本文介绍了一种可重复的方法,通过结合熔融电纺写入(MEW)法制备的聚己内酯(PCL)支架、纤维蛋白水凝胶以及人诱导多能干细胞来源的心肌细胞和成纤维细胞,生成三维心肌组织。该技术可精确控制支架结构,适用于临床前药物筛选和心脏疾病建模。
方法文章
本文介绍了一种可重复的方法,通过结合熔融电纺写入(MEW)法制备的聚己内酯(PCL)支架、纤维蛋白水凝胶以及人诱导多能干细胞来源的心肌细胞和成纤维细胞,生成三维心肌组织。该技术可精确控制支架结构,适用于临床前药物筛选和心脏疾病建模。
功能性人类心肌组织的开发在药物筛选、疾病建模和再生医学的应用方面具有重要意义。本方案描述了一种逐步构建三维心肌组织的方法,通过将熔融电纺写入(melt electrospinning writing, MEW)技术制备的聚己内酯(polycaprolactone, PCL)支架与纤维蛋白水凝胶及人诱导多能干细胞(hiPSC)来源的心脏细胞相结合,实现对天然心肌结构的高度模拟。该过程包括将心肌细胞(hiPSC-CMs)与心脏成纤维细胞(hiPSC-CFs)混合后包埋于纤维蛋白基质中,形成微型组织,并由MEW生成的支架提供结构支撑。这些纤维状支架在微米至纳米尺度上构建,可精确调控纤维结构,从而在细胞分布与取向排列中发挥关键作用。同时,纤维蛋白基质有助于维持细胞活力并模拟细胞外环境。对所生成组织的表征显示,hiPSC-CMs中形成了结构良好的肌节,并表现出稳定的收缩活性。组织在接种后最早两天即出现持续的自发搏动,且功能可长期维持。hiPSC-CFs与hiPSC-CMs的共培养增强了组织的结构完整性,同时支持细胞的长期存活。该方法提供了一种可重复、可调节且可放大的生物模拟心脏组织构建策略,为临床前药物测试、心脏疾病的机制研究以及潜在的再生治疗提供了多功能平台。
构建功能性人类心脏工程组织在高影响力应用方面具有广阔前景,其应用范围涵盖药物心脏毒性与人类心脏疾病模型的开发,以及具有相关尺寸的治疗性组织的生成1。尽管过去15年中该领域已取得显著进展,但目前构建高度仿生的人类心肌仍受限于难以重现天然心肌复杂的结构与力学组织特性2。
在生物学方面,革命性的细胞重编程技术为开发患者特异性的治疗细胞提供了可能。目前,在个体化背景下,人诱导性多能干细胞(hiPSCs)是获取人心肌细胞的唯一来源。通过稳健的分化方案,可获得高产量的心肌细胞3,4。一个关键问题是细胞的成熟度,因为目前在常规二维(2D)分化条件下使用的人hiPSC来源心肌细胞(hiPSC-CMs)表现出未成熟的表型5。这一问题与心脏组织复杂的结构构象密切相关,后者与常规的二维培养体系完全不同。此外,心肌组织由多种心血管细胞有序组成,包括心脏成纤维细胞、平滑肌细胞和内皮细胞等非肌细胞,这些细胞通过特定的三维(3D)结构排列,实现高效的血液泵送功能6,7。因此,需要构建包含所有主要细胞类型的高结构化人源心脏微组织,以生成具有生理相关性的仿生组织。
采用新型生物制造方法有望打破这一僵局。其中,熔融静电纺丝书写技术(melt electrospinning writing, MEW)作为一种先进的3D打印技术,能够实现高精度和高分辨率。在MEW中,利用电场将熔融聚合物以纤维形式沉积,纤维尺寸与细胞尺寸相当,比传统的熔融沉积成型(fused deposition modeling, FDM)3D打印小一个数量级,从而形成高度有序的支架结构8,9。研究表明,MEW能够将复杂的in silico设计转化为实际打印的基质,并在三维空间中调控物理特性以匹配心肌组织的特性10。利用MEW技术,可以打印出具有不同形状和结构的聚合物网格,结合柔软且利于细胞生长的水凝胶,构建出模拟天然成年心肌组织微观与宏观力学环境的复合组织11,12。研究已证实,改变MEW 3D支架的设计可影响其最终功能(如钙瞬变)10,这为理解这一有前景的3D工程化系统中的结构-功能关系奠定了基础。
本文提供了一种详细的实验方案,用于利用人诱导多能干细胞来源的心肌细胞(hiPSC-CMs)和人诱导多能干细胞来源的心脏成纤维细胞(hiPSC-CFs)构建具有收缩功能的人类心脏微组织,并将其与通过熔融电写技术(3D MEW)打印的三维结构增强的纤维蛋白水凝胶相结合。在多种三维工程化系统中,添加成纤维细胞已被广泛用于提高hiPSC-CMs的存活率并维持组织结构,但其在3D-MEW系统中的应用尚未被探索13。本文所述技术为研究人员提供了一个多功能平台,可用于构建精确的心脏组织模型,应用于疾病机制研究、临床前毒理学评估和药物筛选等领域。该模型适用于评估已知药物(如蒽环类药物(例如多柔比星)、酪氨酸激酶抑制剂)以及新兴疗法(如嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞)引起的心脏毒性,这些疗法已被证实与心脏功能障碍相关14。此外,该模型在推动再生医学发展方面具有重要意义,可通过测试生物材料、生物墨水及基于细胞的治疗方法,促进心肌功能改善和心肌梗死等疾病状态下的心肌组织修复。
