胰腺导管细胞系中pH改变条件下的癌基因表达分析

摘要

本研究描述了一种通过胰腺导管细胞系的RNA-seq分析，探究pH值改变对癌基因表达影响的实验方案。

摘要

胰腺导管腺癌（PDAC）是癌症相关死亡的第四大原因，其五年生存率仅为12%。该疾病预后较差，其特征是存在致密的间质微环境，给治疗带来实质性挑战。慢性胰腺炎患者发生PDAC的风险高出10倍；在这些患者中，由于碳酸氢盐不足和炎症环境的影响，导管pH值从pH 8.0下降至pH 6.0。我们的研究目标是明确在慢性胰腺炎中观察到的酸性环境对胰腺导管细胞系中癌基因表达的影响。

因此，将80%汇合度的人胰腺导管上皮细胞在pH 6.0至pH 7.2条件下孵育6小时。提取细胞总RNA，并对样本中的总mRNA进行富集。通过生物重复样本的下一代测序（NGS）评估基因表达水平。RNA-seq分析借助在线工具完成，筛选出差异表达基因（FCs < ± 2.0）；在pH 6.0、6.5和7.0条件下分别发现90、148和109个上调基因，以及20、14和23个下调基因。在pH 6.0时有4个癌基因上调，pH 6.5和pH 7.0时各有7个癌基因上调。在pH 6.0、pH 6.5和pH 7.0条件下均上调的共同基因包括淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶（LCK）[pH 6.0，FC：2.93；pH 6.5，FC：2.93；pH 7.0，FC：3.32]、FGR原癌基因，Src家族酪氨酸激酶（FGR）[pH 6.0，FC：4.17；pH 6.5，FC：5.25；pH 7.0，FC：5.09]，以及含SH3结构域、锚蛋白重复序列和PH结构域的ArfGAP 3（ASAP3）[pH 6.0，FC：2.37；pH 6.5，FC：3.84；pH 7.0，FC：2.51]。酸性环境可触发原癌基因的活化，这可能在慢性胰腺炎中引发肿瘤的发生。

引言

胰腺导管腺癌（PDAC）是最常见的癌症之一，其相关死亡人数在所有癌症中位居第四¹。PDAC患者的死亡率较高，根据最近的研究，五年生存率仅为12%。患有慢性胰腺炎（一种导致胰腺炎症的疾病）²的患者发展为PDAC的可能性更高（约增加15-16倍）³。慢性胰腺炎有多种类型，病因各异，例如酒精相关性、遗传性及特发性慢性胰腺炎⁴。已知慢性胰腺炎病程中存在的病理状态可导致钙化结石形成、癌细胞发展，甚至糖尿病。在遗传性慢性胰腺炎患者中，PDAC的发病率较高⁵。

慢性胰腺炎（CP）患者胰腺内的某些生理条件可能有利于其他疾病的发生，这些条件包括炎症微环境、活跃的消化酶以及胰液的酸性pH值⁶。目前在炎症领域正开展大量研究，因为炎症会扰乱器官的正常功能^7,8,9。然而，pH调节失衡是另一种可能触发细胞不受控生长的现象¹⁰。健康个体的胰液呈碱性，有助于中和胃部产生的酸性食糜。相比之下，由于碳酸氢盐分泌不足，CP患者的胰液保持酸性。低水平的碳酸氢盐无法完全中和胰液，导致导管内形成轻度酸性环境¹¹。

早期研究表明，癌细胞能够适应酸性环境并在其中增殖¹²。在慢性胰腺炎过程中存在的条件可能为这些细胞的增殖和转移提供了有利环境¹³。因此，本研究旨在评估人胰腺导管细胞在轻度酸性条件下的形态学变化，并检测癌基因的表达情况。

