一种新颖且高效的方法 黑腹果蝇 心脏冷冻切片荧光染色

摘要

Drosophila 心脏切片与荧光成像方案简化了心脏结构与病理学的研究。该方法包含简单的切片、染色和成像步骤，避免了传统解剖所需的技术专长。此方法提高了可及性，使 Drosophila 成为更广泛适用于整个科学界心脏相关研究的模型。

摘要

Drosophila 心脏模型被广泛用于研究心脏衰老及模拟 人类心脏疾病。然而，在成像前对 Drosophila 心脏进行解剖是一项精细且耗时的过程，需要高级的训练和熟练的操作技能。为应对这些挑战，我们提出了一种创新性方案，利用冷冻切片技术对 Drosophila 心脏组织进行荧光成像。该方案已在成年 Drosophila 心脏成像中得到验证，但也可适用于发育阶段的研究。该方法在保持组织完整性的前提下，显著提高了荧光染色的效率和可及性。本方案在不牺牲成像质量的前提下简化了操作流程，从而降低了对具备高度训练水平和操作技能的技术人员的依赖。具体而言，我们用更简便的组织包埋等方法取代了毛细管负压吸引等复杂技术。该策略使得心脏结构的观察更加简便且具有更高的可重复性。我们通过有效检测关键心脏标志物，并 实现高分辨率的荧光与免疫染色成像，展示了该方案的实用性，揭示了心脏形态及细胞组织的精细结构。该方法为研究 Drosophila 心脏生物学的研究人员提供了一种可靠且易于使用的工具，有助于深入分析心脏发育、功能及疾病模型。

引言

心血管疾病（CVD）是全球首要死因，每年导致约1790万人死亡，占全球死亡总数近1/3^rd 全球所有死亡人数中的比例。 黑腹果蝇 （通常称为果蝇）被广泛用作研究心脏发育、生理学、代谢、衰老及心肌病的遗传、细胞和分子基础的模式生物^{1,2,3,4,5,6,7,8,9}. 果蝇 模型还被用于研究心肌在全身性肥胖调控中的作用¹⁰心血管疾病发病和死亡的主要危险因素。 果蝇 基因组测序研究¹¹ 揭示了人类基因存在显著的保守性，包括那些与多种器官（如心脏）发育相关的基因。在这些高度保守的基因中，部分基因与心脏功能障碍相关，例如心肌病或离子通道病。³近年来，研究心脏功能的有效技术不断发展，这拓展了该模型的应用范围，可用于探索运动、饮食和衰老等因素引起的心脏生理学长期变化⁸然而，技术和后勤方面的挑战常常阻碍了该模型系统的应用。使用该系统的一个挑战在于 黑腹果蝇 在心脏研究中，精确地解剖心脏以保留其细胞结构和心肌成分至关重要。

该 果蝇 心脏或背血管由单层心肌细胞构成的管状结构组成，其管壁附有围心细胞，由悬肌支撑，在成体中还伴有腹侧纵行肌细胞层¹²准确解剖以暴露这些精细结构是一个耗时且费力的过程。目前的标准方法包括技术难度较高的解剖操作和毛细管负压吸引，需要经过高级培训并具备熟练的运动技能。^13,14,15,16通常，解剖从以下步骤开始 切开腹壁，以及存在的挑战 迅速熟悉心脏的微细解剖结构及其 脆弱的结构，以及难以接近的背侧位置。 结合传统解剖技术，可实现对心脏结构和功能的精确分析，为研究心血管疾病提供了更先进的工具 在 果蝇¹³例如，Alayari 等人利用该方法提供了一种荧光标记的实验方案 果蝇 心脏结构，有助于观察心脏的形态与构造。尽管如此，传统的心脏解剖与染色仍面临诸多挑战，包括难以维持组织完整性以及有效进行心脏染色所需的专业培训。

该方法通过采用一种更简单的方案，以冷冻包埋技术取代整个原有流程，为解决这一问题提供了创新性方案 果蝇 胸部和腹部组织的免疫染色及荧光成像。这种易于掌握的方法可确保更快速、更高效 心脏结构的直观可视化，且具有更高的可重复性。此外，我们介绍了一种涉及干冰的简便方法，可确保样本的均匀排列 果蝇 在同一z平面平整腹部角质层，以简化后续的冷冻切片步骤。我们通过免疫荧光和共聚焦显微镜技术，展示了该方案在检测关键心脏标志物、心脏形态及细胞结构组织方面的有效性。该方法操作简便且效率高，特别适用于高通量研究。 果蝇基于的心脏研究。

