方法文章

利用聚己内酯支架的熔融静电纺丝书写技术与人诱导多能干细胞来源的心脏细胞生成三维人心肌组织

DOI：

10.3791/67847

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2025年3月28日

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1Biomedical Engineering Program, Enabling Technologies Division, CIMA Universidad de Navarra, and Instituto de Investigación Sanitaria de Navarra (IdiSNA), 2Department of Cardiology, Clínica Universidad de Navarra and Instituto de Investigación Sanitaria de Navarra (IdiSNA), 3Hematology and Cell Therapy Area, Clínica Universidad de Navarra and Instituto de Investigación Sanitaria de Navarra (IdiSNA), 4Centro de Investigación Biomédica en Red de Cáncer (CIBERONC) CB16/12/00489, 5Hemato-Oncology Program, Cancer Division, CIMA Universidad de Navarra

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文介绍了一种可重复的方法，通过结合熔融电纺写入（MEW）法制备的聚己内酯（PCL）支架、纤维蛋白水凝胶以及人诱导多能干细胞来源的心肌细胞和成纤维细胞，生成三维心肌组织。该技术可精确控制支架结构，适用于临床前药物筛选和心脏疾病建模。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

功能性人类心肌组织的开发在药物筛选、疾病建模和再生医学的应用方面具有重要意义。本方案描述了一种逐步构建三维心肌组织的方法，通过将熔融电纺写入（melt electrospinning writing, MEW）技术制备的聚己内酯（polycaprolactone, PCL）支架与纤维蛋白水凝胶及人诱导多能干细胞（hiPSC）来源的心脏细胞相结合，实现对天然心肌结构的高度模拟。该过程包括将心肌细胞（hiPSC-CMs）与心脏成纤维细胞（hiPSC-CFs）混合后包埋于纤维蛋白基质中，形成微型组织，并由MEW生成的支架提供结构支撑。这些纤维状支架在微米至纳米尺度上构建，可精确调控纤维结构，从而在细胞分布与取向排列中发挥关键作用。同时，纤维蛋白基质有助于维持细胞活力并模拟细胞外环境。对所生成组织的表征显示，hiPSC-CMs中形成了结构良好的肌节，并表现出稳定的收缩活性。组织在接种后最早两天即出现持续的自发搏动，且功能可长期维持。hiPSC-CFs与hiPSC-CMs的共培养增强了组织的结构完整性，同时支持细胞的长期存活。该方法提供了一种可重复、可调节且可放大的生物模拟心脏组织构建策略，为临床前药物测试、心脏疾病的机制研究以及潜在的再生治疗提供了多功能平台。

引言

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构建功能性人类心脏工程组织在高影响力应用方面具有广阔前景，其应用范围涵盖药物心脏毒性与人类心脏疾病模型的开发，以及具有相关尺寸的治疗性组织的生成1。尽管过去15年中该领域已取得显著进展，但目前构建高度仿生的人类心肌仍受限于难以重现天然心肌复杂的结构与力学组织特性2。

在生物学方面，革命性的细胞重编程技术为开发患者特异性的治疗细胞提供了可能。目前，在个体化背景下，人诱导性多能干细胞（hiPSCs）是获取人心肌细胞的唯一来源。通过稳健的分化方案，可获得高产量的心肌细胞3,4。一个关键问题是细胞的成熟度，因为目前在常规二维（2D）分化条件下使用的人hiPSC来源心肌细胞（hiPSC-CMs）表现出未成熟的表型5。这一问题与心脏组织复杂的结构构象密切相关，后者与常规的二维培养体系完全不同。此外，心肌组织由多种心血管细胞有序组成，包括心脏成纤维细胞、平滑肌细胞和内皮细胞等非肌细胞，这些细胞通过特定的三维（3D）结构排列，实现高效的血液泵送功能6,7。因此，需要构建包含所有主要细胞类型的高结构化人源心脏微组织，以生....

