位置特异性 GABAA 受体亚基错义变异在海马锥体神经元中的作用的鉴定和分类

Summary

本研究引入了一个多尺度框架，涵盖从 DNA 到蛋白质功能和神经行为。它提出了一种研究 GABA_A 受体亚基中预测的致病性突变的新方法，假设预测为致病性的致痫突变和近端突变可能对 CA1 锥体神经元模型产生类似的影响。

Abstract

了解癫痫相关基因中功能未知变异的影响对于阐明疾病病理生理学和开发个性化疗法至关重要。在从 DNA 序列到蛋白质功能和神经行为的多尺度框架下，我们描述了一种预测和研究致病突变的新方法，假设 GABA_A 受体亚基中的致癫痫突变和附近的预测突变可能对 CA1 锥体神经元模型产生类似影响。通过探讨预测的致病突变与近端致痫突变之间的特征关系，本研究旨在根据致癫痫突变对海马锥体神经元模拟的影响来估计预测突变的影响。

该方法从收集 GABA_A 受体 γ2 亚基遗传数据开始，然后使用自定义脚本在 R 中执行数据清理和格式化。接下来，将应用集成预测器来识别和优先考虑 γ2 亚基的致病性错义变体。将说明将特定的致病性变异（预测的）映射到致癫痫突变共享的亚基结构域，并附有其影响的分子建模和进化保守性的考虑。然后，将进行变异特异性荟萃分析和参数归一化，然后进行相关性分析，以确定预测突变和近端致痫突变之间的任何显着关系。使用基于 Python 的神经模拟器，将描述基于多区室电导的神经元模型，反映野生型和致癫痫突变体的作用。将考虑模拟致癫痫性 GABA_A 受体亚型产生的神经反应，以粗略估计预测的致病性变异对神经反应的影响。据我们所知，这是第一个探索多尺度框架的方案，用于估计 GABA_A 受体变体对神经元行为的影响，这对癫痫研究至关重要。该方案可以作为增强由与癫痫相关的 GABA_A 受体的潜在致病性变体引起的细胞表型预测的基础。

Introduction

对于几乎所有的人类疾病，遗传变异在个体易感性中起着重要作用。因此，了解序列变异与疾病风险的关系为揭示疾病发展中涉及的关键过程并确定预防和治疗的新方法提供了一种有价值的方法¹。这也适用于神经发育障碍，神经发育障碍是儿科初级保健中最普遍的慢性疾病^{之一 2}。自闭症谱系障碍、智力障碍和癫痫等疾病说明了遗传变异如何显着影响发育过程中的个体易感性³。

发育中的大脑比成人大脑更容易患癫痫发作，因为在兴奋和抑制之间的关键平衡中，遗传程序性神经发育不匹配⁴。由于 GABA（γ-氨基丁酸）是成人大脑中的主要抑制性神经递质，在胚胎和出生后早期发育过程中具有兴奋性，因此不利于防止年轻大脑癫痫发作所需的稳定性。这种临时状态是由 K-Cl 协同转运蛋白⁵ 缺乏足够的表达引起的，在存在功能失调的 GABA_A 受体的情况下，会导致癫痫发作活动的风险增加。GABA_A 受体介导 GABA 的兴奋性和抑制作用，具体取决于 Cl^- 离子的细胞内浓度⁶。因此，随着大脑的成熟，GABA_A 受体编码基因以及其他离子通道的突变会扭曲兴奋性，而参与神经元代谢、细胞信号传导和突触形成⁷ 的基因突变会导致儿童失神癫痫⁸ 等疾病。

