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方法文章

GABAA受体亚基错义变异在海马锥体神经元中作用的位点特异性鉴定与分类

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DOI：

10.3791/67833

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2025年6月6日

 , 
1Department of Molecular Biology and Genetics, Faculty of Engineering and Natural Sciences, Üsküdar University

本文内容

摘要

本研究介绍了一个从DNA到蛋白质功能及神经行为的多尺度研究框架。该研究提出了一种新方法，用于探究GABAA受体亚基中预测为致病性的突变，假设致癫痫突变以及被预测为致病性的邻近突变可能在CA1锥体神经元模型上产生相似的影响。

摘要

了解癫痫相关基因中功能未知变异体的影响，对于阐明疾病的病理生理机制并开发个体化治疗策略至关重要。我们采用一种跨越从DNA序列到蛋白质功能及神经元行为的多尺度研究框架，提出一种预测和研究致病性突变的新方法，并假设GABAA受体亚基中的致癫痫突变以及邻近区域预测的突变可能对CA1锥体神经元模型产生类似的影响。通过探究预测致病性突变与邻近致癫痫突变之间的特征性关联，本研究旨在基于致癫痫突变对海马锥体神经元模拟所产生的效应，来估测预测突变的潜在影响。

该方法始于GABA的收集A 受体γ2亚基遗传数据，随后使用R语言中的自定义脚本进行数据清洗和格式化。接下来，应用集成预测工具以识别并优先排序该基因的致病性错义变异 γ2 亚基。将通过分子建模展示致痫性突变共有的亚基结构域上特定致病性变异（预测）的定位，并分析其影响及进化保守性。随后进行变异特异性的荟萃分析与参数标准化，继而开展相关性分析，以识别预测突变与邻近致痫性突变之间是否存在显著关联。利用基于 Python 的神经模拟器，描述反映野生型及致痫性突变体效应的多区室基于电导的神经元模型。模拟由致痫性 GABA 受体突变产生的神经元反应A 受体亚型将被用于粗略估计预测致病性变异对神经反应的影响。据我们所知，这是首个探索多尺度框架以评估GABAA 受体变异对神经元行为的影响，对癫痫研究至关重要。该方案可作为增强预测GABA潜在致病变异所导致细胞表型的基础A 与癫痫相关的受体

引言

对于几乎所有人类疾病而言，遗传变异在个体易感性中均起着重要作用。因此，了解序列变异如何影响疾病风险，为揭示疾病发生发展的关键机制以及发现预防和治疗新策略提供了重要途径1。这一原则同样适用于神经发育障碍，后者是儿科初级保健中最常见的慢性疾病之一2。自闭症谱系障碍、智力障碍和癫痫等疾病表明，遗传变异在发育过程中对个体易感性具有显著影响3。

由于兴奋与抑制之间关键平衡的遗传编程性神经发育不匹配，发育中的大脑比成年大脑更容易发生癫痫发作4。在成年大脑中，GABA（γ-氨基丁酸）是主要的抑制性神经递质，但在胚胎期和出生后早期发育阶段却具有兴奋性作用，这种状态不利于年幼大脑维持防止癫痫发作所需的稳定性。这种暂时性状态由K-Cl共转运体表达不足所致5，在GABAA受体功能异常的情况下，可能增加癫痫活动的风险。GABAA受体介导GABA的兴奋性和抑制性作用，其效应取决于细胞内Cl-离子的浓度6。因此，随着大脑发育成熟，GABAA受体编码基因以及其他离子通道基因的突变，以及参与神经元代谢、细胞信号传导和突触形成的基因突变7，可导致儿童失神癫痫等疾病8。

