生成用于角质形成细胞活细胞成像的原代培养

摘要

本方案概述了用于活细胞成像的新鲜获取（第0代）角质形成细胞的培养方法。

摘要

在人类皮肤中以单细胞水平追踪干细胞和定向祖细胞的行为一直具有挑战性 体内 和 体外. 活细胞成像技术显著提升了识别角质形成细胞干细胞与定向祖细胞行为差异的能力。活细胞成像是一种不断发展且具有一定挑战性的研究角质形成细胞行为的方法 体外本方案旨在以低接种密度培养角质形成细胞，从而实现相对较长时间的延时摄影，以监测单个细胞的行为。将第0代角质形成细胞以克隆密度培养，通过延时摄影记录单个细胞的分裂过程及其发生时间。为最大程度保证生物学相关性，采用 freshly isolated human keratinocytes 体外该方法侧重于细胞增殖的检测。然而，本实验方案可调整用于其他活细胞成像应用，以测量单个细胞的行为，例如细胞迁移、伤口愈合和细胞运动性。

引言

本实验方案的目的是通过低密度接种和延时摄影技术，实现对培养物中单个角质形成细胞在相对较长时间（数周）内的追踪观察。低密度条件下的活细胞成像使研究者能够直观地观察细胞行为 体外 在单细胞水平上进行研究。与传统的细胞培养不同，活细胞成像技术能够在无需标记的情况下实时构建谱系树，从而获取有关分裂动力学的信息，例如细胞周期持续时间以及克隆中增殖性分裂与分化性分裂的比例。该技术还可用于研究细胞迁移和运动性。该方法在技术上具有挑战性，其具体操作需根据细胞类型及拟采集的数据进行优化。其他实验室已采用新生角质形成细胞和/或传代培养的角质形成细胞，这些细胞更易于培养。¹.

然而，经过多次传代的细胞系在行为和形态上与其体内状态存在显著差异²。为了获得最接近体内行为、最大程度反映生物学相关性的结果，通常使用第0代细胞。在角质形成细胞群体中，无需通过分选或标记即可区分干细胞与定向祖细胞，因为二者在分裂行为上存在明显差异，可通过活细胞成像观察到³。

我们利用活细胞成像技术研究角质形成细胞的增殖动力学。类似的方法已被用于研究与角质形成细胞共培养的皮肤黑色素瘤细胞的运动性⁴、划痕实验中贴壁细胞的迁移

方案

使用人体组织需获得机构人类研究委员会的批准。用于研究的人体样本通常来自商业渠道（例如 ATCC、Lifeline Cell Technology 和 Zen-Bio）。我们的研究使用手术过程中废弃的组织，或专门为研究目的采集的皮肤活检样本。这些情况需要不同的审批和知情同意程序。所有组织均在获得加州大学旧金山分校（UCSF）人类研究委员会批准后获取，采用书面知情同意，并遵循《赫尔辛基宣言》的原则。

1. 表皮与真皮的分离

1. 确保已获得使用人体组织进行研究的适当批准。
2. 获取皮肤样本，并使用带冰袋的保温容器运送。将样本置于含有5倍浓度青霉素、链霉素和两性霉素的采集培养基中。
   注意：所需数量取决于具体应用。根据我们的经验，每平方厘米约需 1,000,000 个角质形成细胞² 从成人和老年皮肤中获取。然而，每个样本的这一数值可能存在显著差异。
   1. 将新生儿包皮置于细胞培养基中，并在包皮环切术后不超过48小时内开始角质形成细胞分离操作，以尽量减少细胞死亡。组织处理前可于4 °C保存。成人及老年样本的处理通常在采集后数小时内开始。
3. 在配备BS2级设备的生物安全柜中进行操作，该设备适用于处理可通过摄入、黏膜或经皮暴露引起疾病的病原体⁷确保在使用前对生物安全柜进行至少1....