临床干预越来越多地利用基因分析来提高治疗神经发育障碍的精确度²。小儿癫痫的基因检测为精准医学方法提供了潜在目标⁹，突出了遗传变异在指导治疗决策中的重要性。此外，~25% 的具有 新发 突变的癫痫患者接受了基因诊断，以确定精准医疗的潜在靶点，这强调了遗传变异在指导治疗决策方面的重要价值¹⁰。新一代测序技术的进步推动了这一点，例如靶向基因面板、全外显子组测序和全基因组测序，这些技术极大地加速了基因发现¹¹。然而，当结果产生意义未知的变异 （VUS） 时，新基因发现数量的增加带来了挑战，这种分类反映了关于变异在疾病发病机制中的分子作用的相互矛盾的证据或信息不足。归类为 VUS 的变异对应于美国医学遗传学与基因组学学院 （ACMG） 和分子病理学协会 （AMP） 提出的五级变异分类系统中的一个类别¹²。

应对功能未知的遗传变异的挑战需要在两个关键维度上做出努力：临床实践和研究。在临床上，围绕 VUS 的不确定性会使患者管理和决策复杂化¹³。从科学研究的角度来看，在越来越多的意义不明的变异中识别致病性变异并确定它们在疾病病理生理学和表型效应中的作用至关重要¹。一种理想的情况是准确预测所有功能上未表征的变体的分子、神经元和网络水平效应，从而最大限度地减少基于实验室的研究所需的资源、时间和精力。这些方面强调了准确分类遗传变异的重要性，以便能够精确诊断遗传性癫痫，支持个性化治疗，并促进潜在药理学靶点的发现。目前的预测工具 14,15,16,17 相对准确，但通常仅提供二元分类（致病性与良性），并且缺乏对分子病理生理学、表型后果和潜在机制的疾病特异性见解。本文专注于所选 GABA_A 受体亚基编码基因的未知错义变异，提出了一个框架，旨在通过结合变异的背景因素（如分子、进化和结构方面）以及来自癫痫相关突变的体外生物物理学数据的神经病理模拟来加强研究指导。我们的方法解决了 GABA A 受体 γ2 亚基的未知致病性变异的鉴定，GABA_A 受体是参与癫痫病理生理学的关键亚基 18,19,20。随后探索这些预测变异与以结构和电生理数据为特征的癫痫相关突变的位置特异性匹配。然后，这些数据用于估计对表达 GABA_A 受体亚型的海马锥体神经元模型的变异影响，该亚型由 γ2、α1 和 β3 亚基（γ2-GABA_A 受体）组成，负责快速突触抑制⁶。需要注意的是，GABA_A 受体从一个大的亚基池（α1-α6、β1-β3、γ1-γ3、δ、Ε、θ、π 和 ρ1-ρ3）组装而成，根据亚基组成，GABA_A 受体的调节、生物物理特性以及区域、细胞和亚细胞表达模式与特定功能相结合 ^{6,21,22,23，24,25}.因此，本研究仅侧重于 γ2-GABA_A 受体或含有 γ2 的 GABA_A 受体。

GABA_A 受体亚基由特征性结构特征组成——一个长的 N 末端细胞外结构域 （ECD）、四个跨膜结构域（TM1 至 TM4）、一个连接 TM1 和 TM2 的细胞内接头、一个连接 TM2 和 TM3 的细胞外接头、TM3 和 TM4 之间的一个大细胞内环（TM3-TM4 环）和一个短的细胞外 C 末端 ^6,26，27.研究表明 GABA_A 受体通过复杂的“锁和拉”机制发挥作用，其中 GABA 结合锁定β和 α 亚基，使它们拉动亚基的细胞外结构域 （ECD），逆时针旋转^{它们 27}。这种运动弯曲了跨膜结构域 （TMD），从而打开了离子通道²⁷。因此，通道活性似乎与 GABA_A 受体内的结构盒一起协调。事实证明，癫痫突变通过这些结构盒的扭曲导致通道活动功能障碍²⁸。因此，我们的研究基于这样一种想法，即在 GABA_A 受体亚基的特定结构盒中功能鉴定的致癫痫突变附近预测的致病性变异可能表现出类似的通道功能电生理或生物物理扭曲模式，如在这些致癫痫突变的情况下观察到的那样。虽然 GABA_A 受体亚基²⁸ 中存在致癫痫结构盒间接支持这一观点，但我们的研究证明了将致癫痫突变的生物物理参数与预测的致病突变的生物物理参数相关联的复杂性和挑战。为了揭示这些复杂的关系，我们的框架具有重要意义，因为它强调了一种多尺度方法，范围从 DNA 到蛋白质功能和神经行为，对癫痫研究至关重要。这种方法将计算遗传学与分子建模和神经模拟相结合，同时还强调了互补方法的重要性，例如在大型数据集上训练的机器学习，这些方法可以捕获突变对通道结构、活性和神经兴奋性的影响。此外，在海马锥体神经元模型上模拟致癫痫 γ2-GABA_A 受体活性允许复制与 GABA_A 受体通道病相关的体外细胞表型，并证明网络功能障碍中心单神经元反应改变。

