基于DNA张力探针破裂及递送入细胞的高通量流式细胞术细胞机械表型检测

摘要

该方法通过检测细胞断裂固定化配体呈递DNA双链的倾向性，以报告细胞相对牵引力。断裂的荧光寡核苷酸被递送至细胞内，并通过流式细胞术进行分析，记录细胞的力学历史。该技术可实现细胞力生成的高通量测量，适用于细胞力学表型分析。

摘要

机械力调控许多关键的细胞过程，而细胞的力学表型（即机械表型）在多种疾病中会发生异常。目前最广泛用于量化细胞力的方法是牵引力显微镜技术，该技术传统上通过高分辨率显微镜观察细胞对含有荧光微球的弹性基底施加形变、使微柱发生偏转，或改变固定化分子张力传感器构象，从而捕捉细胞对其周围环境施加的力。本文介绍一种基于已建立的DNA张力探针并结合流式细胞术进行定量的高通量方法，用于测量相对细胞牵引力。该方法包含以下五个主要步骤：第一，表达并纯化与DNA连接用HUH标签融合的高亲和力整合素配体——蛇毒解离素（echistatin）；第二，制备包含报告分子和配体的DNA双链探针；第三，表面处理及探针的固定化；第四，执行“破裂与递送”张力阈值拴系实验并获取流式信号读出结果；最后，我们将描述实验数据的分析与结果解读。

引言

机械力调控着许多关键的细胞过程，从细胞迁移¹到干细胞分化²，再到T细胞识别并被正确的抗原呈递细胞激活的能力³。在疾病状态下，机械相关变量会发生失调，导致细胞机械表型（即“机械型”，mechanotype）出现可测量的变化^4,5。机械型是一个涵盖性术语，指细胞和组织的机械特性，可包括收缩性、迁移能力、黏附性和变形性等参数。其中，细胞或组织的刚度是最常被测量的机械型指标，因其适用于高通量检测。例如，癌细胞通常比正常细胞更刚硬，而转移性癌细胞则往往更具顺应性^6,7。细胞产生的力是机械型中在疾病中常发生改变的重要方面，因为它反映了细胞与微环境之间的特定相互作用⁸。牵引力显微镜技术（traction force microscopy, TFM）是测量细胞发力最常用的方法，其原理是将细胞接种在嵌有荧光微球的可变形弹性基质上，或微柱阵列上，通过追踪微球位移或微柱偏转来计算细胞施加的力。分子张力传感器也可用于测量牵引力，其优势在于对微小力更敏感，并能检测特定配体-受体对所产生的力⁹

方案

1. HUH 的表达与纯化

1. 将约 1.5 µL 浓度为 ~50 ng/µL 的 WDV（± 蛇毒抑素）质粒转化至大肠杆菌（Escherichia coli）中，并在含氨苄青霉素的琼脂平板上培养。
2. 挑取单菌落接种于 5 mL LB 培养基中，37 °C 过夜培养。
3. 将过夜培养物接种至 1 L LB 培养基中，培养至 OD₆₀₀ 达到约 0.8。
4. 将温度降至 18 °C，加入 500 µM 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达，并继续孵育过夜。
5. 在 3,750 × g 条件下离心 30 分钟收集菌体，用 40 mL 裂解缓冲液（300 mM NaCl，50 mM Tris pH 7.5，1 mM EDTA）重悬菌体沉淀。
6. 在冰上以 70% 占空比、功率 7 进行 3 次、每次 90 秒的超声破碎裂解细胞；在 4 °C 条件下于 24,000 × g 离心 30 分钟，将上清液转移至新的 50 mL 离心管中。
7. 取 Ni-NTA 树脂悬液加入 15 mL 圆锥形离心管中（每升培养物使用 1 mL 树脂悬液），在 700 × g 条件下离心 2 分钟后弃去上清液。
8. 向树脂中加入 6 mL 水，并重复步骤 1.7 的洗涤过程。
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结果

为了展示 RAD-TGT 的实用性和操作简便性，我们分析了 Rho 激酶（ROCK）抑制剂对 CHO-K1 细胞力学表型的影响。ROCK 信号通路参与肌动蛋白的组织和肌球蛋白的激活。以往使用 TGT 的研究表明，抑制 ROCK 会降低剪切型 TGT 的断裂频率^16,17,18。剪切型或高力 TGT 可报告通过黏着斑施加的收缩力，而解旋型或低力 TGT 则对细胞初始黏附、铺展以及黏着斑形成初期所涉及的较弱细胞力更为敏感。因此，我们预期 Y-27632 处理会相对于溶剂对照组降低 RAD-TGT 在剪切构型中的荧光信号，而对解旋型 TGT 的影响较小，这与我们先前使用肌球蛋白 II 抑制剂 blebbistatin 所观察到的结果一致¹¹。

在解旋和剪切两种TGT构型中均设置了RAD-TGT孔，并分别仅连接WDV（阴性对照）以及WDV-Echistati.......

