利用聚己内酯支架的熔融静电纺丝书写技术与人诱导多能干细胞来源的心脏细胞生成三维人心肌组织

摘要

本文介绍了一种可重复的方法，通过结合熔融电纺写入（MEW）法制备的聚己内酯（PCL）支架、纤维蛋白水凝胶以及人诱导多能干细胞来源的心肌细胞和成纤维细胞，生成三维心肌组织。该技术可精确控制支架结构，适用于临床前药物筛选和心脏疾病建模。

摘要

功能性人类心肌组织的开发在药物筛选、疾病建模和再生医学的应用方面具有重要意义。本方案描述了一种逐步构建三维心肌组织的方法，通过将熔融电纺写入（melt electrospinning writing, MEW）技术制备的聚己内酯（polycaprolactone, PCL）支架与纤维蛋白水凝胶及人诱导多能干细胞（hiPSC）来源的心脏细胞相结合，实现对天然心肌结构的高度模拟。该过程包括将心肌细胞（hiPSC-CMs）与心脏成纤维细胞（hiPSC-CFs）混合后包埋于纤维蛋白基质中，形成微型组织，并由MEW生成的支架提供结构支撑。这些纤维状支架在微米至纳米尺度上构建，可精确调控纤维结构，从而在细胞分布与取向排列中发挥关键作用。同时，纤维蛋白基质有助于维持细胞活力并模拟细胞外环境。对所生成组织的表征显示，hiPSC-CMs中形成了结构良好的肌节，并表现出稳定的收缩活性。组织在接种后最早两天即出现持续的自发搏动，且功能可长期维持。hiPSC-CFs与hiPSC-CMs的共培养增强了组织的结构完整性，同时支持细胞的长期存活。该方法提供了一种可重复、可调节且可放大的生物模拟心脏组织构建策略，为临床前药物测试、心脏疾病的机制研究以及潜在的再生治疗提供了多功能平台。

引言

构建功能性人类心脏工程组织在高影响力应用方面具有广阔前景，其应用范围涵盖药物心脏毒性与人类心脏疾病模型的开发，以及具有相关尺寸的治疗性组织的生成¹。尽管过去15年中该领域已取得显著进展，但目前构建高度仿生的人类心肌仍受限于难以重现天然心肌复杂的结构与力学组织特性²。

在生物学方面，革命性的细胞重编程技术为开发患者特异性的治疗细胞提供了可能。目前，在个体化背景下，人诱导性多能干细胞（hiPSCs）是获取人心肌细胞的唯一来源。通过稳健的分化方案，可获得高产量的心肌细胞^3,4。一个关键问题是细胞的成熟度，因为目前在常规二维（2D）分化条件下使用的人hiPSC来源心肌细胞（hiPSC-CMs）表现出未成熟的表型⁵。这一问题与心脏组织复杂的结构构象密切相关，后者与常规的二维培养体系完全不同。此外，心肌组织由多种心血管细胞有序组成，包括心脏成纤维细胞、平滑肌细胞和内皮细胞等非肌细胞，这些细胞通过特定的三维（3D）结构排列，实现高效的血液泵送功能^6,7。因此，需要构建包含所有主要细胞类型的高结构化人源心脏微组织，以生成具有生理相关性的仿生组织。

采用新型生物制造方法有望打破这一僵局。其中，熔融静电纺丝书写技术（melt electrospinning writing, MEW）作为一种先进的3D打印技术，能够实现高精度和高分辨率。在MEW中，利用电场将熔融聚合物以纤维形式沉积，纤维尺寸与细胞尺寸相当，比传统的熔融沉积成型（fused deposition modeling, FDM）3D打印小一个数量级，从而形成高度有序的支架结构^8,9。研究表明，MEW能够将复杂的in silico设计转化为实际打印的基质，并在三维空间中调控物理特性以匹配心肌组织的特性¹⁰。利用MEW技术，可以打印出具有不同形状和结构的聚合物网格，结合柔软且利于细胞生长的水凝胶，构建出模拟天然成年心肌组织微观与宏观力学环境的复合组织^11,12。研究已证实，改变MEW 3D支架的设计可影响其最终功能（如钙瞬变）¹⁰，这为理解这一有前景的3D工程化系统中的结构-功能关系奠定了基础。

本文提供了一种详细的实验方案，用于利用人诱导多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CMs）和人诱导多能干细胞来源的心脏成纤维细胞（hiPSC-CFs）构建具有收缩功能的人类心脏微组织，并将其与通过熔融电写技术（3D MEW）打印的三维结构增强的纤维蛋白水凝胶相结合。在多种三维工程化系统中，添加成纤维细胞已被广泛用于提高hiPSC-CMs的存活率并维持组织结构，但其在3D-MEW系统中的应用尚未被探索¹³。本文所述技术为研究人员提供了一个多功能平台，可用于构建精确的心脏组织模型，应用于疾病机制研究、临床前毒理学评估和药物筛选等领域。该模型适用于评估已知药物（如蒽环类药物（例如多柔比星）、酪氨酸激酶抑制剂）以及新兴疗法（如嵌合抗原受体T（CAR-T）细胞）引起的心脏毒性，这些疗法已被证实与心脏功能障碍相关¹⁴。此外，该模型在推动再生医学发展方面具有重要意义，可通过测试生物材料、生物墨水及基于细胞的治疗方法，促进心肌功能改善和心肌梗死等疾病状态下的心肌组织修复。