方案

1. 细胞系的复苏

1. 获取人正常胰腺导管细胞系（HPDEC/H6C7），并在新鲜培养基中复苏细胞。
   1. 在37 °C水浴中解冻细胞。
   2. 新鲜配制完全培养基，并使用注射器滤器过滤。
      注意：完全培养基包含添加了10%胎牛血清（FBS）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）。
   3. 取6 mL完全培养基加入一个新的15 mL锥形管中，加入解冻后的细胞悬液，并充分混匀。
   4. 将细胞悬液在1,800 × g 条件下离心6分钟。弃去上清液，向沉淀中加入1 mL培养基，轻轻混匀。
      注意：培养基包含含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素抗生素的DMEM。
   5. 将细胞逐滴加入含有4 mL培养基的T-25培养瓶中，于37 °C、5% CO₂条件下培养。

2. 改变培养基的pH值

1. 按照表1所述，配制100 mL浓度为0.5 M、pH值分别为6.0、6.5和7.0的磷酸钠缓冲液储备液。
2. 使用pH计检测pH值，并用1 N HCl或1 M NaOH调节至目标pH值。
3. 在超净工作台中使用0.45 µm针头滤器对缓冲液进行过滤除菌。
   注意：缓冲液可于4 °C保存，待后续使用。
4. 取80 mL培养基，分别加入20 mL对应pH值的无菌0.5 M磷酸钠缓冲液，配制成pH为6.0、6.5和7.0的培养基。
5. 将不同pH值的培养基加入至融合度为85–90%的人胰腺导管细胞中，随后在明场显微镜下每隔1小时观察一次细胞形态变化，持续观察6小时。

3. RNA 提取

注意：从细胞中分离RNA时必须使用无菌手套，并且操作表面必须使用100%乙醇进行去污染处理。

1. 移除培养基，并用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗细胞。
2. 将培养板置于冰上，在孔中加入 PBS，然后用细胞刮刀刮取细胞。
   注意：加入的 PBS 量应足以覆盖细胞以便刮取，无需加入大量 PBS。
3. 将悬液收集至新离心管中，在 8,000 ×g 条件下离心 10 分钟，弃去上清液。
4. 向沉淀中加入含 β-巯基乙醇的裂解缓冲液，在冰上反复吹打 5–10 分钟。
5. 向裂解液中加入等体积的 70% 乙醇，并充分混匀。切勿涡旋震荡。
6. 将溶液加入硅胶膜离心柱中，在 >8,000 ×g 条件下离心 30 秒，弃去穿流液。
7. 向样品中加入洗涤缓冲液，在 >8,000 ×g 条件下离心 30 秒。再将空管在 >8,000 ×g 条件下离心 1 分钟。
8. 向离心柱中加入 30–50 µL 无核酸酶水，在室温下静置 5 分钟。然后在 >8,000 ×g 条件下离心 5 分钟。
   注意：RNA 样品可于 -20 °C 保存，直至后续使用。