临床干预正越来越多地利用基因分析来提高治疗神经发育障碍的精准性2。儿童癫痫中的基因检测为精准医疗策略提供了潜在的靶点9，凸显了基因变异在指导治疗决策中的重要意义。此外，约25%携带新发突变的癫痫患者通过基因诊断明确了精准医疗的潜在靶点，进一步强调了基因变异在指导治疗决策中的重要价值10。这一进展得益于新一代测序技术的发展，例如靶向基因 panel、全外显子组测序和全基因组测序，这些技术极大地加速了基因发现11。然而，随着新基因发现数量的不断增加，当检测结果呈现意义未明变异（VUS）时，便带来了挑战；该分类反映了关于该变异在疾病发病机制中分子作用的证据存在冲突或信息不足。被归类为VUS的变异属于美国医学遗传学与基因组学学会（ACMG）和分子病理学协会（AMP）提出的五级变异分类系统中的一个类别12。

解决功能未知的遗传变异所带来的挑战需要在两个关键领域开展工作：临床实践和科学研究。在临床上，VUS（意义未明变异）相关的不确定性可能使患者的管理和决策过程复杂化13。从科学研究的角度来看，在数量日益增加的意义未明变异中识别致病变异，并确定其在疾病病理生理学和表型效应中的作用至关重要1。一种理想的情况是能够准确预测所有功能尚未明确的变异在分子、神经元及神经网络层面的影响，从而最大限度地减少基于实验室研究所需资源、时间和精力。这些方面凸显了准确分类遗传变异的重要性，以实现对遗传性癫痫的精确诊断，支持个体化治疗，并促进潜在药物靶点的发现。现有的预测工具14,15,16,17相对准确，但通常仅提供二元分类（致病性与良性），缺乏对分子病理生理机制、表型后果及潜在机制的疾病特异性洞察。本文聚焦于选定的GABAA受体亚基编码基因中的未知错义变异，提出一个框架，旨在通过整合变异的分子、进化和结构等背景因素，以及基于癫痫相关突变的体外生物物理数据所模拟的神经病理变化，增强研究指导能力。我们的方法学针对GABAA受体γ2亚基的未知致病变异进行识别，该亚基在癫痫的病理生理过程中起关键作用18,19,20。随后，探索这些预测变异与已通过结构和电生理数据表征的癫痫相关突变之间的位置特异性匹配。这些数据被用于估算变异对表达GABAA受体亚型（由γ2、α1和β3亚基组成，即γ2-GABAA受体）的海马锥体神经元模型所产生的影响，该受体负责快速突触抑制6。需要指出的是，GABAA受体由大量亚基库（α1-α6、β1-β3、γ1-γ3、δ、Ε、θ、π和ρ1-ρ3）组装而成，根据亚基组成的不同，GABAA受体在调节方式、生物物理特性以及区域、细胞和亚细胞表达模式方面存在差异，并与特定功能相关6,21,22,23,24,25。因此，本研究仅聚焦于γ2-GABAA受体或含γ2亚基的GABAA受体。

GABAA 受体亚基由特征性结构组成——一个长的N端胞外结构域（ECD），四个跨膜结构域（TM1至TM4），连接TM1与TM2的胞内连接区，连接TM2与TM3的胞外连接区，TM3与TM4之间的一个大的胞内环（TM3-TM4环），以及一个短的胞外C末端6,26,27建议GABAA 受体通过一个复杂的机制发挥作用 "锁定并拉出" 机制是GABA结合使β和α亚基锁定，进而牵拉亚基的胞外结构域（ECDs），使其发生逆时针旋转27该运动使跨膜结构域（TMDs）发生弯曲，从而打开离子通道27因此，通道活性似乎与GABA内的结构模块协同作用A 受体。事实证明，癫痫相关突变通过扭曲这些结构模块，导致通道活性功能障碍。28因此，我们的研究基于以下假设：在GABA受体特定结构模块中，位于功能已知致痫突变位点附近的预测致病性变异可能具有相似的病理机制。A 受体亚基可能表现出与这些致癫痫突变情况中所观察到的相似的通道功能电生理或生物物理异常模式。尽管在GABA受体中存在致癫痫结构盒的迹象A 受体亚基28 间接支持了这一观点，但本研究揭示了将致癫痫突变的生物物理参数与预测致病突变的参数相关联所面临的复杂性与挑战。为揭示这些复杂关系，本研究框架具有重要意义，因其强调了一种从DNA到蛋白质功能及神经行为的多尺度研究方法，这对癫痫研究至关重要。该方法整合了计算遗传学、分子建模与神经模拟，同时强调互补方法的重要性，例如基于大规模数据集训练的机器学习，可捕捉突变对通道结构、活性及神经兴奋性的影响。此外，对致癫痫性γ2-GABA受体的模拟A 海马锥体神经元模型上的受体活性可实现复制 体外 与GABA相关的细胞表型A 受体通道病以及在神经网络功能障碍核心处单个神经元反应改变的展示。

