本方案概述了用于活细胞成像的新鲜获取（第0代）角质形成细胞的培养方法。
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摘要
摘要
在人类皮肤中以单细胞水平追踪干细胞和定向祖细胞的行为一直具有挑战性 体内 和 体外. 活细胞成像技术显著提升了识别角质形成细胞干细胞与定向祖细胞行为差异的能力。活细胞成像是一种不断发展且具有一定挑战性的研究角质形成细胞行为的方法 体外本方案旨在以低接种密度培养角质形成细胞，从而实现相对较长时间的延时摄影，以监测单个细胞的行为。将第0代角质形成细胞以克隆密度培养，通过延时摄影记录单个细胞的分裂过程及其发生时间。为最大程度保证生物学相关性，采用 freshly isolated human keratinocytes 体外该方法侧重于细胞增殖的检测。然而，本实验方案可调整用于其他活细胞成像应用，以测量单个细胞的行为，例如细胞迁移、伤口愈合和细胞运动性。
引言
本实验方案的目的是通过低密度接种和延时摄影技术，实现对培养物中单个角质形成细胞在相对较长时间（数周）内的追踪观察。低密度条件下的活细胞成像使研究者能够直观地观察细胞行为 体外 在单细胞水平上进行研究。与传统的细胞培养不同，活细胞成像技术能够在无需标记的情况下实时构建谱系树，从而获取有关分裂动力学的信息，例如细胞周期持续时间以及克隆中增殖性分裂与分化性分裂的比例。该技术还可用于研究细胞迁移和运动性。该方法在技术上具有挑战性，其具体操作需根据细胞类型及拟采集的数据进行优化。其他实验室已采用新生角质形成细胞和/或传代培养的角质形成细胞，这些细胞更易于培养。1.
然而，经过多次传代的细胞系在行为和形态上与其体内状态存在显著差异2。为了获得最接近体内行为、最大程度反映生物学相关性的结果，通常使用第0代细胞。在角质形成细胞群体中，无需通过分选或标记即可区分干细胞与定向祖细胞，因为二者在分裂行为上存在明显差异，可通过活细胞成像观察到3。
我们利用活细胞成像技术研究角质形成细胞的增殖动力学。类似的方法已被用于研究与角质形成细胞共培养的皮肤黑色素瘤细胞的运动性4、划痕实验中贴壁细胞的迁移5，以及ROCK抑制剂对角质形成细胞增殖的影响6。本实验方案专门设计用于培养细胞，以便通过活细胞成像进行谱系示踪，但也可根据需要调整用于其他目的。
本方案概述了用于活细胞成像的第0代角质形成细胞的分离方法，讨论了可能出现的困难，并提供了可能需要对方案进行调整的注意事项（图1）。
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方案
使用人体组织需获得机构人类研究委员会的批准。用于研究的人体样本通常来自商业渠道（例如 ATCC、Lifeline Cell Technology 和 Zen-Bio）。我们的研究使用手术过程中废弃的组织，或专门为研究目的采集的皮肤活检样本。这些情况需要不同的审批和知情同意程序。所有组织均在获得加州大学旧金山分校（UCSF）人类研究委员会批准后获取，采用书面知情同意，并遵循《赫尔辛基宣言》的原则。
1. 表皮与真皮的分离
- 确保已获得使用人体组织进行研究的适当批准。
- 获取皮肤样本，并使用带冰袋的保温容器运送。将样本置于含有5倍浓度青霉素、链霉素和两性霉素的采集培养基中。
注意：所需数量取决于具体应用。根据我们的经验，每平方厘米约需 1,000,000 个角质形成细胞2 从成人和老年皮肤中获取。然而，每个样本的这一数值可能存在显著差异。- 将新生儿包皮置于细胞培养基中，并在包皮环切术后不超过48小时内开始角质形成细胞分离操作，以尽量减少细胞死亡。组织处理前可于4 °C保存。成人及老年样本的处理通常在采集后数小时内开始。
- 在配备BS2级设备的生物安全柜中进行操作，该设备适用于处理可通过摄入、黏膜或经皮暴露引起疾病的病原体7确保在使用前对生物安全柜进行至少15分钟的紫外线灭菌，并用70%酒精喷洒所有表面。
- 戴上手套，用70%乙醇喷洒收集容器，并将容器放入通风橱中。在组织下方放置冷却垫，以防止组织温度升至室温，保持其完整性。如果组织过大，可切取一部分用于处理，其余部分保持湿润并存放于收集容器中。
注意：由于许多老年患者的手术标本为较大的腹部或乳房皮肤组织，切割和处理组织需要较长时间。组织绝不可直接放置于冷冻台上，因为极低温会导致组织冻结。应将其置于中间表面，例如大理石板上。 - 在生物安全柜中放置两个 100 mm × 15 mm 的培养皿和一把无菌 #23 外科手术刀。
- 打开培养皿，将其放置在柜子表面，使每个培养皿的内表面朝上。向其中一个培养皿中加入10 mL 10%葡萄糖酸氯己定。向另外两个培养皿半片中各加入10 mL Hank's平衡盐溶液（HBSS；5×）中的5×青霉素/链霉素/两性霉素/庆大霉素（见 材料表).
