文详述了在麻醉成年大鼠身上、于解剖显微镜下进行显微外科手术操作的全部关键步骤。文中还描述了使用示踪染料以实时监测注射准确性的方法，并提供了成功与失败注射案例的图示。若操作得当，迷走神经直接注射可安全实施，大鼠耐受性良好，且无术后并发症。例如，在术者完成本方法培训后，连续六只大鼠均成功完成注射，无一出现并发症。该直接神经注射方法适用于临床前大鼠研究，可实现包括但不限于基因治疗在内的多种试剂向周围神经的递送。

引言

正确应用给药方法是获得成功治疗效果的关键因素之一。尽管向中枢神经系统（CNS）递送治疗剂的方法众多，但通过直接神经注射将药物递送至周围神经系统（PNS）的方法报道较少。直接神经注射，例如向大鼠背根神经节（DRG）注射，已在临床前研究中被尝试用于更深入地理解疼痛机制、药物毒性、基因转移^1,2,3以及通用方法的开发^1,4。其他关于直接神经注射的报道包括脊神经注射⁴、坐骨神经注射¹，以及在大鼠⁵和小鼠⁶中的迷走神经注射。最近，有研究提出了一种软骨上注射方法，以改善治疗药物在兔视神经乳头中的分布⁷。

由于背根神经节（DRG）中的细胞体具有感觉功能，因此DRG被认为是直接注射携带转基因的载体（如腺相关病毒（AAV））的理想部位²。已有研究描述了DRG注射的手术和非手术方法

方案

以下方案根据机构伦理准则以及机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准进行。

1. 实验环境准备

注意：本方案适用于至少2个月大的成年大鼠。较小的动物（包括小鼠和更年轻的大鼠）虽然可行，但不推荐，且操作难度将显著增加。

1. 在迷走神经手术前48小时，提供湿润的颗粒饲料或任何其他软质食物（如兽医康复凝胶）。由于动物在术后可能难以进食，应在手术前向动物引入这些食物，帮助它们熟悉其味道，并激发进食意愿。
2. 大鼠应在手术前至少1周以及术后1周内单独饲养于笼中（或根据机构指南执行）。这有助于它们适应独居带来的应激，并防止术后被同笼动物抓挠伤口。

2. 手术物品和空间的准备

1. 提前列出手术所需的所有物品清单，并仔细检查所有物品是否均已备齐。
2. 手术前使用适当的灭菌方法对所有物品进行灭菌处理。
3. 在解剖显微镜下设置无菌手术区域。在显微镜下方放置加热垫，以保持大鼠在手术期间体温。
4. 将所有手术器械放置在覆盖无菌巾的手术台上。在解剖显微镜下预留足够的手术操作空间。确保显微镜焦距处于最佳状态，能够完整观察到手术区域及神经结构。
5. 将注射泵放置在靠近手术台的位置，确保输液管长....

结果

本研究共使用六只成年大鼠（3只雄性，3只雌性）。其中一只大鼠被多次注射，以展示注射失败的情况，表现为染料在注射部位周围扩散（图5A）。其余所有大鼠均显示注射顺利且神经染色清晰，如图4B和图5B所示。

图1 展示了一种情况：当注射针与导管的连接设置不正确时，染料在针头与导管之间发生泄漏。本实验所用的1%染料并不太黏稠，但由于密封不严，染料无法顺利通过注射针。此类问题在引液过程中很容易被发现（见步骤5.2）。为解决此问题，应检查针头与导管之间的连接是否正确。确保约有3 mm长的针头已插入导管中，并确认导管与针头的尺寸匹配。在纠正错误连接后，应重新进行引液操作，特别是当引入了气泡时（重复步骤5.2）。

讨论

直接注射至大鼠左侧迷走神经的方法可安全实施，且术后无并发症。向迷走神经递送药物可用于靶向自主神经系统（ANS）。该方法包含若干关键步骤，需要经过练习并具备中等到较高的外科操作技能。