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方案

1. 在计算机中 预测 o​致病性变异

  1. 变异数据收集
    1. 利用ClinVar数据库29，通过网站搜索目的基因编码区中意义未明的变异（VUS）： https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/。输入基因符号（例如， GABRG2在搜索栏中输入）并筛选结果，仅包含所需类型的变异，例如意义未明的单核苷酸错义变异。下载并保存数据为 data.xlxs (补充文件 4：补充表 S1）。记录下载数据的日期。
      注意：在本方案中，人 GABA 受体 γ2 亚基A 受体，特异性地 智人 γ-氨基丁酸A型受体γ2亚基（GABRG2），转录本变体1，mRNA（NCBI参考序列：NM_198904.4），也称为γ2L，将被分析。记录目标基因的参考转录本以及在不同数据库（UniProt、ENSEMBL、PDB）中的其他相应标识符非常重要，因为不同的计算方法可能需要不同的标识符补充文件 4：补充表 S2）。如果数据库或计算工具无法识别序列标识符的版本号，请同时尝试使用带版本号的ID（NM_198904.4）和不带版本号的ID（NM_198904）。
    2. 参考蛋白基本信息
      1. 在 NCBI 数据库 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ 中，选择 核苷酸 在搜索选项中输入目标基因的 NCBI Ref. seq. ID（NM_198904.4），然后向下滚动右侧栏，点击 蛋白质 在……类别下 相关信息 以查找由转录本 NM_198904.4 编码的蛋白质（NP_944494.1）。根据提供的蛋白质 NP_944494.1 的信息，以表格形式记录特定区域的序列位置补充文件 4：补充表 S3).
        注意：确定功能和结构上关键区域、基序或残基（如蛋白质结构域、磷酸化位点、配体结合位点和分子相互作用界面）的序列位置的初步已知信息至关重要。这可通过整合数据库（NCBI、ENSEMBL、UniProt……）和文献检索来实现。
  2. 变异数据组织
    1. 整理数据以满足所选预测工具的输入要求。确保检索到的数据格式经过组织，以符合 dbNSFP 服务器的要求。 http://database.liulab.science/dbNSFP。为此，请从 data.xlsx 文件中删除不必要的列（补充文件4：补充表S1 来自步骤 1.1.1），仅保留以下各列并按指定顺序排列：
      GRCh38染色体", "GRCh38位置", "名称", "蛋白质变化".
    2. 将文件另存为新文件名： "data1.xlsx" (补充表 S4）。格式化 data1.xlsx 在 R 中运行代码以保存文件（补充文件 1：Data_GABAA.R），该文件将把格式化后的数据保存为 data1_output.xlsx (补充文件4：补充表S5在与R项目相关的工作目录中。
      注意：不同的计算方法需要不同类型和格式的数据。即使仅涉及十几个变异位点，按照特定格式要求收集和整理数据也容易出错且耗时，因此该步骤至关重要，除非变异位点集合仅包含极少数变异。在此情况下，可考虑手动进行数据整理。
  3. 致病性预测
    1. 转移内容 data1_output.xlsx 上传至 dbNSFP 服务器的学术版本30,31 通过 http://database.liulab.science/dbNSFP 访问。为此，请复制/粘贴或直接上传文件 .txt 格式。
    2. 确保在服务器中预先选择并确认以下选项：HG38（基因组版本）、ClinPred32，以及 BayesDEL33 在提交之前。服务器将在几分钟内生成结果。
      注意：在本方案中，采用两种集成预测工具，即 BayesDEL33 和 ClinPred32，被选用于高精度实验34 以及实用性。然而，其他预测工具，例如 dbNSFP 数据库中提供的 AlphaMissense30,31 也可以被选中。选择 计算机模拟 工具的性能取决于多个因素，包括生成足够的多重计算证据以实现强有力的预测12集成预测器可整合多种预测算法的分析结果，实现这一目标。
    3. 下载输出文件（.txt 格式），并将其另存为 data2.xlsx (补充文件 4：补充表 S6).
    4. 在 data2.xlsx 中设置筛选器补充文件4：补充表S6) 通过点击 过滤器 菜单中的选项，并通过筛选 D 列确定两列中的共识变异，从而获得最具致病性的变异列表；保存该列表（参见 共识 标签切换 补充表 S6 [补充文件 4]).
