基于 DNA 张力探针破裂和递送到细胞中的细胞机械型的高通量流式细胞术测量

摘要

该方法测量细胞破裂配体呈递固定化 DNA 双链体的倾向，以报告相对细胞牵引力。破裂的荧光寡核苷酸被输送到细胞中并通过流式细胞术进行分析，记录细胞的机械历史。这允许在细胞机械表型分析的背景下对细胞力的产生进行高通量测量。

摘要

机械力指导许多关键的细胞过程，而细胞机械表型或机械型在许多疾病中被破坏。量化细胞力的最广泛使用的方法是牵引力显微镜，传统上，它通过高分辨率显微镜捕获细胞施加在其周围环境中的力，这些显微镜使细胞变形含有荧光珠的弹性基质、偏转微柱或改变固定分子张力传感器的构象。我们在这里提出了一种高通量方法，使用已建立的 DNA 张力探针测量相对细胞牵引力，并通过流式细胞术进行定量。此方法涉及五个总体步骤，如下所述。首先，表达和纯化与 DNA 连接 HUH 标签融合的高亲和力整合素配体 echistatin;第二种，制备含有报告基因和配体的 DNA 双链探针;第三，探针的表面处理和固定;第四，执行“破裂和交付”张力计系绳实验和流量读数。最后，我们将描述数据分析和实验结果的解释。

引言

机械力引导许多关键的细胞过程，从迁移¹ 到干细胞分化² 到 T 细胞与正确的抗原呈递细胞结合并被激活的能力³。机械变量在疾病中失调，导致细胞的细胞机械表型或机械型存在可测量的差异 ^4,5。机械型是细胞和组织机械性能的总称，可以包括收缩性、迁移、粘附和变形性等参数。细胞或组织刚度是机械型测量的最常见方面，因为它可以在高通量下测量。例如，癌细胞通常比正常细胞更坚硬，而转移细胞通常更顺应 ^6,7。细胞产生的力是在疾病⁸ 中改变的机械型的一个重要方面，因为它探测特定的细胞与环境相互作用。牵引力显微镜是测量细胞力产生的最常用方法，包括将细胞电镀在嵌入荧光珠的可变形弹性基材上或微柱阵列上，并跟踪磁珠运动或后偏转的变化，以计算细胞施加的力。分子张力传感器还用于测量牵引力，并具有对较小大小的力和特定配体-受体对产生的测量力敏感的优势 ^9,10。然而，使用传统的 TFM 和分子张力传感器测量细胞力依赖于高分辨率成像，这限制了测量的吞吐量。

我们最近在细胞机械表型分析的背景下将 DNA 双链张力探针改编为细胞力产生的高通量读数¹¹（图 1）。简而言之，通过“锚”链¹³ 的生物素-中性亲和素化学，将来自广泛使用的张力计系绳 （TGT） 探针¹² 改编的 DNA 双链体固定在 96 孔板的孔中。TGT 双链体的必要断裂力可以通过改变生物素在锚链上的位置来调整，这会改变双链体的几何形状，从而导致低断裂力解开构象（图 2A）或高断裂力剪切构象（图 2B）。锚链包含生物素和荧光淬灭剂，而 DNA 的“配体”链包含荧光探针和识别参与机械感应的细胞表面受体（如整合素）的配体。配体通过使用与配体融合的称为 HUH 标签的 DNA 连接融合标签与 DNA 共价连接（图 3）^14,15。HUH 标签是参与病毒复制和其他过程的小 HUH 核酸内切酶结构域，可识别单链 DNA 的 9 bp 序列/结构，将其划伤，并在带切口的 DNA 的 5' 端形成共价磷酸酪氨酸加合物。

接种在这些探针顶部的细胞与配体结合，并与它们产生的力成比例地破裂一定比例的探针。与其受体结合的荧光配体链随后被递送到细胞中。因此，细胞的机械历史通过其荧光量级记录在感兴趣的细胞中。荧光可以使用流式细胞术进行定量。我们将这种方法称为 Rupture and Deliver-TGTS 或 RAD-TGT。这种方法不仅可以测量荧光，从而测量数千个细胞同时产生的相对力，而且流式细胞术读数提供了按细胞机械型对细胞进行分类的潜力，允许下游组学读数，以及 CRISPR-KO 或药物筛选，这些可能识别改变细胞机械型的基因或药物。