结果

鉴于本方法中可能存在多个可调控变量，最终导致多种不同的结果，本文概述了常见错误操作及其导致的结果，并提供了典型结果示例及其产生条件。

与任何细胞培养技术一样，存在污染的可能性（补充视频1）。除了严格遵守无菌操作技术外，建议在培养基中使用抗生素，尤其是在进行长期培养时。在未使用抗生素的情况下，将培养的细胞转运至其他地点的成像系统时，曾频繁观察到污染现象。有关使用抗生素的不利影响，请参见讨论部分。

如方案中所述，培养基的选择至关重要。最初使用的是含10%胎牛血清（FBS）的DMEM与Ham's F-12培养基，并以成纤维细胞饲养层为基础。然而，该培养基组合存在一些问题（补充视频2）。最初接种的成纤维细胞密度过高，随着时间推移，成纤维细胞不断扩展，遮蔽了角质形成细胞的视野。降低成纤维细胞的接种密度后，解决了其遮蔽的问题。但此外，角质形成细胞在该条件下似乎比在无血清培养基中更快地发生分化，导致角质形成细胞区域不均一，难以进行谱系示踪分析（补充视频3

讨论

在此，我们详细介绍了一种用于活细胞成像的人表皮角质形成细胞原代培养方法。该方法改进了现有的细胞培养技术，采用低密度接种与长期培养，以支持成功的活细胞成像研究。此类细胞的解离首选两步酶消化法，该方法已被证实可获得具有3%–4%形成克隆集落能力的角质形成细胞¹⁴. 成年与老年角质形成细胞生长 体外 具有挑战性，因为许多样本根本无法生长。

为实现最大化产量以促进生长的目标，多个步骤至关重要。组织采集后应尽快分离细胞。需与外科医生保持直接沟通，标本在从患者体内取出后应立即收集。已有若干建议提出，以确保采用该方法时维持组织完整性：保持组织低温、将组织置于收集培养基中，并高效处理组织。若样本量较小，可考虑合并样本以最大化生长效果 体外始终将试剂预热至少20分钟。使用已验证有效性的分散酶（Dispase），若表皮难以剥离，可考虑将组织切成更小的条段或延长孵育时间。酶消化处理应使用尽可能短的时间，并在孵育后立即中和。离心后应尽快重悬沉淀物。即使完成上述所有步骤，仍需预期部分成人及高龄人源样本可能无法生长，.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.05% 胰蛋白酶-EDTA (1X)，100 mL	Gibco	25300-054
100 μm 细胞滤网	Corning	352360
15 cc Falcon 离心管	Corning	352096
50 cc 圆底 Falcon 离心管	Corning	352070
6 孔微孔板	Corning	3516
70% 试剂级乙醇，4 L	VWR Chemicals	BDH1164-4LP	也可自行配制
两性霉素 B，50 mL	Corning	30-003-CF	稀释至 5X（50 μg/mL）
分散酶（Dipase），100 mL	Corning	354235	用 HBSS 1:1 稀释，加入 1x 浓度的庆大霉素，过滤除菌
Epilife 培养基，50 mL	Gibco	MEP1500CA	添加 HKGS，可考虑加入抗生素
胎牛血清（经热灭活），500 mL	Gibco	A52568-01	FBS
镊子
庆大霉素，10 mL	Gibco	15750-060	稀释至 50 μg/mL 以获得 5X 溶液
汉克平衡盐溶液 (1X)，500 mL	Gibco	14170-112	(HBSS)
HBSS 5X PSAG			即 HBSS 加入 5X 浓度的青霉素/链霉素/两性霉素/庆大霉素
Hibiclens，1 加仑	Molnlycke	57591	使用去离子 H₂O 稀释至 10%
人角质形成细胞生长添加剂（HKGS），5 mL	Gibco	S-001-5	加入 Epilife 培养基中
青霉素/链霉素溶液，100 mL	Corning	30-002-Cl	稀释至 5X（原液为 100X）用于配制 5X PSA；换液时使用 1X
培养皿，100 mm × 15 mm	Fisher Scientific	FB0875713
手术刀片 NO 23	VWR	76457-480
TrypLE	Gibco	12604021	比常规胰蛋白酶更温和的替代品
胰蛋白酶中和液			(TNS)，即含 10% FBS 的 HBSS（部分使用者使用较低血清浓度，如 5%）