Protocol

1 . 致 病性变异的计算机预测

1. 变体数据收集
   1. 使用 ClinVar 数据库²⁹，通过网站在目标基因的编码区搜索意义不确定的变异 （VUS）：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/。在搜索栏中输入基因符号（例如 GABRG2）并过滤结果以仅包含所需的变异类型，例如单核苷酸、意义不确定的错义变异。下载数据并将其保存为 data.xlxs （补充文件 4：补充表 S1）。记录下载数据的日期。
      注意：在本方案中，将分析 GABA_A 受体的人类 γ2 亚基，特别是 智人 γ-氨基丁酸 A 型受体亚基 γ2 （GABRG2），转录变体 1，mRNA（NCBI 参考文献如下：NM_198904.4），也称为 γ2L。记录目标基因的参考转录本以及不同数据库（UniProt、ENSEMBL、PDB）中的其他相应标识符非常重要，因为不同的计算方法可能需要不同的标识符（补充文件 4：补充表 S2）。如果数据库或计算工具无法识别序列标识符的版本号，请尝试使用带有版本号 （NM_198904.4） 和不带版本号 （NM_198904） 的 ID。
   2. 参比蛋白基本信息
      1. 在 NCBI 数据库 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ 中，在搜索选项中选择核苷酸，然后输入目标基因的 NCBI 参考文献 ID （NM_198904.4）。然后，向下滚动右列，单击类别 Related information 下的 Protein，以查找由转录本 NM_198904.4 编码的蛋白质 （NP_944494.1）。使用为蛋白质 NP_944494.1 提供的信息，以表格的形式记录特定区域的序列位置（补充文件 4：补充表 S3）。
         注：确定功能和结构关键区域、基序或残基（如蛋白质结构域、磷酸化位点、配体结合位点和分子相互作用界面）的序列位置的初步已知信息非常重要。这可以通过结合数据库（NCBI、ENSEMBL、UniProt...）和文献检索来实现。
2. 变体数据组织
   1. 组织数据以满足所选预测变量的输入要求。确保检索到的数据的格式已组织起来，以符合 dbNSFP 服务器 http://database.liulab.science/dbNSFP 的要求。为此，请从 data.xlsx 文件（补充文件 4：步骤 1.1.1 中的补充表 S1 ）中删除不必要的列，仅按指定顺序保留以下列：
      “GRCh38染色体”， “GRCh38位置”， “名称”， “蛋白质变化”。
   2. 以新文件名保存文件：“data1.xlsx”（补充表 S4）。通过运行代码在 R 中格式化 data1.xlsx 文件 （补充文件 1：Data_GABAA。R），它将格式化的数据保存为 data1_output.xlsx （补充文件 4：补充表 S5）在与 R 项目相关的工作目录中。
      注意：不同的计算方法需要不同的数据类型和格式。根据特定格式要求收集和组织数据，即使对于十几个变体，也容易出现错误且耗时，因此此步骤非常重要，除非变体池仅由几个变体组成。然后，手动数据组织可能是可能的。
3. 致病性预测
   1. 将 data1_output.xlsx 文件的内容传输到通过 http://database.liulab.science/dbNSFP 访问的 dbNSFP 服务器^30,31 的学术版本中。为此，请复制/粘贴或直接上传 .txt 格式的文件。
   2. 在提交之前，请确保在服务器中预先选择并确认以下选项：HG38（基因组构建）、ClinPred³² 和 BayesDEL³³ 。几分钟后，服务器将生成结果。
      注意：在本协议中，选择了两个集成预测因子，即 BayesDEL³³ 和 ClinPred³²，以实现高精度³⁴ 和实用性。但是，也可以选择其他预测变量，例如 dbNSFP 数据库^30,31 中提供的 AlphaMissense。计算机工具的选择取决于几个因素，包括为强大的预测生成足够的多行计算证据¹²。集成多个预测算法分析的集成预测器可以达到此目的。
   3. 下载输出文件（.txt格式）并将其另存为 data2.xlsx（补充文件 4：补充表 S6）。
   4. 通过单击菜单中的过滤器选项来设置 data2.xlsx（补充文件 4：补充表 S6）中的过滤器，并通过过滤 D 来确定两列中的共识变体。这将给出致病性最强的变体列表;保存它（参见补充表 S6 [ 补充文件 4] 中的共识选项卡）。
4. 变体选择
   1. 在共识致病性预测中，确定从文献中获得的致癫痫突变附近的变异。确保后者具有适合神经元建模的结构和生物物理参数。