方案

1. 仪器设备的准备

1. 确保冷冻切片机已开启并设置为 -20 °C。留出足够时间使温度降至该设定值。若设备处于室温状态，冷却至最佳切片温度约需 5 小时。
2. 开启载玻片加热台或孵育箱，并将其设定为 37 °C。确保载玻片有足够时间升至所需温度。
   注意：在此阶段，已标记的载玻片可放置于加热台或孵育箱中，并可无限期保存直至开始切片。
3. 确保干冰已准备就绪可供使用。一旦完成第 5 步，即可从 –80 °C 的储存环境中取出冰块。

2. 溶液的配制

1. 配制 50 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）。配制 10 mL 浓度为 10 mM 的乙二醇四乙酸（EGTA）PBS 溶液。配制 4% 多聚甲醛 PBS 溶液，终体积为实验组数乘以 100 µL。
2. 在水中配制70%乙醇的清洁溶液 喷雾瓶。配制所有荧光染色溶液。
   注意：本方案将详细说明如何执行简单的 使用简单的荧光染料或染色剂进行染色。在此 在本案例中，我们将描述使用1x鬼笔环肽594 PBS 中 1:250 的比例。荧光染料浓度 将根据试剂和实验的不同而有所变化 目标。应进行初步测试以确定 适当浓度。抗体染色将不会 此处未详述，但应可适用于传统方法 染色方法

3. 组织采集

1. 使用 CO₂ 麻醉垫麻醉 5-10 只果蝇，并在显微镜下（1x-2x 放大倍数）将果蝇置于视野范围内。CO₂ 调节器连接至 CO₂ 麻醉垫的压力应维持在 1 至 5 kPa 之间。
   注意：也可采用其他麻醉方法（例如 FlyNap²），这些方法对实验结果无显著影响。
2. 使用弹簧剪刀将 5 至 10 只果蝇去头，并剪除翅膀和腿部。剩余部分为胸部和腹部，统称为果蝇躯体。
   注意：为确保在第 5 步中果蝇躯体能够正确对齐，残留的翅或腿不得妨碍其在模具底部平放。为此，应尽可能贴近胸部将翅和腿完全剪除。
3. 使用毛刷轻轻将果蝇躯体转移至预冷并已标记的 1.5 mL 离心管中，置于冰上保存，直至所有实验组样本收集完毕。

4. 全组织固定

1. 从冰上取出离心管后，向每管中加入 100 µL 10 mM EGTA（pH 8），以松弛腹部内的心脏组织。确保所有样本完全浸没于溶液中，并在轨道摇床上孵育 10 分钟。 可使用台式离心机帮助样本完全沉入溶液中。
2. 移除并弃去管中的溶液。每管加入 100 µL PBS，置于轨道摇床上清洗组织 10 分钟。孵育结束后移除并弃去 PBS。
3. 每管中加入 100 µL 含 4% 多聚甲醛的 PBS 溶液。确保所有样本完全浸没于溶液中。
4. 将样本置于轨道摇床上，以约 100 单位的速度振荡 15 分钟。注意调整速度，避免组织因剧烈振荡而脱离溶液接触。
5. 孵育结束后，弃去多聚甲醛溶液，更换为 1× PBS 溶液，孵育 10 分钟，确保所有样本均与溶液接触。将离心管重新放回轨道摇床，速度与步骤 4.4 相近，后续每次洗涤均以此条件进行。
6. 每次弃去前一步溶液后，用 PBS 清洗组织 2 次，每次 10 分钟，共完成 3 次洗涤。
7. 最后一次洗涤结束后弃去 PBS 溶液，将样本转移至含 10% 蔗糖的 PBS 溶液中，确保样本在管内与溶液充分接触。为达到最佳饱和效果，建议过夜孵育，或孵育足够长时间直至样本沉降至管底。
   注意：推荐过夜冷冻保护处理；若需当日成像，则应尽可能延长冷冻保护剂渗透时间。