在下面的协议中，我们演示了如何准备和执行 RAD-TGT 实验。我们将重点介绍一种称为 WDV（来自小麦矮秆病毒）的 HUH 的表达和纯化，以单独用作阴性对照并与依希抑素融合，依希抑素是一种配体，它与一个粘附受体家族紧密结合，在细胞和环境之间传递力，称为 RGD 结合整合素，作为实验条件。由此，我们将演示如何制备用于实验的 RAD-TGT。我们将解释如何进行实验以及如何分析结果数据。我们还将通过测量 ROCK 抑制剂如何改变 CHO-K1 细胞中整合素介导的力来强调 RAD-TGT 的应用（图 4）。总而言之，我们希望该协议可以作为机械生物学的入口，无论以前的经验如何;该领域处于起步阶段，所有背景对于进一步理解都是必不可少的。

方案

1. HUH 表达和纯化

1. 用 WDV （± Echistatin） 质粒转化大 肠杆菌 ，每次转化约 1.5 μL ~50 ng/μL 质粒，并在氨苄青霉素琼脂平板上生长。
2. 用单个菌落接种 5 mL LB，并在 37 °C 下生长过夜。
3. 用过夜培养物接种 1 L LB 并生长至 OD₆₀₀ 达到 ~0.8。
4. 将温度降低至 18 °C，用 500 μM 异丙基 β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷 （IPTG） 诱导，并孵育过夜。
5. 通过在 3,750 × g 离心 30 分钟来沉淀细胞。用 40 mL 裂解缓冲液（300 mM NaCl、50 mM Tris pH 7.5、1 mM EDTA）重悬沉淀。
6. 在冰上以 70% 占空比、功率 7 在冰上用 3 x 90 秒超声处理裂解细胞。在 4 °C 下以 24,000 × g 离心 30 分钟，然后将上清液倒入新的 50 mL 管中。
7. 将 Ni-NTA 树脂浆液放入 15 mL 锥形管（1 mL 珠子悬浮液/L 培养物）中，以 700 × g 离心 2 分钟，然后去除上清液。
8. 向树脂中加入 6 mL 水，然后重复步骤 1.7 中的洗涤过程。
9. 用洗涤缓冲液（300 mM NaCl、50 mM Tris [pH 7.5]、1 mM EDTA、20 mM 咪唑）代替水重复洗涤两次。将磁珠重悬于 5 mL 洗涤缓冲液中。
10. 将微珠浆液（步骤 1.9）添加到裂解的细胞（步骤 1.6）中并充分混合。在 4 °C 下旋转裂解的细胞和珠子至少 1 小时。
    注：在本方案的其余部分，切勿让填料变干并收集流经色谱柱的所有样品。
11. 将混合物倒入 20 mL 色谱柱上并收集流出液。用 4 x 25 mL 洗涤缓冲液洗涤色谱柱。
12. 用 1 x 10 mL 洗脱缓冲液（300 mM NaCl、50 mM Tris [pH 7.5]、1 mM EDTA、250 mM 咪唑）洗脱到新的 15 mL 试管中，分别收集早期和晚期洗脱液（早期洗脱为前 1 mL，晚期洗脱为最后 1 mL）。
13. 通过十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS-PAGE） 分析所有收集的级分，以确保在洗脱过程中收集 HUH（参见 补充图 S1）。为获得最佳结果，请加载 4-20% 的凝胶，并在 35 W 和 200 V 下运行 45 分钟。
14. 将洗脱的蛋白质加入透析管中，并在 4 °C 的透析缓冲液（与裂解缓冲液相同）中孵育过夜。 要去除 HIS 标签，在将蛋白质放入透析管中之前，将不含还原剂的 ULP1 直接添加到洗脱的蛋白质中。
15. 第二天早上，按照步骤 1.7-1.9 中的说明制备 Ni-NTA 树脂，并与透析的蛋白质一起孵育。将蛋白质和 Ni-NTA 树脂的混合物倒入色谱柱中，并收集流出液。用 10 mL 透析缓冲液洗涤色谱柱并收集所有流出物。
16. 按照上述设置在 SDS-PAGE 上评估收集的馏分，以确保蛋白质存在，并使用截留分子量为 10 kDa 的 15 mL 超速过滤器浓缩至所需浓度（参见 补充图 S1）。
    注：理想的最终蛋白质浓度在 40 μM 和 100 μM 之间。