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方案

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本研究中所用试剂和设备的详细信息见材料表。

1. 培养基与试剂准备

  1. 细胞培养板的预包被
    1. 准备生长因子减少型基质胶（MGFr）储备液。将一管MGFr在冰箱中置于冰上过夜解冻。在无菌操作台中，使用预冷的枪头，并始终将储备液和离心管置于冰上，用冷的含L-谷氨酰胺的RPMI 1640培养基（RPMI）按1:1比例稀释，分装成合适体积的 aliquot。
      注意：在hiPSC培养以及hiPSC来源的心肌细胞（hiPSC-CMs）接种过程中，使用不同稀释比例的MGFr。hiPSC所用MGFr包被稀释度因具体细胞系而异；但一旦进入心肌细胞阶段，无论细胞系如何，均使用1:80的稀释比例。
    2. 包被细胞培养板时，将所需数量的MGFr aliquot在冰上缓慢解冻，再用冷RPMI进一步稀释：hiPSC培养使用1:180稀释（100 µL MGFr加入9 mL RPMI），hiPSC-CMs重接种使用1:80稀释（100 µL MGFr加入4 mL RPMI）。
      1. 立即向6孔板每孔加入1 mL稀释后的MGFr（用于hiPSC维持），或向12孔板每孔加入0.5 mL（用于hiPSC-CMs重接种）。包被后的培养板于4 °C保存备用，可保存至多1周。
        注意：MGFr包被的培养板在接种细胞前需在37 °C预热30分....

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结果

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二维 hiPSC 来源心肌细胞的表征
为了生成多表型的心脏组织，hiPSC-CMs 和 hiPSC-CFs 被独立地进行体外分化和表征。in vitro。通过适当的优化和严格的操作维护，本方案在分化第 9 天可获得超过 80% 的 hiPSC-CMs，形成自发搏动的细胞（图 1A）。此外，通过代谢筛选进行纯化富集，可基本消除非 hiPSC-CMs，使得在第 21 天时培养物中超过 90% 的细胞表达心肌肌钙蛋白（cTNT+）（图 1B）。这些具有强搏动能力的单层细胞通过免疫荧光染色显示表达收缩性肌节蛋白 α-辅肌动蛋白（ACTN）（图 1C，D）。

另一方面，该方案的成功依赖于通过中间心外膜状态的诱导来生成心脏特异性成纤维细胞。在此过程中，使用CHIR重新激活Wnt信号通路后，可在第8天从心.......

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讨论

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为了构建能够模拟人心肌天然特性的三维复合心脏微组织模型，必须考虑若干关键因素。这些因素可归纳为三个主要方面：（1）优化用于组织构建的细胞产量与纯度；（2）打印纤维状支架以模拟三维力学微环境；（3）在构建过程中整合纤维蛋白水凝胶。

确保分化过程成功的一些关键步骤包括：通过防止细胞融合度超过90%来维持hiPSCs的多能性特征；在传代时优化hiPSC的稀释比例，以在CM或CF分化开始时达到适当的融合度；并针对每种细胞系精细调整CHIR的浓度，以确保高效的中胚层诱导4,15。必须确保细胞培养物纯度超过90%，并能够分别生成不同类型的心脏细胞。这有助于形成功能性组织，使每种细胞类型的特定功能得以充分研究，尤其是在用于疾病建模或药理学测试时。为维持高水平的细胞纯度，必须严格在葡萄糖限制性培养基中进行心肌细胞的代谢筛选。另一方面，在获取健康的心脏成纤维细胞时，利用TGF-β通路调控其表型并促使其转化为肌成纤维细胞的能力，为模拟心肌纤维化等病理状态提供了可能，相关内容已在其他文献.......