该手术操作需要在大鼠中实施平衡的全身麻醉。外科医生应尽量缩短手术时间，以减少麻醉剂的暴露，从而促进更好的术后恢复，尤其是在老年大鼠中。该方法还要求手术者具备经过训练的无菌外科技术，以确保注射操作和术后恢复的成功。迷走神经的解剖位置深在且处于关键区域¹³。左侧迷走神经与左侧颈总动脉并行走行，在分离和注射过程中存在损伤动脉和神经的风险。正确分离迷走神经与颈总动脉需要较高的操作熟练度和技术水平。在操作过程中，应以适当的角度牵拉神经，同时保持针头位于神经内部。

尽管目前仅有同一研究团队发表的两篇关于大鼠⁵和小鼠⁶直接迷走神经操作的文献，但这两项研究均缺乏对手术操作过程的详细描述。使用35 G针头注射神经具有操作便捷.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 mL BD 结核菌素注射器，带可拆卸 25 G x 5/8" 针头	Becton, Dickinson and Company	SKU:309626	用于连接弯针以牵拉迷走神经，并在注射时固定神经。
0.5% 盐酸布比卡因注射液	Hospira	NDC 0409-1162-19	局部麻醉药，用于局部组织麻醉。
100 mL 0.9% 氯化钠注射液 USP	Stericare Solutions	Item #6240	生理盐水，用于大鼠及组织的再水化。
20 个钝头牵开器头，7.5 mm	Kent Scientific Corporation	Surgi 5018	用于手术时分离并固定组织。
3 mL BD-Luer-Lok 注射器，无菌，一次性使用	Becton, Dickinson and Company	SKU # 309657	用于向大鼠注射生理盐水，并将生理盐水注入聚乙烯导管中。
AK-Fluor10%	Akorn	NDC 17478-253-10	可在神经内显影的荧光素染料，用于追踪注射的准确性。
动物体重秤	Kent Scientific Corporation	SCL 4000	用于测量大鼠体重。
Ansell ENCORE Perry Style 42 PF 外科手套	Ansell	ASTM D3577	无菌手套，供外科医生在手术时使用。
人工泪液软膏 3.5g	Pivetal	NDC 46066-753-55	用于眼部，防止眼睛过度干燥。
婴儿-迈斯特止血钳	Fine Science Tools	13013-14	用于紧急情况下的止血，也可用于弯曲 25 G x 5/8" 针头。
BD Intramedic PE 导管	Becton, Dickinson and Company	14-170-12A	用于注射装置系统，连接 Hamilton 针头和 NanoFil 针头，同时容纳注射混合液。
BD Precison Glide 针头，25 G x 5/8"	Becton, Dickinson and Company	REF#305122	用于向大鼠注射生理盐水，以及制作弯针。
BD Precison Glide 针头，27 G x ½"	Becton, Dickinson and Company	REF#301629	用于将无菌生理盐水注入 BD 皮内导管中。
Benchmark Accuris ”NextPette” 可调体积移液器微型起始套装，包含 4 支移液器：10/20/200/1000 μL，另附支架	MilliporeSigma	BMSP7700S1	用于移取无菌溶液。
聚维酮碘 10%（Betadine）	Honestmed	67618015017	用于手术区域的消毒。
卡洛芬注射液 50 mg/mL	由 Covtrus 提供 (6451506845)	SKU 591149	本实验中，我们使用了由德克萨斯大学西南医学中心动物资源中心提供的稀释卡洛芬，剂量为 5 mg/kg。
弯针（定制）	Becton, Dickinson and Company	REF#305122	使用止血钳将 BD PrecisionGlide 25 G x 5/8" 针头弯曲成 90 度，针尖磨钝。使用前需灭菌。用于钩住迷走神经，并在分离和注射时固定神经。
解剖显微镜	Motic	SMZ-171-BLED（带光源双目镜）	用于迷走神经分离、注射及检查注射渗漏时放大关键解剖区域。
手术单	Dynarex	Reorder#8122	灭菌后用作手术覆盖布。
Dukal 棉签，非无菌	Dukal	Item 9003	用于钝性分离组织，使用前需灭菌。