  4. 变异体筛选
    1. 在共识致病性预测中，确定与文献报道的致癫痫突变位点邻近的变异，并确保这些突变具有适用于神经元建模的结构和生物物理参数。
      注意：此步骤具有探索性，同时涉及对目标蛋白的结构、理化及生物物理参数进行分析。本研究中的这些数据来自 Brünger 等人。35 和郭等人36 除了对与癫痫相关的突变进行综述外，还可选择使用 AlphaMissense37 评分数据来自 dbNSFP 数据库30,31 重复步骤 1.3补充文件 4：补充表 S7）。更多细节见方案部分 2.1.1 和 2.1.2 以及结果部分（见 "结构与生物物理参数的变异体聚类").
    2. 用于基础可视化，请使用 Protter38 （https://wlab.ethz.ch/protter/start/）和 HOPE39 （https://www3.cmbi.umcn.nl/hope/）服务器用于在选定背景下分析前一步中的变异 GABRG2 基因突变：P302L40 和 K328M（或 K289M）41（排除39个残基的信号肽后）。
      注意：由于复杂性极高，对变异效应的结构评估应在多个分析层面进行。可使用 Protter 等工具38 将能够在蛋白质拓扑特征的背景下清晰地展示这些变异，并借助HOPE等用户友好的服务器39 将通过分子建模揭示变异效应。此外，对目标蛋白进行全面的文献综述，对于识别和整合与癫痫相关的突变信息至关重要。
    3. 进化保守性分析与结构洞察
      1. 打开 Jalview42,43,44一款用于蛋白质编辑、可视化和分析的开源程序。
      2. 导入序列以进行比对。单击 文件 在顶部菜单中 | 获取序列；选择 数据库 在对话框中（例如 UniProt）；点击 获取 ID 标签；并按照对话框中的说明，输入目标基因的 UniProt 登录号（GABRG2）来自人类及其他脊椎动物物种：P18507、P22723、Q6PW52、A0A2I3TKX0、F1RR72、A0A8I3MDZ2、A0A8M1P4D6。点击 好的.
        注意：由以下基因编码的蛋白质的 UniProt 登录号 GABRG2 如下：P18507（P18507-2）对应于 智人 P22723 对于 Mus musculus，A0A2I3TKX0 对于 Pan troglodytes，F1RR72用于 Sus scrofa，A0A8I3MDZ2 对于 Canis familiaris，以及 A0A8M1P4D6 用于 Danio rerio.
      3. 根据目标基因的不同，某些序列可能未被注释；因此，建议进行BLAST搜索，以确定相关信息及潜在的同源序列，从而获得更全面的背景理解。在此情况下，通过FASTA格式上传蛋白质序列 添加序列/来自文本框 选项下的选项 文件 使用菜单生成所需序列的多序列比对。
      4. 加载比对结果后，观察用于多序列比对的显示序列。每一行代表一条序列，每一列代表比对中的一个位置。为确定最佳比对方法，可尝试不同策略；例如，点击 网络服务 在 序列 菜单并选择 使用预设运行 T-Coffee 选项，可实现最佳对齐。
      5. 右键单击序列 P18507 人类 （本研究中的参考序列）并将其设为 参考序列选择 格式 在上方菜单中点击 包裹 以在屏幕上显示完整的比对结果。在同一“格式”菜单中，点击 刻度上方 以增强特定残基编号的可视化效果。为进一步改善可视化效果，可通过前往 颜色 并选择不同的选项（例如，Clustal Color、Chemical Property）；如有需要，可调整字体大小。
      6. 点击 计算 在菜单栏中选择 自动计算共识 以突出保守区域。
      7. 重点关注已鉴定出的目标变异位点的位置 计算机模拟 预测步骤并检查特定变异位点。通过右键单击特定残基并选择 添加注释. 使用相应的颜色代码书写标签（例如，变异体 ID）并保存。
        注意：在本分析中，选择P302L（紫色）和A303T（红色）以在多序列比对中结合结构数据进行可视化（见下一节）。
    4. 全长蛋白的三维重建，显示所选保守残基
      1. 在上一步获得的文件中，右键单击参考序列（GABRG2 人）并选择 3D 结构数据.
      2. 确定合适的结构数据（7QNE，链C）26 从下拉菜单中选择 使用 Jmol 打开新的结构视图.
        注意：这将允许 Jmol（一个基于 Java 的开源三维化学结构查看器）将多序列比对中选定的残基整合到结构数据中。