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本研究中所用试剂和设备的详细信息见材料表。
1. 培养基与试剂准备
2. 人iPSC的培养与传代
注意: 本文所报告的实验步骤已在多种hiPSC细胞系中实施,包括UCSFi001-A(男性,由David J. Gladstone研究所Bruce Conklin教授惠赠)、ESi044-A(男性)、ESi007-A(女性)和ESi044-C(女性)健康细胞系,以及ESi107-A(女性心脏淀粉样变病患者来源的疾病细胞系),仅对hiPSC培养基、传代稀释比例和CHIR浓度进行了微小调整。本方案中的细节内容以UCSFi001-A细胞系的使用为例进行说明。本方案中所有细胞培养孵育步骤均在37 °C、5% CO2 和96%湿度条件下进行。
3. 人心肌细胞分化
注意:人诱导多能干细胞(hiPSC)向心肌细胞(hiPSC-CMs)的分化采用的是Lian等人3,15以及Burridge等人4所使用的单层分化方法。在适当维持条件下,hiPSC可连续进行超过30次传代并保持高效分化能力。若出现自发分化,或连续四次以上分化失败,则提示细胞状态异常。建议定期进行常规检测,包括支原体检测。
4. 人心脏成纤维细胞分化
注意:为从人诱导多能干细胞(hiPSCs)获得人诱导多能干细胞来源的心脏成纤维细胞(hiPSC-CFs),以下方案基于Zhang等16所采用的两阶段方法。第一步是在心源性中胚层诱导后,通过重新激活Wnt信号通路获得心外膜细胞(hiPSC-EpiCs)。随后,将hiPSC-EpiCs暴露于血管发育抑制剂和FGF2中,18天内即可获得心脏成纤维细胞。
5. 熔融电纺直写(MEW)支架的制备
注意:本实验方案使用医用级聚ε-己内酯(PCL)均聚物,通过昆士兰科技大学(QUT)专门为此设计的熔融电纺丝(MEW)打印机来制备纤维支架10。
6. 纤维蛋白微型组织的生成与维持
注意:人源心肌三维微组织的制备依赖于将hiPSC来源的心脏细胞包埋于纤维蛋白水凝胶中,并结合微尺度电纺丝(MEW)支架以提供纤维状支撑。以下实验方案改编自Breckwoldt等17和Ronaldson-Bouchard等18所采用的工程化设计方法。
7. hiPSC 心脏分化潜能及微型组织功能的系统性分析
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二维 hiPSC 来源心肌细胞的表征
为了生成多表型的心脏组织,hiPSC-CMs 和 hiPSC-CFs 被独立地进行体外分化和表征。in vitro。通过适当的优化和严格的操作维护,本方案在分化第 9 天可获得超过 80% 的 hiPSC-CMs,形成自发搏动的细胞(图 1A)。此外,通过代谢筛选进行纯化富集,可基本消除非 hiPSC-CMs,使得在第 21 天时培养物中超过 90% 的细胞表达心肌肌钙蛋白(cTNT+)(图 1B)。这些具有强搏动能力的单层细胞通过免疫荧光染色显示表达收缩性肌节蛋白 α-辅肌动蛋白(ACTN)(图 1C,D)。
另一方面,该方案的成功依赖于通过中间心外膜状态的诱导来生成心脏特异性成纤维细胞。在此过程中,使用CHIR重新激活Wnt信号通路后,可在第8天从心...
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为了构建能够模拟人心肌天然特性的三维复合心脏微组织模型,必须考虑若干关键因素。这些因素可归纳为三个主要方面:(1)优化用于组织构建的细胞产量与纯度;(2)打印纤维状支架以模拟三维力学微环境;(3)在构建过程中整合纤维蛋白水凝胶。
确保分化过程成功的一些关键步骤包括:通过防止细胞融合度超过90%来维持hiPSCs的多能性特征;在传代时优化hiPSC的稀释比例,以在CM或CF分化开始时达到适当的融合度;并针对每种细胞系精细调整CHIR的浓度,以确保高效的中胚层诱导4,15。必须确保细胞培养物纯度超过90%,并能够分别生成不同类型的心脏细胞。这有助于形成功能性组织,使每种细胞类型的特定功能得以充分研究,尤其是在用于疾病建模或药理学测试时。为维持高水平的细胞纯度,必须严格在葡萄糖限制性培养基中进行心肌细胞的代谢筛选。另一方面,在获取健康的心脏成纤维细胞时,利用TGF-β通路调控其表型并促使其转化为肌成纤维细胞的能力,为模拟心肌纤维化等病理状态提供了可能,相关内容已在其他文献...