方案

本研究中所用试剂和设备的详细信息见材料表。

1. 培养基与试剂准备

1. 细胞培养板的预包被
   1. 准备生长因子减少型基质胶（MGFr）储备液。将一管MGFr在冰箱中置于冰上过夜解冻。在无菌操作台中，使用预冷的枪头，并始终将储备液和离心管置于冰上，用冷的含L-谷氨酰胺的RPMI 1640培养基（RPMI）按1:1比例稀释，分装成合适体积的 aliquot。
      注意：在hiPSC培养以及hiPSC来源的心肌细胞（hiPSC-CMs）接种过程中，使用不同稀释比例的MGFr。hiPSC所用MGFr包被稀释度因具体细胞系而异；但一旦进入心肌细胞阶段，无论细胞系如何，均使用1:80的稀释比例。
   2. 包被细胞培养板时，将所需数量的MGFr aliquot在冰上缓慢解冻，再用冷RPMI进一步稀释：hiPSC培养使用1:180稀释（100 µL MGFr加入9 mL RPMI），hiPSC-CMs重接种使用1:80稀释（100 µL MGFr加入4 mL RPMI）。
      1. 立即向6孔板每孔加入1 mL稀释后的MGFr（用于hiPSC维持），或向12孔板每孔加入0.5 mL（用于hiPSC-CMs重接种）。包被后的培养板于4 °C保存备用，可保存至多1周。
         注意：MGFr包被的培养板在接种细胞前需在37 °C预热30分钟。接种前应吸除包被板中的液体。
   3. 对于hiPSC来源的成纤维细胞（hiPSC-CFs）培养，使用0.1%明胶对T75或T175培养瓶进行包被，室温（RT）孵育至少15分钟，T75加5 mL，T175加10 mL。孵育后，在接种细胞前吸除液体。
2. 细胞培养基
   1. hiPSC培养使用完全Essential 8培养基（E8培养基），即将Essential 8添加剂（50倍浓度）加入Essential 8基础培养基中配制而成。
   2. 心肌细胞分化时准备以下培养基：
      1. 不含胰岛素的RPMI/B27培养基（-INS培养基）：将500 mL RPMI与10 mL不含胰岛素的B27添加剂混合；RPMI/B27培养基（B27培养基）：将500 mL RPMI与10 mL B27添加剂混合。
   3. 心肌细胞纯化（乳酸培养基）：将2 mL 1 M乳酸加入500 mL无葡萄糖RPMI 1640培养基中。该培养基可在4 °C保存至多1个月。
   4. 心肌细胞重接种（重接种培养基）：在B27培养基中添加10% Knock-out血清替代物（KSR）和10 µM Y27。
      注意：KSR是一种成分明确、无血清的配方，可替代ESC和iPSC培养方案中的FBS。
   5. 成纤维细胞分化与维持（第11天起）：按制造商说明配制完整的成纤维细胞生长培养基3（FGM3），即将其添加剂套装（0.1 mL/mL胎牛血清、5 µg/mL重组人胰岛素和1 ng/mL人碱性成纤维细胞生长因子FGF2）加入FGM3基础培养基中。
      注意：为促进成纤维细胞增殖，建议将FGF2浓度提高至10 ng/mL。
   6. 用于三维心脏组织生成与维持的培养基：
      1. 组织生成培养基：在B27培养基中添加1%青霉素/链霉素（P/S）、10% KSR和10 µM Y27。组织维持培养基：在B27培养基中添加1% P/S和抑肽酶（0.1% (wt/vol)；33 µg/mL）。
         注意：抑肽酶有助于维持培养期间纤维蛋白凝胶的完整性，防止其降解，从而将细胞保留在水凝胶内。因此，强烈建议在组织生成当天将抑肽酶加入培养基中。
3. 小分子与生长因子储备液
   1. CHIR-99021（CHIR）：作为GSK3抑制剂和Wnt信号通路激活剂，用DMSO配制成10 mM储备液。分装后于-20 °C保存，可保存至多6个月。
      注意：不同hiPSC细胞系对CHIR处理的反应可能不同，可能需要优化CHIR浓度。建议测试6–10 µM的CHIR浓度。
   2. C59（Wnt抑制剂）：用DMSO配制成10 mM储备液。分装后于-20 °C保存，可保存至多6个月。
   3. Y-27632（ROCK抑制剂，Y27）：用DMSO配制成10 mM储备液。分装后于-20 °C保存，可保存至多1个月。最终使用浓度取决于目标细胞类型：hiPSC使用2 µM（1/5000），hiPSC-CMs、hiPSC-CFs及组织生成使用10 µM（1/1000）。
      注意：Y27可通过抑制细胞解离悬浮过程中的细胞死亡来促进细胞存活。收获细胞时应使用Y27以避免过度细胞死亡。
   4. 视黄酸：用氯仿配制成30 mM储备液。分装后于-20 °C保存，可保存至多2年。
   5. FGF2（重组人成纤维细胞生长因子，亦称FGF-b，可促进成纤维细胞增殖）：用无菌水配制成50 µg/mL储备液。分装后于-20 °C保存，可保存至多6个月。
   6. SB431542（SB，TGFß1信号通路抑制剂）：用DMSO配制成10 mM储备液。分装后于-20 °C保存，可保存至多6个月。
      注意：在二维培养中，将其加入成纤维细胞培养基中可维持CFs状态，并防止向肌成纤维细胞（纤维化过程中出现的病理表型）转化。
4. 纤维蛋白水凝胶储备液
   1. 纤维蛋白原：配制成200 mg/mL储备液。首先在细胞操作台内使用无菌工具将纤维蛋白原块研磨成细粉，加入温热的0.9% (wt/vol) NaCl溶液，并在37 °C下孵育至完全溶解。分装后可于-80 °C保存一年，或于4 °C保存一周。
      注意：由于其在4 °C时黏度较高，建议在组织生成步骤前将其解冻并在室温下放置一段时间，以便准确移液。若某一分装样品再次使用时难以移液，建议弃用并启用新的分装样品。
   2. 凝血酶：用无菌的60% PBS + 40%水溶解凝血酶，配制成100 U/mL储备液。分装后可于-20 °C保存一年，或于4 °C保存六个月。
      注意：使用前应解冻并置于冰上，直至完成组织生成步骤。
   3. 抑肽酶：将抑肽酶溶于无菌水中，配制成33 mg/mL储备液（100 mg粉末溶于3.04 mL水中）。分装后于-20 °C保存，可保存至多一年。
5. 分析用溶液
   1. FACS缓冲液（细胞流式分析）：配制不含Mg²⁺和Ca²⁺的PBS溶液，并添加2.5 mM EDTA和5% (v/v) FBS。