2. 参数选择与生物物理建模

  1. 特异性变异荟萃分析与参数归一化
    1. 查阅当前文献，收集已鉴定的亚基变异体及其电生理数据——包括通道电导（gGABAA）、去激活时间（τdeactivation）、上升时间（τrise）和最大电流幅度（Imax）。提供每种情况下的亚基组成、细胞类型及野生型测量值。相应地标记变异体及其对照（例如，将具有已知生物物理特性的变异体标记为“已知”，将对应野生型测量值标记为“已知对照”）。
    2. 获取具有已知生物物理特性的变异体的AlphaMissense致病性评分。
      注：详见第1.3节实验方案。
    3. 建立一个数据框，包含每个变异体的亚基和氨基酸位置、原始与改变的氨基酸、致病性评分以及从文献中获得的生物物理参数。为避免实验差异，将已鉴定变异体的生物物理参数相对于野生型测量值进行归一化处理，表示为x倍变化。
  2. 基于结构与功能特征的变异体比较分析
    1. 在数据框中整理预测的变异体，并进行相应标记（例如，将无文献报道其生物物理特性的变异体标记为“预测”）。
    2. 根据变异体在氨基酸序列和三级结构中的位置对其进行分类。在数据框中添加结构分类参数（例如，位于α螺旋、无规卷曲、β折叠、胞外区、胞内区或跨膜区、孔道衬 lining 区、激动剂结合位点、蛋白质-蛋白质相互作用区域），并提供每个变异体相对于其氨基酸位置的信息。
    3. 根据变异体到膜中心和孔道轴的距离进行分类。在数据框中添加到孔道轴的距离和到膜中心的距离参数。
    4. 分析已知变异体中结构参数与生物物理参数之间的相关性。如有可能，依据所获得的相关性评估预测变异体。
  3. 突触与神经元模型构建
    1. 使用Brian245——一种基于Python开发的开源神经模拟器，用于建模和模拟脉冲神经网络——构建一个基于多区室的传导型海马锥体神经元上的GABA能突触多区室生物物理模型。
    2. 通过定义离子通道门控动力学、被动与主动参数以及突触后电导，设计传导型模型。模型的传导型定义见补充文件2，其中描述了模型中使用的方程。
      1. 设定膜电容（Cm）为1 µF/cm2 ，胞内电阻（Ra）为200 Ω·cm。
      2. 采用适用于海马锥体神经元的改良Hodgkin-Huxley型电导39，其中gL = 0.0003 S/cm2，gK = 0.036 S/cm2，EL = -76.5 mV，ENa = 50 mV，EK = -90 mV。
      3. 调整NaV通道在gNa 上的密度分布：胞体为0.05 S/cm2，轴突起始段（AIS）和郎飞结（NR）为0.5 S/cm2，树突为0.005 S/cm2。在髓鞘化区段中，设gK和 gNa为0。
      4. 按照补充文件2中所述，构建NaV和KV的离子通道门控动力学。
      5. 将突触电流（Isyn）定义为某一区室内所有谷氨酸能和GABA能突触电流的总和。在谷氨酸能电流（Iglu）中包含快速AMPA受体介导电流（IAMPA）和慢速NMDA受体介导电流（INMDA）。在GABA能电流（IGABA）中仅包含快速GABAA受体介导电流。假设每次突触前脉冲释放恒定量的谷氨酸，因此受体激活具有脉冲时间依赖性（sAMPA和sNMDA），总受体电导（gAMPA 和gNMDA）反映每次事件释放的谷氨酸量。