2. RAD-TGT 制备

1. 在 10 mM Tris （pH 7.5）、50 mM NaCl 和 1 mM EDTA 的溶液中，以 1.1：1 的摩尔比的锚链（带淬灭剂）与配体链（带荧光团）组装双链体，终浓度为 40 μM 配体链。
2. 通过在 98 °C 下孵育 5 分钟，然后在室温下冷却 1 小时进行退火;避光保存。
   注：小体积样品容易蒸发，难以完全回收。准备比所需更大的体积。
3. 将退火的双链体与终浓度为 10 μM 双链体的 HUH（在退火时使用丰度最低的链的浓度;在本例中为配体链）以 1：2 的摩尔比反应，在含有 1 mM MnCl 2、50 mM HEPES （pH 8）、50 mM NaCl_的溶液中。
4. 将反应物在 37°C 下在热循环仪或避光加热块中孵育 30 分钟。孵育后，从火上移开，使用台式微型离心机旋转现在组装的 TGT。立即将 TGT 铺板或在 4 °C 下避光储存。

3. 表面处理

1. 打开 96 孔玻璃底板后，立即用粘性 PCR 板箔覆盖所有孔，以保留未使用的孔以备后用。使用剃须刀片切掉感兴趣孔（最好是非边缘孔）上的箔片，并将 100 μL 冷 PBS 添加到所需的孔中。
   注：将液体添加到孔中后，不要让孔变干。如果发生干燥，生物分子对表面的非特异性吸附将对数据产生负面影响。在孔中持续保持 100 μL 的超量体积，以防止任何干燥。
2. 向孔中加入 200 μL 冷 PBS，轻轻移液混合 2-5 次，然后去除 200 μL PBS。重复总共 3 次洗涤。
   注：从孔中添加和取出液体时，请将移液器吸头保持在孔边缘 45° 角，以避免干扰表面。对板的所有处理执行此作，除了电镀单元时。
3. 对于实验孔，在 PBS 中制备 0.1 mg/mL 生物素化 BSA 溶液，并将 80 μL 溶液添加到所需孔中。对于对照孔，加入 18.75 μg/mL 纤连蛋白制备相同的溶液，并向相应的孔中加入 80 μL。轻轻移液混合所有使用的孔，将盖子放在板上，并用箔纸盖住。在室温下孵育 1 小时。
4. 从孔中取出 80 μL 体积，然后重复步骤 3.2 清洗孔。按照与步骤 3.3 相同的方式在 PBS 溶液中加入 80 μL 0.1 mg/mL 中性抗生物素蛋白。
5. 孵育后，从孔中取出 80 μL 体积，然后重复步骤 3.2。以与步骤 3.3 类似的方式，将组装的 TGT（RAD-TGT 制备步骤 2）稀释至 PBS 和 80 μL 溶液中至 0.1 μM，并稀释到孔中。用粘性箔纸盖住孔并在 4 °C 的黑暗中储存，或者避光并在室温下孵育 1 小时，然后再进行实验。
   注意：我们建议将步骤 3.5 视为停止点，并等到第二天继续进行实验。