4. RNA测序/转录组

1. RNA 完整性评估
   1. 取 1 µL（25–500 ng）RNA 样品，与 5 µL 染料缓冲液混合，使用生物分析仪检测 RNA 完整性。
   2. 在 500 ×g 条件下涡旋振荡溶液 1 分钟，短暂离心。
   3. 每个样品进行一步法聚合酶链式反应（PCR），72 °C 反应 3 分钟，然后将试管置于冰上孵育 2 分钟，再进行生物分析仪分析。
2. rRNA 耗尽的总 RNA 制备
   1. 在新的 PCR 管中加入 5 µg 总 RNA、50 µL 杂交缓冲液和 1–3 µL 探针混合物。
   2. 执行以下步骤：第一步，在 70 °C 变性 10 分钟；第二步，在 37 °C 杂交 20 分钟；随后在 37 °C 孵育直至使用。
   3. 在新管中加入 500 µL 磁珠和样品，将混合物置于磁力架上 1 分钟，直至溶液澄清。
   4. 小心弃去上清液。取出试管，加入 500 µL 无核酸酶水洗涤磁珠，再放回磁力架上静置 1 分钟，待溶液澄清后弃去上清液。
   5. 重复该步骤 5–7 次。加入 200 µL 杂交缓冲液并充分混匀，将试管置于 37 °C 保持 5 分钟。
   6. 向上述混合物中加入 100 µL RNA 探针，轻轻混匀后在 37 °C 孵育 15 分钟。
   7. 孵育前短暂离心试管，然后置于磁力架上 1 分钟。
   8. 收集含有 rRNA 耗尽 RNA 的澄清上清液至新管中。
3. RNA 片段化
   1. 在新的 PCR 管中加入 8–10 µL rRNA 耗尽的总 RNA（500 ng/g）、1 µL 10× 缓冲液和 1 µL RNase III。
   2. 轻弹混匀后短暂离心。
   3. 将试管放入热循环仪中，在 37 °C 反应 10 分钟。
   4. 在新管中加入 5 µL 核酸结合磁珠，再加入 90 µL 结合溶液浓缩液。
   5. 向上述混合物中加入 30 µL RNA 片段和 150 µL 100% 乙醇。用移液器吹打 10 次混匀样品，在室温下孵育 5 分钟。
   6. 将试管置于磁力架上，待溶液澄清后，移除并弃去上清液。
   7. 在磁力架上用 150 µL 乙醇洗涤磁珠，静置 30 秒后弃去上清液。
   8. 将试管继续置于磁力架上 1–2 分钟，使残留乙醇充分挥发。
   9. 向磁珠中加入 12 µL 预热的无核酸酶水，用移液器吹打 10 次混匀样品。
   10. 室温孵育 1 分钟，将试管置于磁力架上，待溶液澄清后收集上清液。
4. 文库构建与 cDNA 合成
   1. 将 3 µL 片段化 RNA 样品加入 PCR 管中，再加入 5 µL 杂交混合液。用移液器吹打数次混匀后短暂离心。
   2. 将试管放入热循环仪中，65 °C 孵育 10 分钟，随后 30 °C 孵育 5 分钟。
   3. 向上述溶液中加入 10 µL 连接缓冲液和 2 µL 连接酶混合物。在热循环仪中 30 °C 孵育反应 1 小时。
   4. 向连接反应产物中加入逆转录酶预混液，在 70 °C 孵育 10 分钟，随后置于冰上冷却。
5. cDNA 扩增
   1. 在新的 PCR 管中加入 6 µL cDNA（500 ng），再加入 46 µL 条形码 PCR 混合液（含 46 µL 高保真聚合酶和 1 µL 3' 条形码引物）。
   2. 设置 PCR 程序如下：第一阶段，94 °C 保持 2 分钟；第二阶段，94 °C 30 秒、50 °C 30 秒，循环一次；第三阶段，16 个循环：94 °C 30 秒、62 °C 30 秒、68 °C 30 秒，最后 68 °C 延伸 5 分钟。
   3. 通过重复步骤 4.3.5 至 4.3.10 进行扩增后 cDNA 纯化，将前述步骤获得的 PCR 产物替代原片段化 RNA 样品。
   4. 在测序仪（NGS）上分析纯化后的 RNA 样品，生成 FASTq 格式数据文件。

5. 生物信息学

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3. 创建账户后，通过填写公开名称/用户名和密码登录账户。
4. 上传RNA-seq分析后获得的FASTq文件，方法是单击 上传 左侧面板上的选项。
5. 选择 cutadapt 工具 来自 工具 位于左侧面板的部分。此工具将截除低质量序列。
   注意：此文件现在可用于作图。
6. 点击 工具 左侧面板上的按钮并查找 RNA star 工具. 按如下方式填写详细信息：使用 cutadapt 的输出文件，选择 参考基因组 作为 人类参考基因组（hg38），并更改 注释剪接位点周围基因组序列的长度 到 36. 选择输出为 基因计数 并点击 运行工具 右上角的选项。
   注意：此工具将生成一个 BAM 文件。
7. 选择 featurecounts 工具 来自 工具 选项并上传经过 RNA star 分析后获得的 BAM 文件。设置 每条读段的最小比对质量 选项在 读段筛选 选项 10，然后单击 运行工具 右上角的选项。
8. 从右侧面板打开 featurecount 输出文件，将数据复制到电子表格中。使用公式 =log(倍数变化, 2) 计算相对于对照组的倍数变化，即将测试组获得的读段数除以对照组获得的读段数后取以2为底的对数。
   注意：倍数变化 <-2.0 被认为表示下调，而倍数变化 > 2.0 被视为上调。