- 为Dispase步骤准备6孔板。对于新生组织，每孔使用3 mL Dispase；对于老化组织样本，每孔使用4 mL。Dispase用量不足会影响组织体积，导致表皮与真皮难以分离。
- 使用手术刀将组织切成更小的片段，以便Dispase更好地渗透。Dispase仅能从组织边缘向内渗透约5 mm，因此应将组织切成宽0.5–1 cm的长条状。若切割尺寸过大，则无法实现表皮与真皮的有效分离。
- 将较厚的组织切成更小的片段。将新生儿包皮切成3至4块（约5 mm × 7 mm）。每孔Dispase中最多使用两个完整的包皮组织。腹部浅表皮瓣通常较薄，皮下组织极少或无，可将其切成较长的条状（约5 mm × 15 mm）。
- 每孔 Dispase 中最多放置四条组织条。若获取的组织附着较多皮下脂肪，应修剪去除皮下组织，以帮助 Dispase 充分渗透组织。若组织切得过小，剥离表皮时可能需要使用解剖显微镜来辨别哪一侧为表皮侧，哪一侧为真皮侧。若撕扯皮肤错误的一侧，可能导致额外的组织损伤。
- 将组织表皮面朝下放入步骤1.6中准备的第一个培养皿中，内含10%葡萄糖酸氯己定，浸泡10-20秒。随后将组织表皮面朝下转移至第二个培养皿中，内含含HBSS的5倍浓度青霉素/链霉素/两性霉素（PSA），振荡10-20秒。再将组织表皮面朝下转移至第三个培养皿中，同样含有含HBSS的5倍浓度PSA，再次振荡10秒。使用同一溶液处理多个样本是可接受的。
- 将组织表皮面朝下转移至第1.7步制备的6孔Dispase培养板中。
注意：按照我们的惯例，建议将表皮面朝下；其他方案则建议将真皮面朝下8并非所有Dispase产品的效果都相同。使用某些产品时，即使浓度达到生产商推荐浓度的4倍，从老化皮肤上剥离表皮仍具有挑战性，这导致了时间和样本的浪费。不同公司使用的Dispase单位未标准化，因此难以确定各品牌之间浓度的具体差异。由于这些困难，建议使用本方案中列出的Dispase品牌之一 材料表 强烈推荐。 - 标记含有 Dispase 和样本的 6 孔板，并转移至 4 °C。将新生儿样本在 Dispase 中于 4 °C 孵育 16–18 小时，成年/老年样本孵育 24 小时。
注意：对于样本，存在一种可选的2小时方案，即将样本置于37 °C的Dispase中孵育2小时，随后剥离表皮。然而，该方法并不总是有效，且孵育后组织完整性可能受损，导致样本丢失。在条件允许的情况下，优先选择过夜孵育。
2. 角质形成细胞的分离
- 在开始下一组步骤前20分钟，将0.05%胰蛋白酶-EDTA（或TrypLE）、胰蛋白酶中和液和角质形成细胞培养基置于37 °C水浴中预热。
- 从4 °C取出一个6孔板，喷洒70%乙醇，并将其放入已准备好的生物安全柜中（见步骤1.3）。
- 将无菌有齿镊和无齿镊放入含有20 mL 70%乙醇的50 mL锥形管中。如果镊子最初在超净台外，放入超净台前需先用70%乙醇喷洒消毒。
- 使用化学灭菌的镊子夹取一块组织，将其表皮面朝上放置于无菌表面（可使用培养皿或6孔板上盖内侧）。用非惯用手持握组织的真皮部分，同时用无齿镊牢固夹住表皮，从边缘到边缘将其完整剥离。表皮应能平滑地以整片形式被剥离。
- 将剥离的表皮放置于15 mL锥形管管口内侧。每个15 mL锥形管最多放置两份包皮组织的表皮。
- 操作应迅速高效；若组织干燥，细胞得率将受到影响。若Dispase未能充分渗透组织，可能导致表皮剥离困难。在此情况下，可尝试拉扯或刮除表皮，但这会导致细胞得率显著降低，不推荐使用。
- 向15 mL锥形管中加入4 mL 0.05%胰蛋白酶-EDTA，盖紧管盖并倒置，确保所有表皮均悬浮于胰蛋白酶溶液中，未粘附于管壁或管盖。将锥形管置于37 °C水浴中孵育10分钟，每2分钟手动轻轻摇晃一次。
注意：胰蛋白酶消化时间超过10分钟可能导致细胞得率降低。此外，若关注细胞表面蛋白的完整性，建议使用TrypLE，因其切割位点更具特异性，对细胞损伤更小，且已被证明与胰蛋白酶-EDTA相比，不会显著降低表面抗原的表达9。此外，水浴箱是常见的污染源，应定期清洁，并使用含aquaguard-2溶液的去离子水定期更换水体。 - 在生物安全柜中放置一个50 mL锥形管。旋开管盖，并在锥形管开口处放置一个100 µm细胞筛网。
