细胞内感染模型的建立与评估：针对Staphylococcus aureus

摘要

Staphylococcus aureus（S. aureus）具有在体内扩散的能力，可导致持续性和反复性感染。为了更好地理解这些过程，本研究建立了一种S. aureus的胞内感染模型。该模型将为研究胞内感染的机制提供重要的基础。

摘要

S. aureus 可侵入并在宿主细胞（包括免疫细胞）内存活，从而逃避免疫系统的识别与清除。这种胞内持续存在特性导致慢性和反复感染，使治疗复杂化并延长病程。因此，迫切需要建立一种胞内感染模型，以更好地理解、预防和治疗由其引起的感染。 S. aureus本研究结果表明，抗生素能有效清除细胞外细菌，但无法根除已进入细胞内的细菌，因此形成了稳定的胞内感染。 体外 由感染RAW264.7细胞建立 S. aureus 并与抗生素共培养。随后，通过注射含有胞内感染的腹腔巨噬细胞，建立小鼠胞内感染模型。万古霉素可有效清除浮游细菌攻毒小鼠体内的细菌载量 S. aureus；然而，对于腹腔巨噬细胞内细菌载量相等或更低的小鼠，该方法无效。这表明腹腔巨噬细胞内感染模型 S. aureus 成功建立，为细胞内感染的预防和治疗提供了潜在的见解。

引言

S. aureus 是一种高度传染性的病原体，可引起多种感染，包括皮肤和软组织感染、败血症、脑膜炎、肺炎和心内膜炎¹抗生素的临床滥用已导致耐药性增强 S. aureus 以及耐甲氧西林的出现 金黄色葡萄球菌 （耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，MRSA），在许多国家构成重大的公共卫生威胁².

尽管S. aureus传统上未被归类为胞内病原体，但越来越多的证据表明，它在侵入宿主细胞后能够持续定植于宿主细胞内³。人们日益认识到，S. aureus在宿主吞噬细胞内胞内存活的能力是促进其转移性感染及在宿主体内播散的重要机制^4,5,6。S. aureus分泌多种毒力因子，这些因子可营造有利于其自身存活的免疫环境，并阻碍宿主彻底清除该细菌⁷。辅助基因调节子（agr）和金黄色葡萄球菌辅助元件（Sae）是两个与Staphylococcus aureus在吞噬细胞内存活密切相关的重要毒力调控系统^8,9。agr系统是一种群体感应机制，可调控S. aureus中多种毒力因子的表达，控制毒素及其他促进细菌存活与播散因子的产生。在胞内感染过程中，agr系统在调控毒力因子方面发挥关键作用，这些毒力因子对细菌逃避宿主免疫应答及在宿主细胞内存活至关重要。研究表明，agr系统影响细菌从吞噬体中逃逸并在巨噬细胞中持续存在的能力。agr缺失可导致细菌在宿主细胞内的存活能力下降以及毒力减弱^10,11。Sae系统是一种双组分调控系统，可调控S. aureus中多种毒力因子的表达，参与调控毒素和酶的产生，从而增强细菌侵袭和破坏宿主组织的能力。Sae系统在S. aureus的胞内存活中也发挥着关键作用，可影响细菌抵抗宿主吞噬细胞杀伤以及逃避自噬降解的能力^12,13。

当病原体入侵时，巨噬细胞具有吞噬功能，能够吞噬并杀灭外来病原体，同时激活适应性免疫反应¹⁴。大多数入侵的细菌会被巨噬细胞吞噬，随后巨噬细胞启动多种杀伤机制以清除这些细菌。然而，部分S. aureus细菌可在巨噬细胞内存活，导致宿主发生持续性感染。除了细菌蛋白外，宿主还可通过分泌细胞因子影响S. aureus在巨噬细胞内的存活与增殖^15,16,17。一些研究表明，S. aureus可通过驻留在自噬体中以逃避降解，从而建立有利于其扩散的细胞内生态位¹⁸。S. aureus在侵入巨噬细胞后，通过阻断自噬流（如LC3-II、p62）以及提高自噬溶酶体内的pH值，从而逃逸自噬性降解¹⁹。这种免疫逃逸机制依赖于对S. aureus毒力因子和自噬过程的调控，导致持续且隐匿的感染。