      注意：此步骤是探索性的，也与研究目标蛋白质的结构、物理化学和生物物理参数有关。在本研究中，这些数据来自 Brünger 等人 ³⁵ 和 Guo 等人 ³⁶ 以及癫痫相关突变的调查。此外，作为一种选择，从 dbNSFP 数据库^30,31 重复步骤 1.3 访问 AlphaMissense³⁷ 分数（补充文件 4：补充表 S7）。更多详细信息在协议第 2.1.1 节和 2.1.2 以及结果中给出（参见“结构和生物物理参数的聚类变体”）。
   2. 对于基本的可视化，使用 Protter³⁸ （（https://wlab.ethz.ch/protter/start/） 和 HOPE³⁹ （https://www3.cmbi.umcn.nl/hope/） 服务器在选定的 GABRG2 基因突变的背景下检查上一步中的变体：P302L⁴⁰ 和 K328M（或 K289M⁴¹，当排除 39 个残基信号肽时）。
      注意：由于复杂性巨大，应在多个分析层次上对变异效应进行结构评价。像 Protter³⁸ 这样的工具将允许在蛋白质的拓扑特征的背景下清晰地可视化变异，而 HOPE³⁹ 等用户友好的服务器将通过分子建模来深入了解变异效应。此外，对目标蛋白质的全面文献综述对于识别和整合与癫痫相关的突变信息至关重要。
   3. 进化守恒和结构见解分析
      1. 打开 Jalview 42,43,44，这是一个用于编辑、可视化和分析蛋白质的开源程序。
      2. 导入序列以进行对齐。点击顶部菜单中的 File |获取序列;在对话框中选择数据库（如 UniProt）;单击 Retrieve IDs 选项卡;，如对话框中所述，输入来自人类和其他脊椎动物物种的目标基因 （GABRG2） 的 UniProt 登录 ID：P18507、P22723、Q6PW52、A0A2I3TKX0、F1RR72、A0A8I3MDZ2、A0A8M1P4D6。单击 OK。
         注：GABRG2 编码的蛋白质的 UniProt 登录号如下：智人的 P18507 （P18507-2），Mus musculus 的 P22723，Pan troglodytes的 A0A2I3TKX0，Sus scrofa 的 F1RR72，Canis familiaris 的 A0A8I3MDZ2，Danio rerio的 A0A8M1P4D6。
      3. 根据感兴趣的基因，一些序列可能没有注释;因此，执行 BLAST 搜索以识别相关信息和潜在的同源物，以便更好地理解上下文。在这种情况下，通过 File 菜单下的 Add Sequences/From 文本框选项上传蛋白质序列的 FASTA 格式，以生成所需序列的多个序列比对。
      4. 加载比对后，观察显示的序列以进行多个序列比较。每行表示一个序列，每列表示比对中的一个位置。要确定最佳对齐方法，请使用不同的方法;例如，单击 Sequence 菜单中的 Web 服务，然后选择 Run T-Coffee with preset 选项，这样就可以实现最佳对齐。
      5. 右键单击序列 P18507 Homo sapiens （本研究中的参考序列）并将其设置为 参考序列。在上方菜单中选择 Format （格式 ），然后单击 Wrap （换行 ） 以在屏幕上可视化完全对齐。在相同的 Format （格式） 菜单中，单击 上面的刻度 以增强特定残基数的可视化。为了进一步增强可视化效果，请通过转到 Color 并选择不同的选项（例如，Clustal Color、Chemical Property）来调整配色方案;如果需要，请修改字体大小。
      6. 单击菜单栏中的 Calculate ，然后选择 Autocalculate 一致 以突出显示保守区域。
      7. 专注于在 计算机模拟 预测步骤中识别出的感兴趣变体的位置，并检查特定的变体位置。通过右键单击特定残基并选择 Add Annotation 来注释它们。使用适当的颜色代码编写标签（例如，变体 ID）并保存。
         注：在本分析中，选择了 P302L（紫色）和 A303T（红色），以便在多序列比对中与结构数据一起可视化它们（参见下一节）。
   4. 完整蛋白质的三维重建，显示选定的保守残基
      1. 在上一步获得的文件中，右键单击参考序列 （GABRG2 human） 并选择 3D 结构数据。
      2. 从下拉菜单中确定适当的结构数据 （7QNE， Chain C）²⁶ ，然后选择 Open new structure view with Jmol。
         注意：这将允许 Jmol 将多序列比对中选择的残基合并到结构数据中，Jmol 是一种基于 Java 的开源 3D 化学结构查看器。