5. 模具制备

1. 此时，从储存处取出干冰，并挑选几块放入一个小的金属或塑料托盘中。托盘的尺寸应能使模具插入，并直接放置在一块较大且尽可能平坦的干冰上。
2. 用标签标明的模具，将其约50%的空间填充为最佳切割温度（OCT）包埋剂。通过缓慢倾倒包埋剂以减少气泡的产生。
3. 使用刷子，小心地将样本放置在模具内OCT包埋剂的表面。多个实验组在此阶段应明显分开。
   注意：必须防止刷子携带蔗糖溶液污染OCT包埋剂而导致其稀释。此外，使用刷子将样本压入OCT深层可能产生大量气泡。应避免这些错误，以防后续切片出现问题。
4. 使用镊子将每个样本的胸腹部背壁轻轻推至模具底部，通常沿底部推进。然后调整样本位置，优先使腹部平整地贴合模具底部。在X、Y和Z三个维度上对齐所有样本，以确保每个切片能同时包含所有样本。
5. 腹部可能存在弯曲，尤其是雄性样本；应尽可能将其展平。这对于在冠状面获取较长的连续切片至关重要。在此过程中应避免样本被刺破或压碎在模具底部。需系统性地操作，确保每个样本正确对齐。
6. 当所有样本就位后，将模具底部直接放置在一块干冰上。观察接触干冰数秒后OCT是否开始冻结。持续冷却，直至所有样本均被模具中已冻结的部分完全包裹。
7. 达到此阶段后，将模具转移至-20 °C环境中，使其整体完全冻结。待第一部分完全冻结后，填充模具剩余空间。随后可将模具用铝箔包裹后储存于-80 °C以备后续使用，或立即进行切片。
   注意：在-20 °C和-80 °C两个冷冻阶段之间，应避免模具暴露于空气中。否则可能导致层间产生水分。

6. 模具的冷冻切片

注意：通常建议在切割实验组模具之前，先制备并切割一个空白模具。这有助于我们在切片组织前立即确认切片机转轮、刀片以及防卷玻璃的正常功能。此外，从较冷储存环境中取出的任何模具，应在冷冻切片机中适应30分钟后再使用。

1. 将OCT充分涂抹于组织块上，然后将夹头钻头置于其顶部并压平，将其固定在模具上。在冷冻切片机中冷冻至完全凝固，通常需要5分钟。
2. 将钻头和OCT包埋块从模具中取出，放入夹头中，确保包埋块保持从上到下的正确方向。用夹头钥匙拧紧，直至钻头固定牢固。
3. 使用调节旋钮和夹头深度控制装置，将包埋块与刀片对齐。设定切片厚度为20 µm或更小。
   注意：切片越薄，可收集的切片数量越多，越有利于实验。每位受试者的前2–6张切片应包含所需的心脏无遮挡区域，该区域取决于包埋方向和切片厚度。在开始切取关键的前2–6张切片前，必须确保夹头方向调整准确。
4. 以缓慢但稳定的速度进行切片，使每张切片被防卷曲玻璃板捕获。使用预热的载玻片收集切片。切片后，载玻片在室温下干燥至少30分钟，但不得超过1小时，然后进行第一轮洗涤。

7. 荧光染色

1. 干燥结束后，立即使用剃刀片去除组织切片周围多余的OCT包埋剂。此步骤需小心操作，避免触碰到组织。若切片需在后续时间点进行染色，则应将其储存于-80 °C。
2. 使用疏水性标记笔在每张切片上勾画出该边界。此边界的作用是防止洗涤液和染色液从组织区域流失。
   注意：本方案描述了使用移液法进行染色和洗涤的步骤，也可使用切片桶和支架。只需将移液加样替换为将切片浸入各新鲜溶液中即可。正如我们近期在脑成像研究中所做¹⁷，该免疫染色流程同样适用于心脏组织染色。
3. 使用1000 µL移液器及配套枪头，轻轻将PBS溶液加至切片表面，对所有切片进行3次洗涤，每次5分钟。尽可能避免将液体直接加在组织上。操作时请勿快速喷射溶液，以免导致组织从载玻片表面脱落。
4. 弃去最后一次洗涤液，用移液器将荧光染色液（1:250，1x Phalloidin）加至组织上。室温避光孵育1小时。
5. 此后样本对光敏感。所有后续操作均需在避光条件下进行，或用遮光物覆盖切片。弃去荧光染色液，使用1000 µL移液器以PBS洗涤3次，每次5分钟。

8. 成像用样品的封片与制备

1. 弃去最后一次洗涤液，使载玻片上保留少量 PBS。使用 1000 µL 移液器将 3–5 滴封片剂滴加到载玻片上，注意避免直接滴在组织上。
2. 将盖玻片放置于载玻片上，尽量减少气泡产生。为方便操作，可用镊子夹住盖玻片一端，使其一边接触载玻片边缘，再逐渐放下另一侧，直至完全贴合。小心处理新封片的样本，将其平放于 4 °C 环境中至少保存 24 小时  。
3. 使用指甲油密封载玻片；若封片剂本身具有固化特性，则无需密封。避免使用含荧光或亮片成分的指甲油。根据所用荧光染料的不同，可立即进行成像，或保存载玻片以备后续成像使用。