清除细胞内 S. aureus 感染对于临床实践中控制持续性和潜伏性感染至关重要。目前，抗生素是治疗 S. aureus 感染的主要手段，其中万古霉素是治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）感染的最后一道防线^20,21。然而，大量研究表明，现有抗生素在体内（in vivo）和体外（in vitro）均无法有效清除细胞内的 S. aureus^22,23,24。

目前尚无统一标准用于各种细胞内感染模型 S. aureus^25,26,27，因为各个模型的条件差异显著，因此无法采用相同的标准来评估这些模型的有效性。在本研究中，我们建立了一种通用的细胞内感染模型 金黄色葡萄球菌 通过优化实验条件，该模型比其他模型更具便利性，因为它允许细菌对细胞进行初始感染。 体外，随后将这些感染的细胞递送至体内。

为了更好地理解细胞内机制 S. aureus 感染并开发相关药物，我们建立了两种 体外 和 在体 模型。已成功建立稳定的细胞内感染模型 体外 通过用抗生素感染RAW264.7细胞并进行共培养，随后提取腹腔巨噬细胞并建立细胞内感染模型。通过将这些腹腔巨噬细胞注射入小鼠体内，建立小鼠体内的细胞内感染模型。

方案

实验动物为6至8周龄的无特定病原体（SPF）雌性BALB/c小鼠，购自北京华阜康生物科技股份有限公司（中国北京）。所有动物实验均经第三军医大学实验动物福利与伦理委员会批准，并依照机构及国家关于实验动物使用的政策和指南进行。小鼠饲养于SPF级设施中，自由摄取无菌饲料和饮水。动物被随机分组，并在实验开始前给予至少7天的适应期。

1. 金黄色葡萄球菌（S. aureus）的准备

1. 菌株复苏：取一管冻存的MRSA252，灼烧并冷却接种环，蘸取菌液划线接种于胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）平板上（参见 材料表) 采用划线平板法²⁸，37 °C 过夜培养。
2. 细菌活化：次日，取一个50 mL摇瓶，加入20 mL胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）培养基（参见 材料表用10 µL移液枪枪头挑取单个菌落并加入摇菌管中。在37 °C、220 rpm条件下过夜培养。
3. 二次活化：次日，取一个含有15 mL TSB培养基的50 mL摇瓶。从含有初次活化菌液的摇瓶中吸取200 µL菌液，加入另一个含有20 mL TSB培养基的新摇瓶中，在220 rpm、37 °C条件下振荡培养4小时。
4. 收集二次活化的细菌溶液至50 mL离心管中，3,000 x g 10 分钟后，弃去上清液。
5. 将沉淀的细菌重悬于10 mL生理盐水中，于3,000 x g 10 分钟。重复此步骤 2 次。
6. 测量菌液的OD600值，并用生理盐水将其调整至1.0。此时，本实验中MRSA252的菌量为1.0 × 10⁹ CFU/mL
   注意：将菌液加入不含抗生素的培养基中，并稀释至所需浓度；本实验所用的所有细菌均按上述方法制备。