2. 参数选择和生物物理建模

1. 变异特异性荟萃分析和参数归一化
   1. 调查当前文献以收集已鉴定的具有电生理数据通道电导 （g_GABAA）、失活时间 （τ_失活）、上升时间 （τ_上升） 和最大电流振幅 （I_max） 的亚基变体。提供每种情况的亚基组成、细胞类型和野生型测量值。相应地标记变体及其对照（例如，已知具有已确定生物物理特征的变体和已知每个变体的野生型测量对照）。
   2. 获取具有已识别生物物理特征的变异的 AlphaMissense 致病性评分。
      注意：有关更多详细信息，请参阅协议第 1.3 节。
   3. 创建一个数据框，其中包含每个变体的亚基和氨基酸位置、原始和改变的氨基酸、致病性评分以及从文献中获得的生物物理参数。为避免实验差异，将已鉴定变异的生物物理参数标准化为野生型测量的 x 倍变化。
2. 按结构和功能特性进行比较变异分析
   1. 在数据帧上组织预测的变体;相应地标记（例如，在没有关于其生物物理特征的文献的情况下预测变体）。
   2. 根据变体在氨基酸序列和三级结构中的位置对变体进行分类。在数据帧上添加结构分类参数（例如，在 α 螺旋、线圈、β 折叠、细胞外、细胞内或跨膜结构域中的定位、孔衬里、激动剂结合、蛋白质-蛋白质相互作用），并为每个变体提供有关其氨基酸位置的信息。
   3. 根据它们到膜中心和孔轴的距离对变体进行分类。在数据框上添加孔轴的距离和膜中心参数的距离。
   4. 分析已知变体的结构和生物物理参数之间的相关性。如果可能，请根据获得的相关性评估预测的变体。
3. Synapse 和神经元模型构建
   1. 使用 Brian2⁴⁵（一种用 Python 开发的开源神经模拟器，用于建模和模拟脉冲神经网络），在基于多区室电导的海马锥体神经元上构建 GABA 能突触的多区室生物物理模型。
   2. 通过定义离子通道门控动力学、被动和主动参数以及突触后电导来设计基于电导的模型。定义基于电导的模型，如 补充文件 2 中给出，它描述了模型中使用的方程。
      1. 将膜电容_（CM） 设置为 1 μF/cm² ，将细胞内电阻_（RA） 设置为 200 Ω.cm。
      2. 对海马锥体神经元³⁹ 使用改良的 Hodgkin-Huxley 型电导，其中 g_L = 0.0003 S/cm^2，g _K = 0.036 S/cm^2，E _L = -76.5 mV，E_Na = 50 mV，E_K = -90 mV。
      3. 将 Na_V 通道在 g_Na 上的密度分布调整为 0.05 S / cm² 对于体细胞，0.5 S / cm² 用于轴突初始段 （AIS） 和 Ranvier 节点 （NR），以及 0.005 S / cm² 用于树突。在有髓段中将 g_K 和 g_Na 设置为 0。
      4. 如补充文件 2 中所述，为 Na_V 和 K_V 构建离子通道门控动力学。
      5. 引入突触电流 （I_syn） 作为区室中所有谷氨酸能突触和 GABA 能突触的总和。在谷氨酸能电流 （I_glu） 中包括快速 AMPA 受体介导的电流 （I_AMPA） 和慢速 NMDA 受体介导的电流 （I_NMDA）。在 GABA 能电流 （I_GABA） 中仅包括快速 GABA_A 受体介导的电流。假设每个突触前尖峰都会向突触释放一定量的谷氨酸;因此，受体的激活是刺突时间依赖性的（s_AMPA 和 s_NMDA），总受体电导率（g_AMPA 和 g_NMDA）反映了每个事件释放的谷氨酸量。