9. 成像

注意：使用配备10倍、40倍和60倍物镜的奥林巴斯BX63显微镜进行图像采集。同时使用适用于DAPI、Lipid Spot 488和Phalloidin 594的相应滤光片。

1. 成像前检查载玻片，并使用擦镜纸和70%乙醇水溶液清洁。若在封片后立即进行成像，清洁时需格外小心，避免扰动盖玻片。
2. 根据整个实验中荧光信号最强的样本，为每个通道选择合适的曝光时间。在尽可能获得明亮图像的同时避免信号饱和，并尽量降低背景。使用各通道的实时预览快速检查每个实验组，确保曝光设置恰当。
3. 对每个样本进行聚焦时，应始终使用相同的通道以保证一致性。随后采集每个样本的图像。用于比较的所有实验组应在同一天完成图像采集，以避免不同组间因荧光衰减差异而影响结果。
4. 成像后，将载玻片置于避光条件下，于4 °C保存，以便后续重新成像。

结果

上述方法无需繁琐的解剖步骤，即可利用荧光成像技术对黑腹果蝇（Drosophila）心脏进行研究。这是该方法的主要优势，因为传统的心脏解剖方法需要掌握复杂的操作技能。如图1所示，该方法比心脏解剖更易于新研究人员掌握，并提供了更高的实验灵活性。此外，在OCT包埋模具阶段可将样本储存于-80 °C，数周后仍可使用。技术人员无需长时间培训即可学会简单的解剖与包埋技术，因此该方法具有很高的可及性。

使用该方法可在图2中观察到果蝇（Drosophila）心脏的主要结构特征，例如心室孔（Ostia）、瓣膜、纵向纤维（支持纤维）和环向纤维（收缩纤维）均得以保存。在衰老及病理条件下，心脏核心结构组分的保存至关重要。除了心脏收缩结构外，本方法还可用于观察脂肪体（与人类肝脏同源²，见图3）、体壁肌肉（心脏管的两侧）以及腹部其他结构，从而为心脏管...

讨论

我们开发了一种高效的方法，用于制备可用于荧光或共聚焦成像观察的Drosophila心脏管。在此之前，本文首先讨论了一种常用但耗时且劳动密集的方法，用于获取并监测Drosophila心脏的细胞学完整性。我们创新且高效的方法通过直接冷冻包埋技术，为传统方法提供了简洁高效的替代方案，该方法可保持Drosophila心脏管的结构完整性。在利用显微镜技术观察Drosophila解剖结构时，保持结构完整性至关重要，且必须根据特定组织或器官进行相应调整。以往的方法包括显微解剖，随后进行固定和染色，该过程繁琐且需要特定的专业技能^2,13,15。我们近期已报道了针对Drosophila脑组织的固定、包埋及冷冻切片 方法¹⁷，然而目前尚无适用于Drosophila心脏染色的类似方案。因此，本方案专门优化用于<...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1000 µL 移液器	Eppendorf	3123000063
1000 µL 移液器吸头	Olympus Plastics	23-165R
10X 磷酸盐缓冲液（PBS）	Fisher	J62036.K7	ph=7.4
200 证明乙醇	Decon Laboratories	64-17-5
20X Tris 缓冲盐水	Thermo Scientific	J60877.K2	pH=7.4
防滚玻璃片	IMEB	AR-14047742497
牛血清白蛋白	Fisher	9048-46-8
离心管 1.5 mL	Fisher	05-408-129
带电载玻片	Globe Scientific	1415-15
冷冻切片模具	Fisher	2363553
冷冻切片机	Leica	CM 3050 S
冷冻切片机刀片	C.L. Sturkey	DT554N50
干冰
精细镊子	Fine Science Tools	11254-20
果蝇操作垫	Tritech Research	MINJ-DROS-FP
含 DAPI 的硬化封片介质	Vectashield	H-1800
吸水纸（Kimwipes）	Kimtech	34120
显微镜	Olympus	SZ61
最佳切割温度包埋剂（OCT 化合物）	Fisher	4585
20% 多聚甲醛	Electron Microscopy Sciences	15713
Phalloidin 594	Abnova	U0292
剃刀刀片	Gravey	#40475
弹簧剪	Fine Science Tools	15000-10
蔗糖	Fisher	S5-500