结果

形态学变化
在酸性培养基中孵育人胰腺导管细胞会改变细胞的形态。在酸性条件下，原本融合且紧密排列的细胞模式转变为分散的细胞，且随着时间推移，细胞死亡现象变得显著。与正常培养基中的细胞相比，导管细胞发生收缩，体积减小。孵育6小时后，细胞死亡率出现显著变化。孵育24小时后，细胞数量减少，细胞呈现应激状态（图1、图2 和 图3）。因此，在进一步分析前，将酸性培养基中的孵育时间延长至6小时。

RNA-seq 分析
转录组的原始文件可在 Mendeley Data（https://data.mendeley.com/datasets/kd994sftcs/1）获取，DOI: 10.17632/kd994sftcs.1。NGS 数据显示，在 pH 6.0 条件下共有 1,389 个基因，在 pH 6.5 条件下有 1,346 个基因，在...

讨论

本方法旨在研究酸性条件对非癌变人胰腺导管上皮细胞在生物学重复中的影响。培养基pH值的改变使细胞处于应激状态，并观察到细胞形态发生变化。细胞在pH 6.0、6.5或7.0条件下培养24小时，并每小时监测一次，以优化后续实验的孵育时间。我们观察到在酸性pH下孵育4小时后细胞形态发生改变，孵育6小时后细胞死亡率升高。因此，在进行基因表达分析前，选择将细胞孵育6小时。

具有log2倍数变化的差异表达基因（DEGs）揭示了酸性pH对导管细胞基因表达的影响。LCK、FGR和ASAP3等癌基因表达水平的升高表明酸性pH可影响导管上皮细胞的基因表达。在酸性pH条件下，癌基因和肿瘤抑制基因表达的失调提示pH可能在炎症条件下参与肿瘤的启动过程^7,8。

该方法的关键步骤是导管细胞在酸性pH条件下的孵育时间，因为与癌细胞不同，非癌细胞对培养条件的变化更为敏感，这成为进行长时间孵育实...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
15 mL 带刻度离心管（Falcon）	Tarsons	500031	用于样品制备
50 mL 带刻度离心管（Falcon）	Tarsons	500041	用于样品制备
Agilent 2100 Bioanalyzer 仪器	Agilent	Agilent G2938A	用于 RNA 质量评估的仪器
抗生素-抗真菌溶液 100 倍液	Himedia	A002-100 mL	用于防止污染
带可旋转刀片的细胞刮刀	Himedia	TCP223	用于刮取和收集细胞
CO2 培养箱	New Brunswick	Galaxy 170 S	用于细胞培养的孵育
杜氏改良伊格尔培养基（DMEM），高糖	Himedia	AL007S-500 mL	用于细胞培养的培养基
杜氏磷酸盐缓冲液 1 倍液	Himedia	TL1006-500mL	用于细胞洗涤
Galaxy	(https://usegalaxy.org)		用于处理 NSG 数据的在线工具
HI FBS（来源：澳大利亚）	Gibco	10100-147	用于细胞生长
人胰腺导管上皮细胞系（HPDEC/H6C7）	Addex Bio	T0018001	胰腺导管细胞系
Ion Total RNA-Seq Kit v2	Thermo Fisher Scientific	4475936	RNA 样品制备试剂盒
层流洁净工作台
Na2HPO4 二碱磷酸钠	Sigma Aldrich	S3264-250G	用于磷酸钠缓冲液的配制
NaH2PO4 一碱磷酸钠	Sigma Aldrich	S3139-250G	用于磷酸钠缓冲液的配制
NovaSeq 6000	Illumina	3376672	测序仪
Nunclon Delta 表面培养板（6 孔板）	Thermo Scientific	140675	用于细胞培养
台式冷冻离心机	Thermo Scientific	Sorvall ST 8R	用于离心操作
RiboMinus Eukaryote System v2	Thermo Fisher Scientific	A15026	rRNA 去除试剂盒
RNeasy Mini 试剂盒	Qiagen	74104	用于从细胞中提取总 RNA 的试剂盒
PCR 仪	Eppendorf	E950040025	用于 PCR 反应
水浴锅	Equitron	#8406M	用于样品解冻