4. RAD-TGT 实验方案

1. 在 TGT 有足够的时间粘附后，用 PBS 洗涤孔（参见步骤 3.2）3 次，然后用无血清培养基洗涤两次。最后一次洗涤后将培养基留在井中。向外围孔中加入 200 μL PBS 以减轻任何边缘效应，并将板转移到 37 °C 培养箱中以预热板。
2. 以 ~80% 汇合度回收目标细胞，并吸出培养基，然后添加并吸出 PBS 以洗涤细胞。加入适量的胰蛋白酶，并将板置于 37 °C 细胞培养箱中，直至细胞解离（~5-10 分钟）。
3. 解离细胞后，将用于维持细胞的原始体积的完全细胞培养基添加到板中，并用血清移液管重悬。将细胞悬液添加到 15 mL 锥形管中。
4. 将细胞以 300 × g 离心 4 分钟，吸出培养基，然后将沉淀重悬于 PBS 中。重复离心和抽吸，然后重悬于 5 mL 无血清培养基中，重复离心和抽吸。将细胞重悬于 ~2 mL 无血清培养基中。
5. 确定重悬细胞的密度并根据需要调整浓度。
   注：我们的目标是每孔接种 ~15,000 个细胞，因此我们将细胞制备为 150,000 个细胞/mL 的浓度，这允许 15,000 个细胞接种 100 μL 重悬细胞。
   1. 可选：如果要测试药物或其他药物的作用，向细胞中加入适当浓度的药物，然后将细胞放回培养箱中。在进行下一步之前，请留出足够的预孵育时间。
6. 从培养箱中取出板（步骤 4.1），并从预热板中的实验孔中取出洗涤液中剩余的培养基体积。用所需的介质洗涤一次。小心地将 100 μL 重悬的细胞移液到所需的孔中。将铺板的细胞转移到培养箱中 90 分钟。
   注：轻轻地将细胞移液到孔的中心，尽量保持移液器垂直。
7. 孵育后，从孔中取出 ~125-170 μL 体积。如果需要，用 200 μL 加热的 PBS 轻轻洗涤细胞。向每个孔中加入 50 μL 胰蛋白酶，然后将板放回培养箱中，直到细胞开始解离（5-10 分钟）。
   注意：确保孔永远不会变干，并且不会发生过胰蛋白酶化。
8. 向孔中加入 160 μL 新鲜制备的流式缓冲液（1 mM EDTA，2% w/v 牛血清白蛋白，溶于冷 PBS 中）。轻轻上下移液以解离细胞，将 196 μL 这种细胞悬液添加到 PCR 管中，然后加入 4 μL 碘化丙啶，然后轻轻混合。制备一份不含碘化丙啶的对照样品，用作活力设门的对照。
9. 将试管放入冰桶中，盖上遮光，然后继续用流式细胞仪测量荧光强度。

5. 数据收集和分析

1. 使用流式细胞仪分析每个样品。目标是每个样品至少收集 2,000 个活单细胞。
   注意：尽量减少尚未分析的样品的光照，并保持在冰上。
2. 收集完所有数据后，将文件传输到所选软件并对细胞进行门控。
   1. 前向散射区 （FSC-A） 与侧向散射区 （SSC-A） 的细胞门控。
   2. 通过 FSC-A 与前向散射高度 （FSC-H） 对细胞群内单细胞的门控。
   3. 通过在步骤 4.8 中制备的无碘化丙啶对照的碘化丙啶面积强度直方图上将垂直门设置为最高值，对来自单重态群体的活细胞进行门控。任何不超过门的事件都是活细胞
   4. 在单细胞的 Cy5 面积 （Cy5-A） 强度的直方图上设置垂直门，以消除由细胞碎片引起的 Cy5-A 通道上的任何非荧光事件。确保此垂直门的值小于分析的未标记细胞，但荧光强度大于 0。
   5. 要分析细胞群，请在每个相应阴性对照的^第 99 个百分位数处设置一个平分门。
   6. 应用与相应实验条件相同强度的门，并收集每种条件下超过阴性对照门的细胞百分比。
      注：通过适当的统计分析，可以直接比较生物学重复之间的百分比;请参阅代表性数据。
3. 使用中位 Cy5 荧光分析数据，将配体-WDV 的中位强度除以单独的 WDV 的中位，并在重复之间比较这些值。

结果

为了证明 RAD-TGT 的实用性和易用性，我们分析了 Rho 激酶 （ROCK） 抑制剂对 CHO-K1 细胞机械型的影响。ROCK 通路参与肌动蛋白组织和肌球蛋白激活。先前使用 TGT 的研究表明，ROCK 抑制可减少剪切 TGT 的破裂 16,17,18。剪切力或高力 TGT 报告通过黏着斑施加的收缩力，而解拉链或低力 TGT 对参与初始粘附、细胞扩散和黏着斑形成初始步骤的较低细胞力敏感。因此，我们预计 Y-27632 处理将相对于载体对照降低剪切构象中的 RAD-TGT 荧光信号，而解压缩 TGT 的影响较小，正如我们之前观察到的肌球蛋白 II 抑制剂 blebbistatin¹¹ 一样。

RAD-TGT 孔以解压缩和剪切 TGT 配置设置，并单独与 WDV（阴性对照）和 WDV-Echistatin 相连。将 Y-27632 处理或载体处理...