2. 人iPSC的培养与传代

注意： 本文所报告的实验步骤已在多种hiPSC细胞系中实施，包括UCSFi001-A（男性，由David J. Gladstone研究所Bruce Conklin教授惠赠）、ESi044-A（男性）、ESi007-A（女性）和ESi044-C（女性）健康细胞系，以及ESi107-A（女性心脏淀粉样变病患者来源的疾病细胞系），仅对hiPSC培养基、传代稀释比例和CHIR浓度进行了微小调整。本方案中的细节内容以UCSFi001-A细胞系的使用为例进行说明。本方案中所有细胞培养孵育步骤均在37 °C、5% CO₂ 和96%湿度条件下进行。

1. 将hiPSC细胞系培养于经1:180 MGFr预包被的6孔板中，使用E8培养基维持其多能性。
   注意：为防止细胞自发分化，必须避免细胞过度生长。因此，当细胞融合度达到80%-90%时，应及时进行hiPSC传代。
2. 进行细胞传代时，吸除旧培养基，每孔用1 mL PBS（无Mg²⁺和Ca²⁺）稀释的0.5 mM EDTA溶液洗涤两次，随后在室温下用EDTA/PBS孵育7分钟，以破坏细胞间黏附。
3. 吸除EDTA/PBS溶液，加入1 mL E8培养基，使用1000 µL移液器在孔表面反复吹打，使细胞脱离，收集至无菌离心管中。
   注意：吹打次数应控制在10-15次以内，以免增加hiPSC死亡率。
4. 取上述细胞悬液进行1:15至1:20稀释，接种于MGF包被的6孔板中，培养基为含2 µM Y27的E8培养基。Y27仅在接种后前24小时使用，以避免长期暴露引起的毒性。
   注意：针对其他hiPSC细胞系，应调整传代比例，以维持细胞未分化状态及良好形态达4-5天。
5. 24小时后，吸除旧培养基，加入足量的新鲜室温E8培养基（通常为3-4 mL），可维持两天。此后每天更换培养基，持续3-4天。
   注意：传代频率因细胞系而异，应避免细胞融合度达到100%。hiPSC应形成大而扁平、致密的多边形克隆，边缘光滑，核质比高。

3. 人心肌细胞分化

注意：人诱导多能干细胞（hiPSC）向心肌细胞（hiPSC-CMs）的分化采用的是Lian等人^3,15以及Burridge等人⁴所使用的单层分化方法。在适当维持条件下，hiPSC可连续进行超过30次传代并保持高效分化能力。若出现自发分化，或连续四次以上分化失败，则提示细胞状态异常。建议定期进行常规检测，包括支原体检测。

1. 为启动心肌分化，按照上述细胞传代步骤（步骤2）收获汇合度为80%–90%的hiPSCs。将细胞接种于MGFr包被的1:180稀释的12孔板中，调整传代稀释比例，使接种后48–72小时细胞达到90%汇合度的紧密单层。对于该细胞系，采用1:10稀释比例，细胞将在72小时达到完全汇合。每日更换E8培养基。
   注意：本实验方案中，稀释操作按体积进行调整，而非按细胞数量，以避免因操作者差异导致的变异性。若在接种后72小时内未达到单层细胞状态，则分化过程极有可能失败。在此情况下，建议放弃本次尝试并重新开始，确保传代效率处于最佳状态。
2. 当单层细胞稳定后，分化过程开始，此后视为第0天。随后将培养基更换为添加了8 µM CHIR（Wnt信号通路激活剂）的-INS培养基，每孔加入1 mL，于37 °C孵育24小时。
   注意：针对每种iPSC细胞系，需将CHIR浓度在6–12 µM范围内进行滴定，以实现高效的中胚层诱导。在此步骤中，预期会出现较高水平的细胞死亡，这是过程优化的标志。
3. 第1天：次日，吸除每孔中的培养基，用不含补充物的RPMI培养基洗涤细胞（每孔0.5 mL）。随后加入1.5 mL新鲜的-INS培养基，将细胞继续培养2天。
   注意：在更换所有培养基的过程中均需进行洗涤步骤，以去除碎片、死细胞及补充剂残留物。
4. 第3天：为诱导心肌细胞谱系特化，将培养基更换为1.5 mL添加5 µM Wnt抑制剂C59的-INS培养基，作用48小时。
   注意：在此步骤中，GSK3复合物形成，β-catenin被降解，从而促进心肌中胚层谱系的分化。此步骤后也可观察到部分细胞死亡。
5. 第5天：用新鲜的-INS培养基以每孔1.5 mL的体积替换，孵育48小时，以促进心脏前体细胞的扩增。
6. 第7天：从本日起，细胞在B27培养基中维持培养，每2-3天更换一次培养基。
   注意：当细胞达到此状态后，可将每孔培养基体积调整为2.5 mL，以避免周末更换培养基，但仅可进行一次此类调整。通常情况下，人诱导多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CMs）在第7–9天开始出现自发性搏动。最初可见孤立且无规律的搏动细胞簇，但在数日内，高纯度的培养物应形成同步搏动的均一单层细胞。
7. 获得这些收缩性单层细胞后（通常在第10天），需进行代谢筛选处理，包括在乳酸培养基中孵育两个循环，每个循环72小时，中间穿插一次重新接种步骤，以清除非心肌细胞并提高培养物的纯度。
8. 第10天，第一次纯化步骤（1^st 乳酸盐）：用乳酸盐培养基（每孔0.5 mL）洗涤跳动的细胞，随后每孔加入1 mL乳酸盐培养基，孵育72 h。
   注意：洗涤步骤必须使用乳酸盐培养基或基础无葡萄糖的RPMI 1640培养基，以彻底清除前一步葡萄糖培养基（B27）的所有残留。
9. 第13天：用B27培养基每孔1.5 mL洗涤细胞，并让细胞从第一轮纯化中恢复2天。
10. 第15天（重铺板步骤）：在两轮纯化之间，用EDTA/PBS洗涤单层细胞，并加入TrypLE在37 °C孵育10分钟（每孔0.5 mL），使其解离。
    注意：孵育时间取决于每种细胞系。
11. 使用1000 µL移液器吹打悬浮细胞，并用每孔0.5 mL添加10% KSR（v/v）的B27培养基将细胞收集至无菌离心管中。
    注意：心肌细胞对剪切应力和剧烈吹打敏感，因此应尽量避免反复吹打。为降低损伤，人诱导多能干细胞来源心肌细胞（hiPSC-CM）的解离还可选用 TrypLE 10x 或胶原酶联合 DNase 处理。需优化孵育时间，以确保细胞充分脱离，同时避免细胞损伤或因过度吹打而影响细胞完整性。
12. 离心10分钟，100 x g g 在室温下重铺至经1:80 MGFr包被的12孔板中，每孔加入1 mL重铺培养基。每孔接种1 mL细胞悬液。
    注意：这将去除分化过程中产生的过量死细胞和沉积的基质，因为这些成分可能对后续的组织生成产生不利影响。
13. 第16天：重铺板24小时后，去除Y27和KSR，将细胞继续培养于B27培养基中，直至下一步纯化（通常为48–72小时）。
14. 第18天：第二次纯化步骤（2^nd 乳酸。与第一个循环相同，用乳酸培养基洗涤细胞，并在每孔1 mL培养基中孵育72小时。
    注意：通过流式细胞术分析心肌细胞标志物cTNT（cardiac troponin T）发现，纯化循环可使细胞培养纯度提高达30%（未展示）。该过程主要减少成纤维细胞和残留的hiPSC污染。尽管尚未确定进行组织生成而不影响产量所需的最低可接受纯度水平，但建议使用纯度至少为85%–90%的细胞培养物。此纯度水平有助于改善心肌细胞的贴附性，增强终末组织的收缩力，并提高实验间的可重复性。
15. 第21天：乳酸纯化完成后，将纯化的心肌细胞置于B27培养基中维持培养直至使用，定期更换培养基（每2-3天一次）。
    注意：使用延迟会降低细胞得率，因为细胞将更难以解离。因此，建议在第二次乳酸纯化完成当天至最多额外一周内使用。