      6. 使用补充文件2中描述的突触模型。
        注：有关方程的详细解释，请参见描述模型中方程的补充文件2。
    3. 从先前文献46,47中获取实验测得的胞体和神经突直径、各神经突区室长度及分支模式。将真实神经元形态简化为多区室模型，通过将细胞划分为多个区室，准确保留主要分支结构并维持双侧对称性。
    4. 设定锥体神经元模型每个区室的形态学参数（区室长度和直径；即：d_soma: 30 µm；l_AH: 5 µm；d_AH_i: 1.5 µm；d_AH_f: 1.3 µm；l_AIS: 40 µm；d_axon: 1 µm；l_myseg: 100 µm；l_NR: 2 µm；l_AxTer: 4 µm；d_AxTer: 2 µm；l_approx: 100 µm；l_apmed: 100 µm；l_apdis: 200 µm；d_approx_i: 4 µm；d_approx_f: 3 µm；d_apmed : 2 µm；d_apdis: 2 µm；l_apLM: 70 µm；d_apLM: 2 µm；l_nAcDbasal: 400 µm；d_nAcDbasal: 1.4 µm；l_nAcDbasal_stem: 20 µm；d_nAcDbasal_stem: 1.5 µm）和生物物理参数（如第2.3.2节所述）46,47，具体详见Python脚本（补充文件3：GABAAvar.py）。
    5. 通过评估第2.1.1步中获得的野生型对照测量值，确定GABA能突触模型的生物物理参数。
  4. 设计神经元模型拓扑结构，并分配形态学与生物物理参数，包括根据先前获得的形态学和分支信息，明确各区室的空间排列与连接关系。按照补充文件3（GABAAvar.py）中的说明，为模型的每个区室分配相应的形态学参数（如区室长度和直径）和生物物理参数（第2.3.2节）。
  5. 突触构建与电流注入
    1. 使用SpikeGeneratorGroup（Brian2库中的一个类），按照"GABAAvar.py"（补充文件3）中的设定生成突触前活动。使用Synapses类将脉冲生成器连接至模型神经元的目标区室，以模拟突触连接。
    2. 设置持续恒定电流（Iinj）为0.85 nA，并置于胞体，以模拟在给定时间内由基础离子电流负荷驱动的亚阈值活动，具体设定见补充文件3：GABAAvar.py。
  6. 构建记录监测器，使用StateMonitor记录目标区室的电压轨迹。
  7. 构建并运行网络。
    1. 使用Network将模型神经元、连接和监测器构建成网络。
    2. 通过defaultclock.dt设置仿真时间步长（例如，0.01 ms）。
    3. 使用network.run(T*ms)运行网络仿真，其中示例中T设为1,000 ms。
  8. 测试GABAA受体错义突变的影响
    1. 通过第2.1.1步中收集的生物物理参数，定义每个错义突变对通道动力学的影响。
    2. 通过改变这些参数运行刺激，并使用"matplotlib.pyplot"绘制结果，具体方法见"GABAAvar.py"（补充文件3）。
  9. 测试参数组合，分析放电模式和频率的变化。绘制结果以进行比较。