讨论

我们提供了有关如何设置和执行 RAD-TGT 实验的方案，旨在鼓励生命科学领域的科学家将机械分型纳入其工作流程。RAD-TGT 的一个关键优势，特别是对于具有蛋白质生产能力的 RAD-TGT 来说，是使用 HUH 核酸内切酶以高保真度将配体连接到 DNA 双链体上，而无需任何化学交联和/或纯化。HUH 核酸内切酶包含一个核酸酶家族，它们以位点特异性方式与单链 DNA 结合。HUH 特别有趣，因为在结合后，它们会切割 DNA 骨架并与新暴露的 5' 末端形成共价加合物。这些反应非常迅速，可以在几分钟内完成。由于其体积小且机制简单，HUH 可以附着在许多蛋白质的末端，并且原始蛋白质和 HUH 都保留了功能。我们利用这一点将我们感兴趣的配体快速偶联到双链体，从而在一步反应中组装张力计系绳。应该注意的是，由于 HUH 作为融合伴侣的适应性，人们可以尝试与其他配体产生融合，以研究 RGD 结合整合素之外的机械力。在表达和纯化此处描述的构建体或替代 HUH 配体融合时可能会遇到挑战。尽管我们已经看到纯化 HUH 配体的成功，但必须通过 SDS-PAGE 分析纯化过程的每个步骤，以确...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
15 mL 锥形管	Sarstedt	62.554.205
96 孔玻璃底板	Cellvis	P96-1.5H-N
粘性 PCR 板箔	Thermo Fisher Scientific	AB-0626
氨苄青霉素	Apex Bioresearch 产品	25-530
Bio-Rad 20 mL 色谱柱	Bio-Rad	7321010
生物素化 BSA	Thermo Fisher Scientific	29130
BL21 （DE3） 感受态 E. coli	New England Biolabs	C2527H
牛血清白蛋白	Thermo Fisher Scientific	BP9703100
细胞培养箱	Thermo FisherScientific	51030284
离心机	Thermo Fisher Scientific	75009521
CHO-K1	ATCC	CCL-61
透析管	Thermo Fisher Scientific	PI88242
DMSO	Thermo Fisher Scientific	D12345
EDTA	Thermo Fisher Scientific	S311-100
Flow流式细胞仪	BD	Accuri C6 Plus
FlowJo	BD	FlowJo v10.10
HEPES	Thermo Fisher Scientific	BP310-1
咪唑	Thermo Fisher Scientific	O3196-500
IPTG	IBI Scientific	IB02125
LB 琼脂	Fisher Scientific	BP1425-500
配体支架	集成 DNA 技术	用户设计的寡核苷酸	GCT ATA AAC TCA CCG TAA TTT GGC CCG CAG CGA CCA CCC TTT /3Cy5Sp/
溶原肉汤 （LB）	Thermo Fisher Scientific	BP1426-500
MnCl2	Thermo Fisher Scientific	M87-100
NaCl	Fisher Scientific	BP358-212
中性亲和素蛋白	Thermo Fisher Scientific	31000
镍-NTA树脂	Thermo Fisher Scientific	88222
PBS	Corning	21-031-CV
培养皿	VWR	25384-342
碘化丙啶溶液	Cayman Chemicals	10008351
SDS-PAGE 凝胶	Bio-Rad	4561096
无血清培养基	Thermo Fisher Scientific	A4124801	Gibco Optimem 二手替代无血清培养基也可以使用
剪切锚链	集成 DNA 技术	用户设计的 oligo	/5IAbRQ//iBiodT/G GGT GGT CGC TGC GGG
CC 超声仪	Thermo Fisher Scientific	15-345-139
热循环仪	Bio-Rad	1861096
Tris	Thermo Fisher Scientific	BP152-500
Trypin	Thermo Fisher Scientific	12605036
超离心过滤器，10 kDa 截留	Amikon
解压缩锚链	集成 DNA 技术	用户设计的寡核苷酸	/5IAbRQ/GG GTG GTC GCT GCG GGC C/3生物/
WDV 质粒	AddGene	226983
WDV-Echistatin 质粒	AddGene	226985
Y-27632	Selleck Chemicals	S1049	在 DMSO 中复溶