      6. 使用 补充文件 2 中所述的突触模型。
         注意：有关方程的详细说明，请参阅描述模型中使用的方程的 补充文件 2 。
   3. 从以前的文献中获得 soma 和 neurites 的实验测量直径以及每个神经突隔室和分支模式的长度^46,47。通过将细胞划分为多个隔室，将真实的神经元形态简化为多区室模型，从而准确保留主要分支结构并保持双侧对称性。
   4. 设置形态学（段长和直径;即d_soma：30 μm;l_AH：5 μm;d_AH_i：1.5 μm;d_AH_f：1.3 μm;l_AIS：40 μm;d_axon：1 μm;l_myseg：100 μm;l_NR：2 μm;l_AxTer：4 μm;d_AxTer：2 μm;l_approx：100 μm;l_apmed： 100 微米;l_apdis：200 μm;d_approx_i：4 μm;d_approx_f：3 μm;d_apmed ： 2 μm;d_apdis：2 μm;l_apLM：70 μm;d_apLM：2 μm;l_nAcDbasal：400 μm;d_nAcDbasal：1.4 μm;l_nAcDbasal_stem：20 μm;d_nAcDbasal_stem：1.5 μm）和生物物理参数（如第 2.3.2 节中给出）对于锥体神经元模型 ^{46,47，Python} 脚本（补充文件 3：GABAAvar.py）中也有详细说明。
   5. 通过评估在步骤 2.1.1 中获得的野生型对照测量值，确定 GABA 能突触模型的生物物理参数。
4. 设计神经元模型的拓扑结构并分配形态学和生物物理参数，其中包括根据先前获得的形态学和分支信息指定隔室的空间排列和互连。为模型的每个隔室分配适当的形态学（例如，节段长度和直径）和生物物理参数（第 2.3.2 节），如 补充文件 3：GABAAvar.py 中所述。
5. 突触构建和电流注入
   1. 使用 SpikeGeneratorGroup （Brian2 库中的一个类）创建突触前活动，如 “GABAAvar.py”（补充文件 3） 中给出。使用 Synapses 类将尖峰发生器连接到模型神经元的目标隔室，以对突触连接进行建模。
   2. 将持续恒定电流 （I_inj） 设置为 0.85 nA 并放置在 soma 上，以模拟在给定时间由基线离子电流负载驱动的亚阈值活动，如 补充文件 3：GABAAvar.py 中所述。
6. 要构建记录监视器，请使用 StateMonitor 记录来自目标隔室的电压轨迹。
7. 构建并运行网络。
   1. 使用 Network 使用模型 neuron、connections 和 monitor 构建网络。
   2. 通过 defaultclock.dt 设置模拟的时间步长（例如，0.01 ms）。
   3. 使用 network.run（T*ms） 在网络上运行模拟，其中 T 在示例中设置为 1000 毫秒。
8. 测试 GABA_A 受体错义突变的影响
   1. 通过步骤 2.1.1 中收集的生物物理参数定义每个错义突变对通道动力学的影响。
   2. 通过更改这些参数来运行刺激，并使用“GABAAvar.py”（补充文件 3）中给出的“matplotlib.pyplot”绘制结果。
9. 测试参数组合以分析射击模式和速率的变化。绘制结果以进行比较。