4. 人心脏成纤维细胞分化

注意：为从人诱导多能干细胞（hiPSCs）获得人诱导多能干细胞来源的心脏成纤维细胞（hiPSC-CFs），以下方案基于Zhang等¹⁶所采用的两阶段方法。第一步是在心源性中胚层诱导后，通过重新激活Wnt信号通路获得心外膜细胞（hiPSC-EpiCs）。随后，将hiPSC-EpiCs暴露于血管发育抑制剂和FGF2中，18天内即可获得心脏成纤维细胞。

1. 按照 hiPSC-CMs 分化方案中所述，确保 hiPSC 的维持、收获及接种密度。将 hiPSC 培养于 1:180 MGFr 包被的 12 孔板中以启动分化。
2. 当形成致密的 hiPSC 单层细胞时（第 0 天），加入补充有 5 µM CHIR 的 -INS 培养基（每孔 1.5 mL），作用 48 小时。
   注意：为实现高效的中胚层诱导，需针对每种 hiPSC 细胞系滴定 CHIR 的浓度。
3. 第 2 天：吸弃培养基，用 RPMI 洗涤细胞，然后更换为 1.5 mL 新鲜的 -INS 培养基，继续培养 24 小时。
   注意：与 hiPSC-CMs 方案相同，在每次换液时均应冲洗细胞；根据各步骤要求，使用相应的未添加补充物的基础培养基。
4. 第 3 天：用含 5 µM C59（Wnt 抑制剂）的 -INS 培养基孵育细胞 48 小时（每孔 1.5 mL）。
5. 第 5 天：为重铺心脏中胚层细胞，先用 EDTA/PBS 洗涤，再加入 TrypLE 在 37 °C 孵育 5 分钟（每孔 0.5 mL）以解离细胞。将细胞收集至每孔 0.5 mL 的 Advance DMEM 基础培养基（ADMEM）中，在室温下以 300 × g 离心 5 分钟。
6. 以 20,000 个细胞/cm² 的密度接种于 1:180 MGFr 预包被的 12 孔板中（每孔 1 mL）。重铺时使用含 5 µM CHIR、2 µM 视黄酸、10% KSR（v/v）和 10 µM Y27 的 ADMEM 培养基。
7. 第 6 天：重铺后 24 小时，更换培养基以去除 Y27，并将 KSR 浓度降低至 2%。维持相同的 CHIR 和视黄酸浓度，再继续培养 48 小时，以促进心外膜表型的发育。
8. 第 8 天：使用添加 2% KSR 的 ADMEM 培养基继续培养 72 小时，以促进心外膜单层细胞的形成。
   注意：hiPSC-EpiCs 呈扁平或立方状的大细胞，聚集成单个克隆。在此时间点，首次进行分化时，可通过流式细胞术（FACS）或免疫荧光染色（IF）检测典型的心外膜细胞标志物，如 WT1（核抗原）、ZO1（胞膜抗原）和 TCF21（胞质抗原）（未展示）。
9. 第 11 天：为重铺心外膜细胞，先用 EDTA/PBS 洗涤，再加入 TrypLE 在 37 °C 孵育 5 分钟（每孔 0.5 mL）以解离 hiPSC-EpiCs。将细胞收集至 FGM3 培养基中（每孔 0.5 mL），在室温下以 300 × g 离心 5 分钟。
10. 将 hiPSC-EpiCs 以 10,000 个细胞/cm² 的密度重铺于 0.1% 明胶包被的 12 孔板中。使用含 10 µM SB（TGFß1 信号通路抑制剂，用于防止成肌纤维细胞转化，通常在塑料培养皿中发生）和 10 µM Y27（仅在最初 24 小时内添加）的 FGM3 培养基。
11. 次日起，每隔两天更换一次成纤维细胞培养基（FGM3 + 10 µM SB），直至获得 hiPSC-CFs，整个过程共约 18 天。
    注意：hiPSC-CFs 应呈现纺锤形形态。此时应通过流式细胞术和免疫荧光技术检测成纤维细胞标志物 DDR2 的表达（见步骤 7.1–7.2）。
12. 当 hiPSC-CFs 培养达到汇合状态后，在明胶预包被的 T75 或 T175 培养瓶中进行 1:3 传代。细胞大约在 4–6 天内达到 90% 汇合。解离 hiPSC-CFs 时，采用与 hiPSC-EpiCs 重铺时相同的 TrypLE 收获方案；此处传代无需添加 Y27。
13. 将 hiPSC-CFs 维持在含 10 µM SB 的 FGM3 培养基中，直至使用或在低代次时以每冻存管 100 万至 300 万个细胞的密度冻存。
    注意：建议在解冻新细胞前，hiPSC-CFs 的传代次数不超过 6 代，因为长期在塑料培养瓶中培养会导致细胞逐渐分化为更具收缩性的成肌纤维细胞表型。