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结果

本研究采用多尺度方法预测和表征GABAA受体γ2亚基中的致病性变异，该亚基是癫痫发病机制中的关键组分。通过运用预测模型、分子建模、进化保守性分析、结构分析、相关性分析以及神经元模拟，该方法可提高变异分类的准确性，对癫痫研究具有重要意义，并可能具有临床应用价值。整体方法流程总结于图1中。

两个相邻γ2亚基突变的比较评估

基于我们的假设，即位于 GABAA 受体亚基上致癫痫突变位点附近的预测致病性突变可能对通道功能和神经行为产生类似的电生理效应，我们首先简要分析了 γ2 亚基上一个已知致癫痫突变与其邻近的预测突变之间的关系。

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讨论

通过结合计算遗传学、分子建模和神经模拟方法，本文提出的方法有望改进对GABA的分类A 受体变异体，为癫痫研究和临床应用提供了宝贵的见解。本文提出并扩展了一个全面的分析框架，用于识别和优先排序预测的致病性突变，该框架有望弥合蛋白质与细胞表型之间变异效应的差距。评估了致癫痫性GABAA 海马体锥体神经元模拟中的受体活性可实现复制 体外 与GABA相关的表型A 受体功能障碍以及单个神经元反应改变在神经网络功能障碍根源中的体现。基于由致癫痫突变引发的神经反应模拟，初步估算了结构上邻近的预测突变对功能影响的可能性。关于预测突变对通道动力学影响的预测，仍需结合已知变异集进行深入分析。诸如本文所展示的比较分析与神经活动模拟，为构建和优化聚焦于变异对蛋白质功能及神经病理影响的预测模型提供了关键见解。此外，我们的方法可用于在未知变异中筛选并优先确定最具致病性的变异，以研究与GABA相关的变异效应A 受体相关神经发育障碍。例如，用荧光探针标记的受体亚基66,

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披露

所有作者声明，他们与本研究无任何利益冲突。

致谢

感谢 Çağla Koca 在构建模型神经元过程中提供的帮助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Brian2 索邦大学é法国视觉研究所，法国国家健康与医学研究院（INSERM），法国国家科学研究中心（CNRS）；英国伦敦帝国理工学院2.8.0.4Stimberg 等，2019（https://pypi.org/project/Brian2/）
dbNSFP 服务器  Genos生物信息学有限责任公司，美国v3.0Liu 等，2020（http://database.liulab.science/dbNSFP）（https://sites.google.com/site/jpopgen/dbNSFP）
HOPE  荷兰拉德堡德大学分子与生物分子信息学中心 CMBI 1.1.1Venselaar 等，2010（https://www3.cmbi.umcn.nl/hope/）
Jalview  英国邓迪大学JV2Waterhouse 等，2009（https://www.jalview.org/）
Jupyter NotebookProject Jupyter，美国https://jupyter.org/install 
植物Python 软件基金会，美国3.13https://www.python.org/downloads/
Protter  瑞士苏黎世联邦理工学院版本 1.0Omasits, 等, 2014 (https://wlab.ethz.ch/protter/start/)
R 美国统计计算基金会R 版本 4.3.2  https://www.r-project.org/ 
RStudioPosit 软件，PBC，美国RStudio 2023.12.1+402 "海洋风暴" 释放https://posit.co/downloads/

参考文献

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