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致谢

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本研究由H2020研究与创新计划资助，资助协议编号为874827（BRAVfigure-acknowledgements-1）；西班牙科学与大学部通过以下项目提供资助：PLEC2021-008127（CARDIOPRINT）、PID2022-142562OB-I00（VOLVAD）和PID2022-142807OA-I00（INVESTTRA），上述项目由MICIU/AEI /10.13039/501100011033以及欧洲联盟NextGenerationEU/PRTR资助；纳瓦拉政府战略项目IMPRIMED（0011-1411-2021-000096）和BIOHEART（0011-1411-2022-000071）；纳瓦拉政府合作项目BIOGEN（PC020-021-022）以及纳瓦拉政府卫生项目GN32/2023。图1A、图2A和图4A使用BioRender.com制作。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
µ-Slide 8 孔腔室载玻片（IbiTreat）IBIDI80826
0.1% 明胶溶液（Embryomax）Merck MilliporeES-006-B
10% 甲醛Sigma AldrichHT501128
12 孔板Costar/Corning3513
6 孔板Costar/Corning3506
高级 DMEM 1x（ADMEM）Gibco12491015
牛肺来源抑肽酶Sigma AldrichA1153
B-27 补充剂，含胰岛素（50x） Life TechnologiesA317504044
B27 补充剂，不含胰岛素（50x）Life TechnologiesA1895601
活检打孔器（6 mm 直径）MedicalBP-60F
牛血清白蛋白（BSA）Sigma AldrichA9647
CHIR-99021 AXON MEDCHEMAXON1386
共聚焦激光扫描显微镜ZeissLSM 800
培养瓶 175 cm²Greiner Bio-One660175
培养瓶 75 cm²Falcon353136
流式细胞仪Beckman CoulterCytoFlex 
DAPI Sigma AldrichD9542
驴抗小鼠 IgG（H+L）高交叉吸附二抗，Alexa Fluor 488InvitrogenA-21202 
驴抗兔 IgG（H+L）高交叉吸附二抗，Alexa Fluor 594InvitrogenA-21207 
DPBS（无 Mg²⁺、Ca²⁺）GibcoA314190094
EDTA 0.5 M，pH 8.0Life TechnologiesAM9260G
ESSENTIAL 8 培养基试剂盒Life TechnologiesA1517001
FGF2（重组人碱性 FGF 154 个氨基酸）Peprotech100-18B
牛血浆来源纤维蛋白原Sigma AldrichF8630
成纤维细胞生长培养基 3 试剂盒（FGM3）PromoCellC-23130
无血清替代物（KSR）Life Technologies10828028
乳酸钠（L-乳酸钠）Sigma Aldrich71718
生长因子减少型 Matrigel（MGFR）基底膜基质，无 LDEVCorning354230
MEW 23-G 针头Nordson7018302
MEW 打印机QUT，昆士兰科技大学
MEW 注射器Nordson7012072
小鼠抗心肌肌钙蛋白 T 单克隆抗体InvitrogenMA5-12960 
小鼠抗 DDR2 单克隆抗体Sigma AldrichSAB5300116
小鼠抗α-肌动蛋白（肌节型）单克隆抗体Sigma AldrichA7811 
青霉素-链霉素Life Technologies15140122
聚ε-己内酯（PCL），医用级CorbionPURASORB® PC 12
兔抗波形蛋白重组单克隆抗体 [EPR3776] - 细胞骨架标志物AbcamAb29547 
视黄酸 Sigma AldrichR2625
ROCK 抑制剂 Y-27632（10 mg）Fisher ScientificHB2297
RPMI 1640（含 L-谷氨酰胺）Gibco21875034
RPMI 1640（无酚红）Gibco32404014
RPMI 无葡萄糖Gibco11879020
SB431542SELLECK CHEMICALSS1067
分光光度计 BMG Labtech SPECTROstar Nano
凝血酶（人 α 凝血酶，凝血因子 IIa）Enzyme Research LabHT 1002a
吐温 X-100Sigma AldrichT8787
TrypLE ExpressLife Technologies12604021
吐温 20Sigma AldrichP2287
Wnt-C59AXON MEDCHEMAXON2287

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cho, S., et al. Challenges and opportunities for the next generation of cardiovascular tissue engineering. Nat Methods. 19 (9), 1064-1071 (2022).
  2. Garbern, J. C., Lee, R. T. Heart regeneration: 20 years of progress and renewed optimism. Dev Cell.

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