5. 熔融电纺直写（MEW）支架的制备

注意：本实验方案使用医用级聚ε-己内酯（PCL）均聚物，通过昆士兰科技大学（QUT）专门为此设计的熔融电纺丝（MEW）打印机来制备纤维支架¹⁰。

1. 准备用于打印的PCL聚合物母液。将PCL颗粒装入连接23 G针头的3 mL塑料鲁尔锁式注射器中，置于80 °C烘箱内熔化2 h。聚合物熔化过程中，轻轻推动活塞以排除气泡。可制备多个注射器，于室温保存，因PCL冷却后会迅速固化。
2. 在打印当天，将注射器放入加热室，并将其连接至加压氮气₂ 供料管。开启MEW设备，将温度调节器设置为80/65 °C（腔室/喷嘴），并保持注射器加热30分钟，以确保聚合物充分熔融。
3. 在注射器下方是收集板，该收集板可通过兼容的（Mach3）软件在XY方向上进行电动移动。通过计算机光标控制移动收集板，直至喷头位于收集板的一侧边缘或任意所需位置，并手动调节加热腔与收集板之间的距离（收集距离）至10 mm（Z平面）。
   注意：该距离必须通过实验测试以获得特定的纤维直径。收集距离越短，纤维越粗，且 反之亦然.
4. 关闭设备门，此时电场电源将自动接通。设置电压为 7 kV 和 N₂ 压力为2巴，以便在打印时能通过23 G针头挤出。
   注意：通过施加高电压，在注射器针尖与收集板（由不锈钢制成）之间形成电势差。随后，在供液压力作用下于喷嘴处积聚的液滴被静电充电，形成泰勒锥，并向收集板方向运动。可通过调节电压和压力来改变最终纤维的尺寸。较高的压力参数会挤出更粗的纤维，需提高电压以稳定纤维。该软件基于计算机数控（CNC）系统，因此支架的几何结构以G代码形式编写并输入程序，由程序控制收集板的X-Y方向移动及其电机的运动速度。因此，在打印最终支架前，建议先以任意G代码进行预打印，作为前序步骤，以获得稳定的射流，从而形成结构清晰、无卷曲或鞭动现象的纤维。为此，应通过每次微调参数进行优化，例如气压调整0.1 bar、电压调整0.1 kV、收集板速度调整至60–100 mm/min，以确保射流呈现泰勒锥行为。
5. 选择设计的 G代码 在软件中打印具有方形图案几何结构的支架。此示例G代码用于打印15层、6 cm × 6 cm的方形网格，孔径为0.5 mm × 0.5 mm的方形孔。
6. 为了精确沉积纤维（即纤维相互重叠），将收集器速度调整至1080 mm/min。
   注意：在每台MEW设备上调节电压、气压、收集器转速和收集器距离等参数，以精确控制纤维直径（µm）。除前述参数的影响外，提高收集器转速可获得更细的纤维，降低转速则产生更粗的纤维。本方案中的参数设置可实现直径为10–15微米的纤维打印。
7. 按压 开始 单击软件中的按钮开始打印。打印完成后，小心地将支架从收集器上取下。
   注意：为便于打印后对支架进行操作，建议将支架打印在一块大于支架尺寸的玻璃片上，并用胶带将其固定在收集基座上。
8. 使用直径为6 mm的打孔器将打印好的网格切割成最终用于组织制造的支架。
9. 由于PCL膜具有高度疏水性，用O₂等离子体处理5分钟₂/氩等离子体处理以增加其亲水性，并促进与纤维蛋白和细胞的相互作用。
   注意：可选地，也可使用 0.1 N NaOH 处理 15 分钟，随后进行多次 PBS 洗涤。
10. 将网片浸入70%乙醇中消毒30分钟，用无菌蒸馏水充分洗涤30分钟，然后晾干。
    注意：此操作应在无菌培养皿中并在无菌操作台内进行。避免网片完全干燥，直至使用前，以防止其黏附于培养板并导致变形。

6. 纤维蛋白微型组织的生成与维持

注意：人源心肌三维微组织的制备依赖于将hiPSC来源的心脏细胞包埋于纤维蛋白水凝胶中，并结合微尺度电纺丝（MEW）支架以提供纤维状支撑。以下实验方案改编自Breckwoldt等¹⁷和Ronaldson-Bouchard等¹⁸所采用的工程化设计方法。