2. 细胞内感染模型的建立 体外

1. RAW264.7 细胞的制备
   注意：本研究中使用的细胞系均购自ATCC。所有细胞系支原体污染检测结果均为阴性。所有实验均使用处于对数生长期的细胞进行。
   1. 将细胞从液氮中取出，在37 °C水浴中解冻。
   2. 将 RAW264.7 细胞放入 15 mL 离心管中，加入 2 mL 杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM；参见 材料表) 加入10%胎牛血清（见 材料表）、青霉素（100 单位/毫升）和链霉素（100 µg/mL；参见 材料表；在37 °C、5% CO₂条件下使用完全培养基培养₂. 以 300 x g 离心 g 5 分钟。
   3. 接种 3 × 10⁶ 在100 mm培养皿中加入10 mL完全培养基接种RAW264.7细胞。置于37 °C、5% CO₂的细胞培养箱中孵育12 h。₂ 使细胞汇合度保持在50%–60%之间。
2. 体外 细胞内感染
   1. 取10 µL细胞悬液，加入细胞计数仪中以计算细胞浓度。计数后接种2 x 10⁵ RAW264.7 细胞接种于 24 孔板中（参见 材料表使用完全培养基，每孔1 mL，置于细胞培养箱中孵育10–12小时。
   2. 吸除上清液，加入1 mL含有2 × 10⁶个细胞的完全培养基⁶ 将CFU细菌溶液（步骤1.6）加入各孔中，置于细胞培养孵箱中孵育2小时。MRSA252感染的感染复数
      感染复数（MOI）为10。（为验证不同感染复数（MOI）值与细胞吞噬细菌之间的相关性，我们设立了MOI值分别为20、30、40和50的实验组。）
      注意：感染细胞时使用的完全培养基中不含青霉素和链霉素。
   3. 移除上清液，并用 PBS 洗涤细胞 2 次（参见 材料表）。每孔加入 800 µL 含 100 µg/mL 庆大霉素的 DMEM（参见 材料表）并置于含5% CO₂的细胞培养箱中，37 °C培养₂ 2小时。
3. 评估 体外 细胞内感染模型
   1. 细胞内 S. aureus 杀伤实验
      1. 分别将 RAW264.7 细胞（步骤 2.2.2 和 2.2.3）收集至离心管中。用 PBS 洗涤细胞 2 次，加入 0.1% Triton X-100（见 材料表将溶液加入各管中，孵育5分钟，收集裂解液至离心管中。
      2. 使用 PBS 对裂解液进行连续稀释。取 20 µL 裂解液加入含有 180 µL PBS 的微量离心管中，通过移液充分混匀。按照此步骤逐步进行稀释。将每种稀释度的裂解液接种至 TSA 平板，于 37 °C 培养过夜。计数 TSA 平板上裂解液的菌落（图1A).
         注意：此外，我们研究了耐甲氧西林金黄色葡萄球菌252（MRSA252）在腹腔巨噬细胞内感染的最佳实验条件。经不同浓度庆大霉素处理后，感染MRSA252的腹腔巨噬细胞内的细菌载量如图所示 图1B，而经 100 µg/mL 庆大霉素处理不同时间后的细菌载量如图所示 图1C.
      3. 按照第2.3.1.2节所述，用PBS对上清液和裂解液进行连续稀释，并观察上清液和裂解液在TSA平板上的菌落情况图2A).
   2. 共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）
      1. 将 RAW264.7 细胞（步骤 2.2）稀释至 2 x 10⁵ 每毫升细胞数置于共聚焦培养皿中（参见 材料表）并置于含5% CO₂的37 °C细胞培养箱中过夜，以促进细胞贴壁。₂加入1 mL含有2 × 10⁶个细胞的完全培养基⁶ CFU 和 4 × 10⁶ 将细菌溶液（步骤1.6）分别加入各共聚焦培养皿中，置于细胞培养箱中孵育2小时，使感染复数（MOI）分别为10和20。
      2. 移去上清液，用 PBS 洗涤细胞 3 次，加入含 100 µg/mL 庆大霉素的 DMEM 培养基孵育 2 小时，以去除胞外细菌。随后移去上清液，用 PBS 洗涤细胞 2 次，加入 DIL 工作液（见 材料表），在37 °C避光孵育5分钟。
      3. 去除DIL工作液，用PBS洗涤3次，然后用4%多聚甲醛溶液固定（参见 材料表20分钟
      4. 去除多聚甲醛溶液，用 PBS 洗涤 3 次，加入 DAPI 染液（见 材料表）避光孵育5分钟。移除DAPI染液，用PBS洗涤5次。使用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察细胞（图2B).
         注意：本研究使用了经绿色荧光蛋白（GFP）改造的MRSA252，该菌株通过同源重组方法构建而成²⁹.