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本研究由H2020研究与创新计划资助,资助协议编号为874827(BRAV
);西班牙科学与大学部通过以下项目提供资助:PLEC2021-008127(CARDIOPRINT)、PID2022-142562OB-I00(VOLVAD)和PID2022-142807OA-I00(INVESTTRA),上述项目由MICIU/AEI /10.13039/501100011033以及欧洲联盟NextGenerationEU/PRTR资助;纳瓦拉政府战略项目IMPRIMED(0011-1411-2021-000096)和BIOHEART(0011-1411-2022-000071);纳瓦拉政府合作项目BIOGEN(PC020-021-022)以及纳瓦拉政府卫生项目GN32/2023。图1A、图2A和图4A使用BioRender.com制作。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| µ-Slide 8 孔腔室载玻片(IbiTreat) | IBIDI | 80826 | |
| 0.1% 明胶溶液(Embryomax) | Merck Millipore | ES-006-B | |
| 10% 甲醛 | Sigma Aldrich | HT501128 | |
| 12 孔板 | Costar/Corning | 3513 | |
| 6 孔板 | Costar/Corning | 3506 | |
| 高级 DMEM 1x(ADMEM) | Gibco | 12491015 | |
| 牛肺来源抑肽酶 | Sigma Aldrich | A1153 | |
| B-27 补充剂,含胰岛素(50x) | Life Technologies | A317504044 | |
| B27 补充剂,不含胰岛素(50x) | Life Technologies | A1895601 | |
| 活检打孔器(6 mm 直径) | Medical | BP-60F | |
| 牛血清白蛋白(BSA) | Sigma Aldrich | A9647 | |
| CHIR-99021 | AXON MEDCHEM | AXON1386 | |
| 共聚焦激光扫描显微镜 | Zeiss | LSM 800 | |
| 培养瓶 175 cm² | Greiner Bio-One | 660175 | |
| 培养瓶 75 cm² | Falcon | 353136 | |
| 流式细胞仪 | Beckman Coulter | CytoFlex | |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | |
| 驴抗小鼠 IgG(H+L)高交叉吸附二抗,Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-21202 | |
| 驴抗兔 IgG(H+L)高交叉吸附二抗,Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A-21207 | |
| DPBS(无 Mg²⁺、Ca²⁺) | Gibco | A314190094 | |
| EDTA 0.5 M,pH 8.0 | Life Technologies | AM9260G | |
| ESSENTIAL 8 培养基试剂盒 | Life Technologies | A1517001 | |
| FGF2(重组人碱性 FGF 154 个氨基酸) | Peprotech | 100-18B | |
| 牛血浆来源纤维蛋白原 | Sigma Aldrich | F8630 | |
| 成纤维细胞生长培养基 3 试剂盒(FGM3) | PromoCell | C-23130 | |
| 无血清替代物(KSR) | Life Technologies | 10828028 | |
| 乳酸钠(L-乳酸钠) | Sigma Aldrich | 71718 | |
| 生长因子减少型 Matrigel(MGFR)基底膜基质,无 LDEV | Corning | 354230 | |
| MEW 23-G 针头 | Nordson | 7018302 | |
| MEW 打印机 | QUT,昆士兰科技大学 | ||
| MEW 注射器 | Nordson | 7012072 | |
| 小鼠抗心肌肌钙蛋白 T 单克隆抗体 | Invitrogen | MA5-12960 | |
| 小鼠抗 DDR2 单克隆抗体 | Sigma Aldrich | SAB5300116 | |
| 小鼠抗α-肌动蛋白(肌节型)单克隆抗体 | Sigma Aldrich | A7811 | |
| 青霉素-链霉素 | Life Technologies | 15140122 | |
| 聚ε-己内酯(PCL),医用级 | Corbion | PURASORB® PC 12 | |
| 兔抗波形蛋白重组单克隆抗体 [EPR3776] - 细胞骨架标志物 | Abcam | Ab29547 | |
| 视黄酸 | Sigma Aldrich | R2625 | |
| ROCK 抑制剂 Y-27632(10 mg) | Fisher Scientific | HB2297 | |
| RPMI 1640(含 L-谷氨酰胺) | Gibco | 21875034 | |
| RPMI 1640(无酚红) | Gibco | 32404014 | |
| RPMI 无葡萄糖 | Gibco | 11879020 | |
| SB431542 | SELLECK CHEMICALS | S1067 | |
| 分光光度计 | BMG Labtech | SPECTROstar Nano | |
| 凝血酶(人 α 凝血酶,凝血因子 IIa) | Enzyme Research Lab | HT 1002a | |
| 吐温 X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| TrypLE Express | Life Technologies | 12604021 | |
| 吐温 20 | Sigma Aldrich | P2287 | |
| Wnt-C59 | AXON MEDCHEM | AXON2287 |
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