1. 按照上述 hiPSC-CMs 分化方案中的重铺板步骤（3.10–3.11）用 TrypLE 消化法分离 hiPSC-CMs。将细胞沉淀重悬于组织生成培养基（Tissue Generation Medium）中，并使用血细胞计数板（Neubauer Chamber）进行细胞计数。
2. 使用 TrypLE 按照 hiPSC-CMs 收获步骤的方法分离 hiPSC-CFs。T75 培养瓶使用 3 mL TrypLE，T175 培养瓶使用 5 mL TrypLE，灭活 TrypLE 时也使用相同体积。最后将细胞沉淀重悬于组织生成培养基中，与心肌细胞（CMs）相同，因为两者将在同一培养基中混合并共培养。
3. 使用血细胞计数板（Neubauer Chamber）对细胞进行计数，并计算接种所有组织所需的细胞总数。
   注：本方案每份组织使用 100 万个细胞，其中 80% 为心肌细胞（CMs），20% 为成纤维细胞（CFs），即 800,000 个 CMs 和 200,000 个 CFs。随着操作熟练，也可尝试每份组织使用 150 万或 300 万个细胞的总量。
4. 将所需总量的细胞转移至新离心管中（Cell Mix），在室温下以 300 × g 离心 5 分钟，形成细胞沉淀。确保沉淀完全干燥，并在接种前保持在冰上。计算接种所有组织所需的水凝胶总体积。
   注：本方案每份组织需要 35 µL 水凝胶（适用于直径为 6 mm 的支架），最终细胞密度接近 3000 万个细胞/mL，但如上文步骤 6.4 所述，该体积也可适当增加。每份纤维蛋白水凝胶由 6 mg/mL 纤维蛋白原、5 U/mL 凝血酶以及组织生成培养基组成，细胞将被重悬于其中。对于 35 µL 水凝胶，纤维蛋白原与凝血酶的体积比为 1.05 µL / 1.8 µL。 建议额外增加 10% 的终体积，以避免因移液误差导致体积损失。示例：若制备 10 份组织，则总终体积应为 350 µL + 10%，即 385 µL。
5. 将 Cell Mix 重悬于所需体积的组织生成培养基中，轻柔混匀，避免产生气泡。
   注：对于 10 份组织，将 1000 万个细胞（80 CMs : 20 CFs）重悬于 374.5 µL 组织生成培养基中（即水凝胶总体积减去所有组织所需纤维蛋白原总量 10.5 µL）。
6. 加入所需体积的纤维蛋白原，轻柔混匀。对于 10 份组织，向 Cell Mix 中加入 10.5 µL 纤维蛋白原，形成 Hydrogel Mix，并在室温下保存。
   注：必须避免反复吹打，以防剪切力影响 hiPSC-CMs 的存活率。建议使用无菌手术刀片切去移液枪头尖端一小段，再用该枪头重悬 Hydrogel Mix，以减少剪切损伤。
7. 为防止纤维蛋白粘附于培养板，应在聚四氟乙烯（PTFE）表面接种 Hydrogel Mix。每份组织取一半体积（17.5 µL）以液滴形式点样，并依次完成所有组织的点样。
   注：每次制备组织数量不宜超过 10 份，以免液滴干燥。
8. 将 PCL 支架置于每个液滴上方，再加入剩余体积（17.5 µL），确保支架完全浸没。
   注：由于反应迅速，建议双手配合操作。每次处理一份组织。
9. 用非惯用手加入所需量的凝血酶（1.8 µL），并立即用惯用手快速混匀水凝胶（至少吹打 2–3 次）。
   注：建议吹打体积略小于总体积（如 30 µL），以避免产生气泡。若形成气泡，应迅速用针尖刺破。
10. 对每份组织重复上一步操作。
    注：建议在无细胞条件下反复练习该技术，直至熟练掌握操作手法。
11. 将组织置于 37 °C 培养箱中孵育 1 小时，以完成纤维蛋白的聚合。
12. 用无菌镊子轻轻夹住每份组织边缘，将其转移至 12 孔板中，每孔加入 2 mL 含 33 µg/mL 抑肽酶（aprotinin）的组织生成培养基，每孔放置一份组织。
    注：切勿夹取水凝胶中心区域，以免机械力损伤细胞。必要时可使用刮铲辅助转移。
13. 将组织在 37 °C 下继续孵育 24 小时。
    注：自组织制备当天起，组织培养基中必须持续含有抑肽酶（aprotinin）。研究发现，若在最初 24 小时内省略抑肽酶，即使后续补加，也会导致部分细胞从支架和水凝胶中脱落，从而影响细胞在支架上的完整覆盖，破坏最终组织的结构完整性。
14. 次日更换为 2 mL 组织维持培养基（Tissue Maintenance Medium），去除 KSR 和 Y27 残留物。此后每隔一天更换一次培养基。