3. 建立 体内 细胞内感染模型

1. 小鼠腹腔巨噬细胞的获取
   1. 配制6%淀粉肉汤。按照3:10:5（w/w）的质量比，加入三种赋形剂（牛肉浸膏粉、胰蛋白胨、氯化钠；参见 材料表）依次加入玻璃容器中。加入1 L的ddH₂O。₂O至玻璃容器中，搅拌至溶解，并用微波炉加热。加入可溶性淀粉（见 材料表以6的质量比混合，搅拌至溶解，并将玻璃容器在121 °C下高压灭菌30分钟。储存于4 °C冰箱中，直至形成糊状。
   2. 按照下述步骤收集小鼠腹腔巨噬细胞。
      1. 选取两只 Balb/c 小鼠。用左手抓住小鼠的颈部并控制其尾巴。将小鼠翻转，使其头部朝下、腹部朝上（图3A）。每只小鼠腹腔注射6%淀粉肉汤3 mL（图3B).
         注意：由于重力作用，腹腔内的器官会向后移至胸腔，从而防止注射器损伤其他器官。
      2. 72 小时后，使用 3% 异氟烷麻醉小鼠，随后通过颈椎脱位法处死。用 75% 乙醇对小鼠进行消毒。使用眼科剪剪开小鼠腹部，充分暴露其腹膜（图4A- C).
      3. 通过腹腔注射将10 mL DMEM培养基注入小鼠体内，以灌洗腹腔图 4D）。将DMEM注入小鼠腹腔后，轻轻揉搓小鼠腹部约1分钟，以更充分地灌洗腹腔。用注射器将灌洗液收集至50 mL离心管中（图4E).
      4. 以 300 x g 离心洗涤液 g 5 分钟后弃去上清液。
      5. 使用10 mL DMEM，添加10%胎牛血清、青霉素（100单位/mL）和链霉素（100 µg/mL；完全培养基）吹打并重悬收集的细胞，计数后将细胞浓度调整至2 × 10⁶/mL，并接种至6孔板（参见 材料表），每孔1 mL。
      6. 将6孔板置于37 °C、5% CO₂培养箱中₂，孵育4小时，然后移除上清液。用无菌PBS洗涤细胞2次，每孔加入1 mL DMEM，于37 °C、5% CO₂条件下培养过夜₂.
2. 细胞内细菌的制备
   1. 将腹腔巨噬细胞（步骤 3.1.2）与 MRSA252 共同孵育 2 小时。移除上清液，用 PBS 洗涤细胞 2 次。加入含 100 µg/mL 庆大霉素的完全 DMEM 培养基（每孔 1 mL），于 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 2 小时₂.
   2. 移去上清液，用 PBS 洗涤细胞 3 次。使用细胞刮刀将小鼠腹腔巨噬细胞收集至 50 mL 离心管中，在 300 x g 5 分钟。已成功在腹腔巨噬细胞中制备出 MRSA252 的胞内细菌。
   3. 用于计算细胞内细菌时，向感染了细胞内MRSA252的腹腔巨噬细胞加入溶菌酶（10 µg/mL，参见 材料表在37 °C下孵育10分钟，然后用PBS洗涤2次。接着加入1 mL PBS重悬细胞。加入0.1% Triton X-100裂解细胞，作用5分钟。
   4. 将裂解液进行系列稀释后滴加到TSA平板上，37 °C过夜培养。计算MRSA252在腹腔巨噬细胞内的细菌数量，为1.8 x 10⁶ 每只小鼠的菌落形成单位（CFU），通过计数细菌菌落获得。
      注意：使用细胞刮刀收集细胞时动作应轻柔。应沿单一方向刮取细胞，避免细胞破裂，以免影响后续实验。
3. 小鼠细胞内细菌感染
   1. 将20只Balb/c小鼠随机分为四组（n=5）， 图 5A).
   2. 对于第一组，注射 3 x 10⁶ 通过静脉注射每只小鼠注入CFU浮游态MRSA252。对于II组，注射3 x 10⁶ CFU 浮游 MRSA252 和万古霉素（110 mg/kg；参见 材料表通过静脉注射，每只小鼠注射相应试剂。对于第III组，通过静脉注射注入细胞内细菌（按3.2步骤制备）。对于第IV组，通过静脉注射每只小鼠注入细胞内细菌（按3.2步骤制备）和万古霉素（110 mg/kg）。
   3. 将小鼠置于红外理疗灯下，直至其尾静脉扩张。
   4. 经静脉注射 3 x 10⁶ 每只小鼠静脉注射浮游CFU形式的MRSA252，分别对应第I组和第II组。每只小鼠静脉注射步骤3.2中制备的胞内菌，分别对应第III组和第IV组。
      注意：使用注射器收集含有胞内细菌的液体时，建议先用移液器轻轻将液体充分混匀，以确保各小鼠间的感染水平一致。
   5. 30分钟后，对II组和IV组每只小鼠静脉注射万古霉素。
4. 评估 体内 细胞内感染模型
   1. 通过计数肾脏中细菌的定植情况，评估小鼠的胞内感染模型。注射后24小时，使用3%异氟烷麻醉小鼠，并通过颈椎脱位处死。将小鼠置于75%乙醇中消毒。
   2. 固定小鼠，一手用镊子提起腹部皮肤，另一手用眼科剪剪开小鼠腹部皮肤，暴露腹腔，找到肾脏，完整剥离肾脏，并将其置于PBS中。
   3. 向组织研磨管中加入1 mL PBS。将每只小鼠的肾脏分别转移至不同的研磨管中，研磨至无固体组织残留。将匀浆后的组织液倒入各自的EP管中，并用相应的小鼠编号标记每根EP管。
   4. 使用 PBS 对组织匀浆进行系列稀释。将每个稀释度分别点样于不同的 TSA 平板上，37 °C 过夜培养。计数菌落并分析数据（图5B).