- 从水浴中取出含有消化后样本的15 mL锥形管，彻底擦干外壁，并用70%乙醇喷洒消毒后放回生物安全柜。将锥形管在通风橱台面上轻敲3次，然后倒置6次。重复此“敲击-倒置”循环3次。
- 向锥形管中加入6 mL胰蛋白酶中和液，然后将液体通过细胞筛网过滤至步骤2.7中的50 mL锥形管中。
- 用5 mL胰蛋白酶中和液（TNS）冲洗含有样本的15 mL锥形管，冲洗液同样通过细胞筛网滤入50 mL锥形管中。以300 × g离心5分钟。
- 立即从离心机中取出，用移液器吸除上清液，防止细胞随培养基丢失。此时应仅剩细胞沉淀及少量残留液体。对于较小的组织样本，沉淀可能难以观察。
注意：上清液中含有胰蛋白酶，因此应尽可能彻底去除，但需避免损失细胞沉淀。 - 用2 mL角质形成细胞培养基重悬细胞沉淀。
注意：此处有两个关键考虑因素。第一是培养基的选择。本实验推荐使用无血清且不含胶原的培养基。传统上，角质形成细胞培养的标准方案为在成纤维细胞饲养层（3T3-J2细胞）上使用DMEM（Dulbecco改良Eagle培养基）+10%胎牛血清（FBS）+Ham's F-12培养基10。然而，随着无血清培养基的发展以及胶原的可获得性，多种其他方案也具备可行性（见讨论部分）11。第二个考虑因素是活细胞成像实验中是否应在培养基中添加抗生素。这取决于成像持续时间及成像系统的使用经验。由于需在共享成像系统上对细胞克隆进行数周的连续观察，尽管抗生素可能对细胞状态产生一定影响，但其使用仍被优先推荐（见讨论部分）。在重悬过程中使用含青霉素、链霉素、两性霉素B和庆大霉素的角质形成细胞培养基，随后在首次换液后切换为仅含青霉素/链霉素的培养基。该方法在长期活细胞成像过程中有效防止了污染。 - 计数细胞后接种至培养板（关于接种密度的选择参见讨论部分）。为确保细胞接种分布均匀，在接种前应将角质形成细胞用最终接种所需的全部培养基重悬。轻轻倒置混匀后，短暂涡旋1–2秒，随即接种。接种后，在培养箱内以十字交叉方式（上下、左右）移动培养板3次。
- 24小时后，将培养板放入活细胞成像系统的培养箱中。以10倍物镜进行活细胞成像，每20分钟采集一次图像。将样本置于与显微镜相连的培养箱中，保持37 °C和5% CO2 的培养环境。
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结果
鉴于本方法中可能存在多个可调控变量，最终导致多种不同的结果，本文概述了常见错误操作及其导致的结果，并提供了典型结果示例及其产生条件。
与任何细胞培养技术一样，存在污染的可能性（补充视频1）。除了严格遵守无菌操作技术外，建议在培养基中使用抗生素，尤其是在进行长期培养时。在未使用抗生素的情况下，将培养的细胞转运至其他地点的成像系统时，曾频繁观察到污染现象。有关使用抗生素的不利影响，请参见讨论部分。
如方案中所述，培养基的选择至关重要。最初使用的是含10%胎牛血清（FBS）的DMEM与Ham's F-12培养基，并以成纤维细胞饲养层为基础。然而，该培养基组合存在一些问题（补充视频2）。最初接种的成纤维细胞密度过高，随着时间推移，成纤维细胞不断扩展，遮蔽了角质形成细胞的视野。降低成纤维细胞的接种密度后，解决了其遮蔽的问题。但此外，角质形成细胞在该条件下似乎比在无血清培养基中更快地发生分化，导致角质形成细胞区域不均一，难以进行谱系示踪分析（补充视频3
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讨论
在此，我们详细介绍了一种用于活细胞成像的人表皮角质形成细胞原代培养方法。该方法改进了现有的细胞培养技术，采用低密度接种与长期培养，以支持成功的活细胞成像研究。此类细胞的解离首选两步酶消化法，该方法已被证实可获得具有3%–4%形成克隆集落能力的角质形成细胞14. 成年与老年角质形成细胞生长 体外 具有挑战性，因为许多样本根本无法生长。