7. hiPSC 心脏分化潜能及微型组织功能的系统性分析

1. 流式细胞术分析
   注意：使用以下方法对细胞进行分析 "荧光激活细胞分选" （流式细胞术，FACS）检测模式以确定 hiPSC 分化效率。所有步骤均在室温条件下进行。
   1. 将细胞培养物解离为单细胞悬液（使用TrypLE消化），分别处理hiPSC-CMs和CFs。
   2. 将沉淀重悬于FACS缓冲液中，调整细胞密度至250,000个细胞/mL，每管分装至少1 mL。于室温孵育30分钟，以避免非特异性抗体结合。
   3. 300 x g 离心细胞 g 室温下放置5分钟，弃去上清液。
      注意：所有离心步骤均在以下条件下进行。
   4. 为了检测细胞内抗原，使用细胞通透试剂盒固定并通透细胞膜。首先，将细胞与试剂A（固定剂）孵育30分钟，然后离心（同步骤7.1.3）。
   5. 然后，将细胞与Reactive B (Perm)及一抗在每管100 µL体积下共同孵育30分钟。
      1. 对于hiPSC-CMs，使用小鼠cTNT抗体（心肌肌钙蛋白T，心肌细胞标志物），稀释比例为1/200。对于hiPSC-CFs，使用小鼠DDR2抗体（胶原受体，成纤维细胞标志物），稀释比例为1/500。
         注意：为终止所有反应，在离心前向每根试管中加入 1 mL FACS 缓冲液。
   6. 在FACS缓冲液中以1:100稀释的抗小鼠Alexa Fluor 488二抗中孵育15分钟。
   7. 用 PBS 洗涤 3 次，每次洗涤之间进行离心（离心条件同步骤 7.1.3），最后将细胞沉淀重悬于 400 µL PBS 中。使用流式细胞仪或类似设备进行分析。
2. 免疫荧光染色分析（IF）
   1. 对于二维心脏细胞培养，将两种细胞类型分别接种于经1:80 MGFr或0.1%明胶预包被的载玻片式培养腔室中。接种密度约为80,000个细胞/cm²。² 以达到分析所需的细胞融合度。对于三维微型组织，用镊子轻轻将其转移至2 mL微量离心管中。
   2. 弃去细胞培养基，用 PBS 洗涤细胞或组织两次。在室温下用 10% 甲醛（v/v）固定样本：载玻片腔室固定 15 分钟，微型组织固定 1 小时。
      警告：甲醛在吸入时具有危害性，必须在通风橱中操作。
   3. 弃去固定缓冲液，用 PBS 洗涤 5 分钟，重复三次。将样品置于 PBS 中，于 4 °C 保存备用。
   4. 为透化细胞膜，将细胞在室温下用0.1% Triton X-100（v/v）孵育10分钟，或将3D组织在室温下用1% Tween-20孵育15分钟。随后用PBS洗涤5分钟，重复三次。
   5. 为减少非特异性抗体结合，用3%（v/v）牛血清白蛋白（BSA）溶液在室温下处理样本30分钟。
   6. 在含1% BSA的PBS中配制一抗溶液，以阻断非特异性结合，并于4 °C孵育过夜。
      1. 对于二维 hiPSC-CMs，使用 1/400 稀释度的抗心肌 α-ACTN（肌节肌动蛋白）小鼠抗体；对于二维 hiPSC-CFs，使用 1/500 稀释度的抗 DDR2 小鼠抗体；对于三维组织，联合使用上述针对 CM 和 CF 的特异性抗体。
   7. 第二天，吸除抗体溶液，用 PBS 在室温下洗涤 3 次，每次 5 分钟。
   8. 将二抗（Alexa-Fluor 488 和 Alexa-Fluor 594）按 1/200 稀释，分别在避光条件下室温孵育 1 小时，以识别小鼠和兔的一抗。用 PBS 缓冲液洗涤三次。
   9. 为复染细胞核，将样品置于避光条件下，用1/500稀释的4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）室温孵育20分钟。用PBS洗涤三次，将样品置于4 °C的PBS中保存。
   10. 使用共聚焦显微镜观察样品，采集图像，并使用Fiji等适当软件进行处理。
   11. 对于三维微型组织，需用 PBS 小心地将其转移至两片玻璃盖玻片之间，以实现良好的成像效果。
       注意：建议使用40倍油镜或更高倍数的物镜，以高分辨率获取Z轴层扫图像。
3. 细胞活力分析
   注意：Alamar Blue 检测法（AB）用于测量三维心脏微组织中的细胞代谢活性，该活性与细胞活力直接相关。整个操作过程需在避光和无菌条件下进行。
   1. 在不含酚红的 RPMI 1640 培养基中配制 10% (v/v) AB 溶液（酚红可能干扰比色测定）。
   2. 使用无菌镊子将心脏微组织小心转移至48孔板中。每份组织加入300 µL AB溶液，于37 °C孵育1小时30分钟（孵育时间可根据实验条件优化调整）。
      注意：由于细胞通过代谢酶的作用将刃天青（resazurin）还原，培养基中将产生颜色变化，该变化将在570 nm和600 nm波长下通过分光光度法进行测定。
   3. 为进行测量，将每种组织的100 µL代谢后AB溶液收集至96孔板中，并读取吸光度。
      注意：分析后可通过再次更换为组织维持培养基来继续培养样品。
4. 收缩分析
   注意：心脏类微型组织通常在构建后1-2天内开始自发搏动。
   1. 在光学显微镜下观察组织，手动测量搏动频率（次/分钟）。若同时测量多个组织，每次读数前应保持培养板处于温暖环境。
      注意：随着温度降低，搏动频率也开始下降。
   2. 为进行心脏收缩功能的延伸评估，获取跳动组织的光学显微镜视频。可使用4倍镜以捕获更大的视野，或使用10倍镜从不同组织区域采集。每段视频录制约30秒（至少包含3次搏动）。
   3. 使用至少30帧/秒的帧率，并将视频保存为.AVI格式。
      注意：此处视频已使用为 MATLAB 开发的定制追踪点算法进行分析¹⁰通过该方法，可获取每个视频中收缩速度、收缩最大位移（振幅）以及收缩方向。
   4. 直接在 MATLAB 中运行分析文件夹中视频的算法。程序将自动生成一个结果 Excel 文件，包含每帧的收缩速度、每帧的收缩幅度、收缩角度（方向）及其对应的标准差数值。¹⁰.
   5. 将“每帧收缩速度”乘以相机分辨率（µm/像素）和相机帧率（帧/秒），即可得到收缩速度的最终值（µm/s）。
   6. 将“每帧收缩幅度”乘以相机分辨率（µm/像素），即可得到收缩幅度的最终值（µm）。
      注意：可以使用 MUSCLEMOTION 等软件更深入地分析收缩动力学，相关内容在其他地方已有讨论^19,20成像装置的采集速度必须至少达到每秒60帧，以便进行软件分析。