结果

细胞内感染模型 S. aureus 均成功建立 体外 和 体内通过优化吞噬作用的实验条件，并延长抗生素处理的浓度和持续时间，部分 S. aureus 在巨噬细胞内存活（图1）。为进一步评估抗生素耐药性 S. aureus，用MRSA252感染的巨噬细胞用抗生素处理2小时，直至细胞上清液中不再含有 S. aureus，而一些细菌在巨噬细胞内存活了下来（图2A）。共聚焦激光扫描显微镜显示，抗生素无法杀死 S. aureus 细胞内图2B）。此外，小鼠细菌定植实验表明，万古霉素能够清除浮游状态的 S. aureus，但对细胞内寄生的细菌无效（图5B）。因此，细胞内感染模型 S. aureus<...

讨论

S. aureus 作为一种兼性胞内病原体，能够侵入并在多种细胞类型中存活，利用这一能力在感染过程中逃避抗生素和免疫反应³⁰。本研究建立了一种 S. aureus 的体内胞内感染模型，为深入探究该病原体的胞内感染机制提供了基础。通过考察不同感染复数（MOI）对巨噬细胞吞噬 S. aureus 的影响，以及不同抗生素浓度和处理时间的清除效果，确定了建立胞内感染模型的最佳条件（图1）。

当构建时 体外 模型 S. aureus 细胞内感染，调整 S. aureus 对数生长期的病原体稀释至所需浓度后加入细胞培养板中。确保培养基中不含抗生素，因为抗生素的存在可能抑制病原体侵入细胞的能力。感染2小时后，加入含有100 µg/mL浓度庆大霉素的培养基处理感染的细胞。细胞定植实验 (图2A)

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
24孔板	Corning Incorporated, USA	3524
4% 多聚甲醛溶液	BBI, UK	E672002-0500
6孔板	Corning Incorporated, USA	3516
牛肉提取物粉末	BBI, UK	A600114-0500
生物危害安全设备	Heal force, 中国	VS-1300L-u
细胞培养箱	ESCO, 新加坡	CCL-170B-8
细胞刮刀	Nest	710001
离心机 M1416R	RWD, 中国	M1416R
离心管	广厚 Labselect, 中国	CT-002-50A
共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）	Zeiss, 德国	880
共聚焦培养皿	Biosharp, 中国	BS-20-GJM
DAPI 染料	上海碧云天, 中国	C1006
DIL 工作液	上海碧云天, 中国	C1991S
Dulbecco’s 改良伊格尔培养基	Thermo Gibco, USA	C11995500BT
胎牛血清	Hyclone	SV30208.02
庆大霉素	上海生工, 中国	B540724-0010
培养箱	上海恒子, 中国	HDPF-150
溶菌酶	北京索莱宝, 中国	L9070
MRSA252	第三军医大学, 中国	null
MRSA252(GPF)	第三军医大学, 中国	null
青霉素和链霉素	上海碧云天, 中国	C0222
磷酸盐缓冲液	上海碧云天, 中国	ST476
生理盐水	四川科伦, 中国	null
氯化钠	上海麦克林, 中国	S805275
可溶性淀粉	上海生工, 中国	A500904-0500
Triton X-100	上海碧云天, 中国	P0096-100ml
胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）平板	北京奥博兴生物科技有限公司, 中国	02-130
胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）培养基	北京奥博兴生物科技有限公司, 中国	02-102K
胰蛋白胨	OXOID, UK	LP0042B
万古霉素	上海碧云天, 中国	ST2807-250mg
RAW264.7 细胞	美国, ATCC	null