为实现最大化产量以促进生长的目标，多个步骤至关重要。组织采集后应尽快分离细胞。需与外科医生保持直接沟通，标本在从患者体内取出后应立即收集。已有若干建议提出，以确保采用该方法时维持组织完整性：保持组织低温、将组织置于收集培养基中，并高效处理组织。若样本量较小，可考虑合并样本以最大化生长效果 体外始终将试剂预热至少20分钟。使用已验证有效性的分散酶（Dispase），若表皮难以剥离，可考虑将组织切成更小的条段或延长孵育时间。酶消化处理应使用尽可能短的时间，并在孵育后立即中和。离心后应尽快重悬沉淀物。即使完成上述所有步骤，仍需预期部分成人及高龄人源样本可能无法生长，...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作获得了美国退伍军人事务部临床科学研究局优异奖评审项目编号 I01 CX001816 的资助&D（CSRD）服务。本内容不代表美国退伍军人事务部或美国政府的观点。特别感谢T. Richard Parenteau医学博士/哲学博士和Alexandra Charruyer药学博士/哲学博士指导我学习角质形成细胞的培养技术。感谢Merisa Piper医学博士为我们提供用于分离角质形成细胞的样本。最后，感谢Michael Rosenblum医学博士允许我们使用其活细胞成像系统以完成实验。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.05% 胰蛋白酶-EDTA (1X)，100 mL | Gibco | 25300-054 | |
| 100 μm 细胞滤网 | Corning | 352360 | |
| 15 cc Falcon 离心管 | Corning | 352096 | |
| 50 cc 圆底 Falcon 离心管 | Corning | 352070 | |
| 6 孔微孔板 | Corning | 3516 | |
| 70% 试剂级乙醇，4 L | VWR Chemicals | BDH1164-4LP | 也可自行配制 |
| 两性霉素 B，50 mL | Corning | 30-003-CF | 稀释至 5X（50 μg/mL） |
| 分散酶（Dipase），100 mL | Corning | 354235 | 用 HBSS 1:1 稀释，加入 1x 浓度的庆大霉素，过滤除菌 |
| Epilife 培养基，50 mL | Gibco | MEP1500CA | 添加 HKGS，可考虑加入抗生素 |
| 胎牛血清（经热灭活），500 mL | Gibco | A52568-01 | FBS |
| 镊子 | |||
| 庆大霉素，10 mL | Gibco | 15750-060 | 稀释至 50 μg/mL 以获得 5X 溶液 |
| 汉克平衡盐溶液 (1X)，500 mL | Gibco | 14170-112 | (HBSS) |
| HBSS 5X PSAG | 即 HBSS 加入 5X 浓度的青霉素/链霉素/两性霉素/庆大霉素 | ||
| Hibiclens，1 加仑 | Molnlycke | 57591 | 使用去离子 H₂O 稀释至 10% |
| 人角质形成细胞生长添加剂（HKGS），5 mL | Gibco | S-001-5 | 加入 Epilife 培养基中 |
| 青霉素/链霉素溶液，100 mL | Corning | 30-002-Cl | 稀释至 5X（原液为 100X）用于配制 5X PSA；换液时使用 1X |
| 培养皿，100 mm × 15 mm | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| 手术刀片 NO 23 | VWR | 76457-480 | |
| TrypLE | Gibco | 12604021 | 比常规胰蛋白酶更温和的替代品 |
| 胰蛋白酶中和液 | (TNS)，即含 10% FBS 的 HBSS（部分使用者使用较低血清浓度，如 5%） |
参考文献
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