结果

二维 hiPSC 来源心肌细胞的表征
为了生成多表型的心脏组织，hiPSC-CMs 和 hiPSC-CFs 被独立地进行体外分化和表征。in vitro。通过适当的优化和严格的操作维护，本方案在分化第 9 天可获得超过 80% 的 hiPSC-CMs，形成自发搏动的细胞（图 1A）。此外，通过代谢筛选进行纯化富集，可基本消除非 hiPSC-CMs，使得在第 21 天时培养物中超过 90% 的细胞表达心肌肌钙蛋白（cTNT⁺）（图 1B）。这些具有强搏动能力的单层细胞通过免疫荧光染色显示表达收缩性肌节蛋白 α-辅肌动蛋白（ACTN）（图 1C，D）。

另一方面，该方案的成功依赖于通过中间心外膜状态的诱导来生成心脏特异性成纤维细胞。在此过程中，使用CHIR重新激活Wnt信号通路后，可在第8天从心...

讨论

为了构建能够模拟人心肌天然特性的三维复合心脏微组织模型，必须考虑若干关键因素。这些因素可归纳为三个主要方面：（1）优化用于组织构建的细胞产量与纯度；（2）打印纤维状支架以模拟三维力学微环境；（3）在构建过程中整合纤维蛋白水凝胶。

确保分化过程成功的一些关键步骤包括：通过防止细胞融合度超过90%来维持hiPSCs的多能性特征；在传代时优化hiPSC的稀释比例，以在CM或CF分化开始时达到适当的融合度；并针对每种细胞系精细调整CHIR的浓度，以确保高效的中胚层诱导^4,15。必须确保细胞培养物纯度超过90%，并能够分别生成不同类型的心脏细胞。这有助于形成功能性组织，使每种细胞类型的特定功能得以充分研究，尤其是在用于疾病建模或药理学测试时。为维持高水平的细胞纯度，必须严格在葡萄糖限制性培养基中进行心肌细胞的代谢筛选。另一方面，在获取健康的心脏成纤维细胞时，利用TGF-β通路调控其表型并促使其转化为肌成纤维细胞的能力，为模拟心肌纤维化等病理状态提供了可能，相关内容已在其他文献...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
µ-Slide 8 孔腔室载玻片（IbiTreat）	IBIDI	80826
0.1% 明胶溶液（Embryomax）	Merck Millipore	ES-006-B
10% 甲醛	Sigma Aldrich	HT501128
12 孔板	Costar/Corning	3513
6 孔板	Costar/Corning	3506
高级 DMEM 1x（ADMEM）	Gibco	12491015
牛肺来源抑肽酶	Sigma Aldrich	A1153
B-27 补充剂，含胰岛素（50x）	Life Technologies	A317504044
B27 补充剂，不含胰岛素（50x）	Life Technologies	A1895601
活检打孔器（6 mm 直径）	Medical	BP-60F
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma Aldrich	A9647
CHIR-99021	AXON MEDCHEM	AXON1386
共聚焦激光扫描显微镜	Zeiss	LSM 800
培养瓶 175 cm²	Greiner Bio-One	660175
培养瓶 75 cm²	Falcon	353136
流式细胞仪	Beckman Coulter	CytoFlex
DAPI	Sigma Aldrich	D9542
驴抗小鼠 IgG（H+L）高交叉吸附二抗，Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-21202
驴抗兔 IgG（H+L）高交叉吸附二抗，Alexa Fluor 594	Invitrogen	A-21207
DPBS（无 Mg²⁺、Ca²⁺）	Gibco	A314190094
EDTA 0.5 M，pH 8.0	Life Technologies	AM9260G
ESSENTIAL 8 培养基试剂盒	Life Technologies	A1517001
FGF2（重组人碱性 FGF 154 个氨基酸）	Peprotech	100-18B
牛血浆来源纤维蛋白原	Sigma Aldrich	F8630
成纤维细胞生长培养基 3 试剂盒（FGM3）	PromoCell	C-23130
无血清替代物（KSR）	Life Technologies	10828028
乳酸钠（L-乳酸钠）	Sigma Aldrich	71718
生长因子减少型 Matrigel（MGFR）基底膜基质，无 LDEV	Corning	354230
MEW 23-G 针头	Nordson	7018302
MEW 打印机	QUT，昆士兰科技大学
MEW 注射器	Nordson	7012072
小鼠抗心肌肌钙蛋白 T 单克隆抗体	Invitrogen	MA5-12960
小鼠抗 DDR2 单克隆抗体	Sigma Aldrich	SAB5300116
小鼠抗α-肌动蛋白（肌节型）单克隆抗体	Sigma Aldrich	A7811
青霉素-链霉素	Life Technologies	15140122
聚ε-己内酯（PCL），医用级	Corbion	PURASORB® PC 12
兔抗波形蛋白重组单克隆抗体 [EPR3776] - 细胞骨架标志物	Abcam	Ab29547
视黄酸	Sigma Aldrich	R2625
ROCK 抑制剂 Y-27632（10 mg）	Fisher Scientific	HB2297
RPMI 1640（含 L-谷氨酰胺）	Gibco	21875034
RPMI 1640（无酚红）	Gibco	32404014
RPMI 无葡萄糖	Gibco	11879020
SB431542	SELLECK CHEMICALS	S1067
分光光度计	BMG Labtech	SPECTROstar Nano
凝血酶（人 α 凝血酶，凝血因子 IIa）	Enzyme Research Lab	HT 1002a
吐温 X-100	Sigma Aldrich	T8787
TrypLE Express	Life Technologies	12604021
吐温 20	Sigma Aldrich	P2287
Wnt-C59	AXON MEDCHEM	AXON2287