Dumont #7 精细镊子	Fine Science Tools	11274-20	用于将左侧迷走神经从颈总动脉分离。其弯曲设计便于操作。
Ethicon PDS II 无染色单丝缝线 - 缝线，4/0 18 PDS II CLR MONO PS	Ethicon	VA - Z682G	用于伤口缝合。
Ethilon 尼龙缝线 黑色单丝	Ethicon	1856G	在使用不可吸收缝线时用于伤口缝合。也可用于钩住大鼠门齿，将鼻部固定于鼻罩内。
精细镊子 - 镜面抛光	Fine Science Tools	11412-11	用于将迷走神经从颈总动脉分离。此为直头镊子。
精细剪刀 - 锐利型	Fine Science Tools	14060-09	用于剪切组织。
Hamilton 清洁液	Hamilton	HT18311	用于使用后清洁 Hamilton 设备。
Hamilton 针头，27G，小针座 RN 针头，2”，PT3，6/包	Hamilton	7762-01	用于连接 BD Intramedic™ PE 导管。
Hamilton 注射器，710RN	Hamilton	7638-01	用于迷走神经注射时容纳药物。
胰岛素注射器	EXEL INT, Comfort point	REF 26027	用于注射卡洛芬和局部麻醉药。
利多卡因 2% 注射液	Covetrus	Reorder#002468	用于与布比卡因混合后在切口部位注射。
Luxol 快蓝 MBSN	Acros Organics	212170250	可在神经内显影的染料，用于与药物混合，使注射混合物可见。
玻璃珠微型灭菌器	Fine Science Tools	Item No. 18090-46	用于大鼠手术过程中间歇性灭菌手术器械。
NanoFil 针头-NF35BV-2	World Precision Instrument	NC9708956	用于将药物-染料混合物注入迷走神经内。
Olsen-Hegar 带剪刀的持针器	Fine Science Tools	12002-12	用于伤口缝合。
Parafilm M 实验室包裹膜，4 英寸 x 125 英尺，每盒 1 卷，共 12 卷	Honestmed	PM#996	用于承载分装的 5 μL 药物-染料混合物，以便准确将混合物装入 BDTM 皮内导管。
PDI 酒精消毒棉片	Honestmed	NDC 10819-3914-2	用于手术区域的消毒。
Premium Care 无菌 VII 型纱布垫，8 层，2" x 2"	Dukal	Item C5119	手术时置于大鼠颈部下方作为垫衬。
Press’n Seal 保鲜膜	Glad		用于手术时覆盖大鼠，起到类似手术单的作用。
大鼠牵开器套装	Kent Scientific Corporation	Surgi 5002	用于保持切口开放，便于将迷走神经从颈动脉分离。
RightTemp Jr.	Kent Scientific Corporation		20.3 cm 宽 x 25.4 cm 长（8 英寸宽 x 10 英寸长），用于保持大鼠体温。
S&T 镊子 - SuperGrip 尖端	Fine Science Tools	00632-11	缝合时用于夹持组织而不造成损伤。
S&T 缝线打结镊子	Fine Science Tools	00272-13	用于收紧缝线。
手术刀片 #15	Fine Science Tools	10015-00	用于在颈部腹侧皮肤做切口。
手术刀柄-#7	Fine Science Tools	10007-12	用于固定手术刀片。
注射泵	KD Scientific	78-81-8052GL	序列号 D107034，型号 LEGATO-180，为可编程泵，可在程序控制下泵送小体积混合液。
TipOne 滤芯吸头补充起始系统	USA Scientific	Item #1120-3510	用于移取药物和染料混合物。
异氟烷蒸发器，漏斗加液型	Kent Scientific Corporation	Vetflow 1231	用于麻醉大鼠。
Vetbond 组织粘合剂	3M Science Applied to Life	ID B00016067	在缝合不理想时，用于封闭切口处的组织。
Wahl BravMini+ 专业无线剪毛器套装	Kent Scientific Corporation	CL7300-Kit	用于剪除大鼠毛发。