讨论

我们提供了关于如何建立并开展RAD-TGT实验的方案，旨在鼓励生命科学领域的科研人员将机械表型分析整合到其研究流程中。RAD-TGT的一项关键优势在于，特别是对于具备蛋白质生产能力的研究者而言，可利用HUH内切酶以高保真度将配体连接至DNA双链，且无需任何化学交联和/或纯化步骤。HUH内切酶是一类能够以位点特异性方式结合单链DNA的核酸酶家族。HUH酶尤其引人关注，因为在其结合后，可切割DNA骨架，并与新暴露的5'端形成共价加合物。这些反应迅速，可在数分钟内完成。由于其分子量小且作用机制简单，HUH可被连接至多种蛋白质的末端，且原始蛋白质与HUH部分均可保持功能。我们已利用这一特性，将目标配体快速连接至DNA双链，从而通过一步反应组装出张力传感器拴系结构。需要注意的是，由于HUH易于作为融合伴侣，研究者可尝试将其与其他配体构建融合蛋白，以研究RGD-整合素结合体系以外的力学作用。在表达和纯化本文所述构建体或其他HUH-配体融合蛋白时，可能会遇到挑战。尽管我们已成功纯化出HUH-配体融合蛋白，但仍必须通过SDS-PAGE对纯化过程的每一步进行分析，以确保目标蛋白得到正确表达与分离。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
15 mL 圆锥形离心管	Sarstedt	62.554.205
96 孔玻璃底培养板	Cellvis	P96-1.5H-N
粘性 PCR 板封膜	Thermo Fisher Scientific	AB-0626
氨苄青霉素	Apex Bioresearch Products	25-530
Bio-Rad 20 mL 层析柱	Bio-Rad	7321010
生物素标记的牛血清白蛋白	Thermo Fisher Scientific	29130
BL21 (DE3) 感受态 E. coli	New England Biolabs	C2527H
牛血清白蛋白	Thermo Fisher Scientific	BP9703100
细胞培养孵箱	Thermo Fisher Scientific	51030284
离心机	Thermo Fisher Scientific	75009521
CHO-K1	ATCC	CCL-61
透析袋	Thermo Fisher Scientific	PI88242
DMSO	Thermo Fisher Scientific	D12345
EDTA	Thermo Fisher Scientific	S311-100
流式细胞仪	BD	Accuri C6 Plus
FlowJo	BD	FlowJo v10.10
HEPES	Thermo Fisher Scientific	BP310-1
咪唑	Thermo Fisher Scientific	O3196-500
IPTG	IBI Scientific	IB02125
LB 琼脂	Fisher Scientific	BP1425-500
配体链	Integrated DNA technologies	用户设计的寡核苷酸	GCT ATA AAC TCA CCG TAA TTT TTT GGC CCG CAG CGA CCA CCC TTT /3Cy5Sp/
溶菌肉汤 (LB)	Thermo Fisher Scientific	BP1426-500
MnCl2	Thermo Fisher Scientific	M87-100
NaCl	Thermo Fisher Scientific	BP358-212
NeutrAvidin 蛋白	Thermo Fisher Scientific	31000
镍-NTA 树脂	Thermo Fisher Scientific	88222
PBS	Corning	21-031-CV
培养皿	VWR	25384-342
碘化丙啶溶液	Cayman Chemicals	10008351
SDS-PAGE 凝胶	Bio-Rad	4561096
无血清培养基	Thermo Fisher Scientific	A4124801	使用 Gibco Optimem，其他无血清培养基也可使用
剪切锚定链	Integrated DNA technologies	用户设计的寡核苷酸	/5IAbRQ//iBiodT/G GGT GGT CGC TGC GGG CC
超声破碎仪	Thermo Fisher Scientific	15-345-139
PCR 仪	Bio-Rad	1861096
Tris	Thermo Fisher Scientific	BP152-500
胰蛋白酶	Thermo Fisher Scientific	12605036
超滤离心管，10 kDa 截留分子量	Amikon
解链锚定链	Integrated DNA technologies	用户设计的寡核苷酸	/5IAbRQ/GG GTG GTC GCT GCG GGC C/3Bio/
WDV 质粒	AddGene	226983
WDV-Echistatin 质粒	AddGene	226985
Y-27632	Selleck Chemicals	S1049	用 DMSO 重悬