Results

本研究利用多尺度方法来预测和表征 GABA A 受体 γ2 亚基的致病性变异，GABA_A 受体是癫痫病理生理学的关键组成部分。通过使用预测模型、分子建模、进化保守、结构检查、相关性分析和神经模拟，这种方法增强了变异的分类，与癫痫研究和临床应用具有重要相关性。该方法的总体总结如图 1 所示。

两个相邻 γ2 亚基突变的比较评价

基于我们的假设，即 GABA_A 受体亚基中与致癫痫突变相邻的预测致病性突变可能会对通道功能和神经行为产生类似的电生理效应，我们首先对众所周知的致癫痫突变与 γ2 亚基的近端预测突变之间的关系进行了简要检查。

Discussion

通过应用计算遗传学、分子建模和神经模拟的结合，本文提出的方法有可能改善 GABA_A 受体变体的分类，为癫痫研究和临床应用提供有价值的见解。提出了用于识别和确定预测致病突变优先级的综合分析，并将其扩展到一个框架中，该框架可能弥合变异对蛋白质和细胞表型的影响之间的差距。评估致癫痫性 GABA_A 受体活性对海马锥体神经元模拟的影响，可以复制与 GABA_A 受体功能障碍相关的体外表型，并证明网络功能障碍根源中的单个神经元反应改变。基于这些对致癫痫突变产生的神经反应的模拟，探索了对结构近端预测突变的功能影响的粗略估计。预测突变对通道动力学影响的预测需要对已知的变异集进行彻底分析。比较分析（例如本文中介绍的分析）和神经活动模拟为进一步生成和改进预测模型提供了关键见解，这些模型侧重于变异对蛋白质功能和神经病理学的影响。此外，我们的方法可用于在未知变异中选择和优先考虑最具致病性的变异，以检查与 GABA_A 受体相关的神经发育障碍相关的变异效应。例如，用荧光探针

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
布莱恩2	索邦大学，INSERM，CNRS，Institut de la Vision，法国;英国伦敦帝国理工学院	2.8.0.4	Stimberg 等人，2019 （https://pypi.org/project/Brian2/ ）
dbNSFP 服务器	Genos Bioinformatics LLC，美国	v3.0 版本	刘等， 2020 （http://database.liulab.science/dbNSFP） （https://sites.google.com/site/jpopgen/dbNSFP）
希望	荷兰拉德堡德大学 CMBI 分子和生物分子信息学中心	1.1.1	Venselaar 等人，2010 （https://www3.cmbi.umcn.nl/hope/）
贾尔维尤	英国邓迪大学	合资企业2	Waterhouse 等人，2009 （https://www.jalview.org/）
Jupyter 笔记本	Project Jupyter，美国		https://jupyter.org/install
菲顿	Python 软件基金会，美国	3.13	https://www.python.org/downloads/
Protter	瑞士苏黎世联邦理工学院	版本 1.0	Omasits 等人，2014 （https://wlab.ethz.ch/protter/start/）
R	美国 R 统计计算基金会	R 版本 4.3.2	https://www.r-project.org/
RS图迪奥	Posit 软件，PBC，美国	RStudio 2023.12.1+402 《海洋风暴》发布	https://posit.co/downloads/